具有改善記憶功效的鳳尾魚美拉德肽及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種具有改善記憶功效的鳳尾魚美拉德膚，及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 現代社會的高速發展帶來了經濟騰飛和生活便利，同時，也給人們帶來了壓力，當 人們長期處在高壓力環境中，會出現記憶衰減或神經性損傷。此外，人類機體的自然老化、 大腦創傷W及大腦退行性疾病同樣也會造成記憶退化。研究表明，記憶的下降或退化與大 腦海馬區病變、神經遞質減少W及突觸病變等有關。此外，發生在中樞神經系統（Central nervoussystem,CN巧的氧化應激和炎癥損傷會隨著年齡的增加而增加，從而導致許多與 年齡相關的神經退行性疾病的產生，如阿爾茨海默病、帕金森病等疾病。其中，阿爾茨海默 病（Alzheimer'SDisease,AD)，又稱老年癡呆癥，W短期記憶障礙為主要臨床表現的進行 性神經病變疾病，是影響中老年人生活質量的隱形殺手。因此，探索和研究具有預防、改善 或治療與記憶相關疾病的功能物質成為了熱點。
[0003] 美拉德反應（MaillardReaction,MR)是食品在熱加工和膽藏過程中自然發生的 幾基和氨基之間的化學反應，賦予熱加工食品W獨特的風味。已有大量研究表明，美拉德反 應產物（MR巧可W提供令人愉悅的風味，而且也有文獻報導其可W提升膚的抗氧化與抗炎 癥作用，而抗氧化與抗炎癥作用對記憶均具有一定的改善效果。因此，美拉德反應是一種潛 在提升改善記憶膚活性的手段之一。
[0004] 海洋魚蛋白質資源豐富，是一種制備生物活性膚的優質蛋白原料。近年來，在利用 海洋魚蛋白制備生物活性膚方面取得了一定的進展，例如利用海洋魚制備具有降血壓、抗 貧血、抗痛風W及補充膠原蛋白等活性的蛋白膚產品。 陽0化]申請號為201110167083X，名稱為深海魚為原料制備具有改善記憶的生物活性 膚的方法"的中國專利公開了W深海魚類為主要原料開發生物活性膚的制備方法，通過采 用限制性酶解、超濾及離子交換樹脂分離純化獲得得記憶改善膚；并通過小鼠實驗表明該 膚具有明顯的改善記憶功效。但該法工藝復雜，需要多步分離純化，難于實現大規模生產。
[0006] 鳳驕，Coiliamystus(linaeus)屬緋形目，瓣科，驕屬，稱為鳳尾魚、肉驕等。其為 沿海中型魚類，棲息于港灣、河口附近。80年代W來年平均產量為1961. 3噸，約占長江口魚 郵類總產量的48. 6%。鳳尾魚肉中含15-20%的蛋白質，其氨基酸組成比較合理，且脂肪含 量低，是一種優質的蛋白質資源。目前我國主要將鳳尾魚制成罐頭出售，產品遠銷東南亞和 歐美等國，深受廣大消費者喜愛，但罐頭產品的附加值較低，沒有最大程度利用運些優質的 海洋蛋白資源。因此，有必要對鳳尾魚進行精深加工，提升其價值。W鳳尾魚為原料，通過 生物可控酶解的方法制備具有改善記憶功效的生物活性膚，對提升鳳尾魚的附加值和拓展 應用領域都具有重大的意義。

【發明內容】

[0007] 本發明的首要目的在于提供一種具有改善記憶功效的鳳尾魚美拉德膚的制備方 法。
[0008] 本發明的另一目的在于提供由上述方法制得的鳳尾魚美拉德膚。
[0009] 本發明的再一目的在于提供上述的鳳尾魚美拉德膚在食品、保健品或藥品中的應 用。
[0010] 本發明的目的通過下述技術方案實現：
[0011] 一種具有改善記憶功效的鳳尾魚美拉德膚的制備方法，包括W下步驟：
[0012] (1)將鳳尾魚去頭去內臟，清凈后絞成肉糜；
[0013] (2)將肉糜與其質量1-3倍的水混合，加入蛋白酶在45-60°C下酶解，酶解6-lOh 后，滅酶、離屯、，所得上清液為鳳尾魚酶解液；
[0014] (3)取鳳尾魚酶解液，按照其中蛋白含量的1.0-3.0% (w/w)添加還原糖，在 90-110°C的條件下反應1-化后取出冷卻，得到鳳尾魚美拉德反應液；真空濃縮、噴霧干燥 后得到鳳尾魚美拉德膚；
[0015] 步驟（2)所述的蛋白酶為木瓜蛋白酶、膜酶或Alcalase2.化中的一種W上，W鳳 尾魚肉糜的質量為計算基準，蛋白酶總添加量為0. 5-1. 0%;
[0016] 步驟（3)所述的還原糖為食品級葡萄糖、木糖或核糖中的一種，優選核糖；
[0017] 步驟（3)所述的真空濃縮，是將鳳尾魚酶解液濃縮至固形物含量30-50%，然后進 行減壓濃縮。
[0018] 由上述方法制得的鳳尾魚美拉德膚可用于制備預防、治療記憶退化的食品、保健 品和藥品。
[0019] 本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：
[0020] (1)本發明首先采用生物酶解技術最大程度釋放鳳尾魚蛋白中的具有改善記憶作 用的蛋白膚，然后通過美拉德反應進一步提升其生物功效。同時，美拉德反應亦可改善酶解 產物的風味，去除海洋產品的魚腥味，產生令人愉悅的香味。
[0021] (2)本發明工藝操作簡單、生產成本低、沒有任何污染、蛋白回收率高，所得改善記 憶膚活性強，風味佳，可廣泛應用于食品領域中。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。 [002引本發明實施例中海洋魚膚與PC12細胞&02損傷保護實驗方法如下：
[0024]PC12細胞是大鼠腎上腺嗜銘細胞瘤細胞株，由上海細胞庫購入。采用Du化ecco's ModifiedEagleMedium培養基培養，其中加入10%胎牛血清（FB巧，1%的青霉素。在5% C〇2濃度，37°C下進行培養。傳代Ξ次后，進行過氧化氨損傷試驗。采用96孔板培養細胞， 細胞濃度在1.5X105細胞/孔。細胞首先與不同濃度的膚樣品進行共同培養12小時后，換 取新鮮的培養基。進而采用過氧化氨損傷化后采用相差顯微鏡觀察細胞形態，并采用MTT 法檢測細胞存活率。 陽0巧]MTT法，又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活 細胞線粒體中的班巧酸脫氨酶能使外源性3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-dipheny Itetrazoliumbromide(MTT)還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瑣（Formazan)并沉積在細 胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞諷（DMS0)能溶解細胞中的甲瑣，用酶聯免疫檢測儀在 490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，Μ?Τ結晶形 成的量與細胞數成正比。 陽0%] 采取250μL(終濃度在0. 5mg/mL)的ΜΤΤ加入到96孔板中，與待測樣品避光共培 養地之后，將96孔板中舊的培養基吸出，加入250μLDMSO溶解甲瑣。采用酶標儀570皿 檢測甲瑣濃度，計算細胞存活率。
[0027]
[0028]其中：
[0029]A實驗為加了樣品和過氧化氨的細胞；
[0030] A對照為只加了相同體積PBS的PC12細胞。
[0031] 本發明實施例中，動物行為學測定方法如下：
[0032] 通過Morris水迷宮法及跳臺觀察多膚產品對東賞窘堿致學習記憶獲得障礙模型 小鼠學習記憶能力的影響。Morris水迷宮是一種常被用于曬齒類動物神經認知疾病模型的 驗證和神經認知治療可行性評估的方法，其優點是能提供大量的實驗參數，較系統全面地 考察實驗動物的空間認知過程，客觀反應動物的認知水平，且能較好地減少感覺和運動功 能障礙對測定的干擾。 陽〇3引受試對象：
[0034]SPF級昆明種小鼠，雌雄各半，20-22g，購自廣州中醫藥大學實驗動物中屯、，合格證 號：SCXK(粵）2008-0020
[0035] 陽性藥物：
[0036] 化拉西坦片：廣東華南藥業集團有限公司，批號121004 ;
[0037] 試驗試劑和儀器：
[003引氨漠酸東賞窘堿注射劑：廣州白云山明興制藥有限公司，批號130401 ;
[0039] 生理鹽水注射劑：江西科倫藥業有限公司，批號D121018E;
[0040] 無水乙醇：天津市富宇精細化工有限公司（分析純），批號GB/T678-2002
[0041] 電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司，型號化204
[0042]XZC-5A型小鼠跳臺儀：山東省醫學科學院設備站，編號0012;
[0043] Morris水迷宮視頻分析系統：上海移數科技有限公司，編號0017625。 W44] 試驗方法： W45] 樣品對東賞窘堿致學習記憶障礙小鼠空間學習和記憶能力的影響（Morris水迷 宮實驗）
[0046]定位航行實驗（placenavigation)
[0047] 定位航行實驗是讓動物通過空間線索學習平臺的位置，實驗進行5天，每天訓練4 次。實驗前一天將小鼠置于水迷宮中自由游泳2min，W熟悉水性。訓練第一天為可見移動 平臺，此間將平臺設高于水面1-2畑1，并在平臺上插入帶紅色小旗子使動物能識別，每訓練 一次將平臺順序移動。第2-5天為固定隱藏平臺期，此時平臺設于SE點，低于水面1-2畑1。 訓練時小鼠從隨機從現象點處面向池壁入水，視頻跟蹤系統記錄其在60s內首次尋找到平 臺并且停留3秒W上的所需時間，記錄為逃避潛伏期（escapelatency)。訓練期間，陽性 對照及給藥各組腹腔注射氨漠酸東賞窘堿注射液1.Omg/kg，模型和正常組給予等量生理鹽 水，30min后入水訓練，連續5天。 柳4引 空間探索實驗（probetest)
[0049] 用于測試動物的學習記憶能力，定位航行實驗結束次日開始，此期間撤掉水池中 的安全平臺。給藥第15天起，小鼠從測試點放入水池中，測定其60s內在平臺象限的游泳 時間。末次給藥比后，小鼠放入水中游泳，計算機定位跟蹤系統記錄小鼠60s內游泳軌跡。
[0050] 樣