檢測miR-129-2甲基化的試劑在制備檢測肺癌試劑盒中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于分子診斷領域，提供了檢測miR-129-2甲基化的試劑在制備檢測肺癌試劑盒中的應用。具體的說，本發明提供了序列為SEQ?ID?NO：1-4的引物在制備檢測肺癌試劑盒中的應用。此外，本發明還提供了使用Touchdown-PCR非診斷檢測miR-129-2甲基化的方法。
【專利說明】檢測miR-129-2甲基化的試劑在制備檢測肺癌試劑盒中的應用

【技術領域】
[0001]本發明屬于分子診斷【技術領域】，具體的說，使用引物檢測微小RNA miR-129-2的甲基化以診斷肺癌。

【背景技術】
[0002]微小RNA(microRNA)是一類高度保守的非編碼小RNA分子，其通過在后轉錄水平對目標信使RNA(mRNA)的降解或抑制，達到調芐基因表達的目的。在人體中，微小RNAmiR-129被轉錄為miR-129-l和miR-129-2，分別位于染色體7q32和Ilpll上，已經有文獻報道了 miR-129-2在多種癌癥中表達下調，預測其具有腫瘤抑制作用。
[0003]甲基化是一種基因的表觀遺傳學修飾方式。在哺乳動物中幾乎所有DNA甲基化發生在CpG 二核苷酸序列的5 ^胞嘧啶上。CpG島區域的甲基化與基因轉錄抑制有關。基因啟動子甲基化被認為是一種調節腫瘤細胞中原癌基因活性的表觀遺傳學修飾機制。已經有研究顯示DNA甲基化在微小RNA的調控中有重要作用，如，研究發現在子宮內膜癌中miR-129-2的啟動子區呈高甲基化狀態，當使用藥物去除miR-129-2啟動子甲基化時，S0X4表達下調，腫瘤細胞增長受到抑制(Huang Yff, Liu JC, Deatherage, et al.EpigeneticRepress1n of microRNA-129_2Leads to Overexpress1n of S0X40ncogene inEndometrial Cancer)。
[0004]目前，對于miR-129-2甲基化與癌癥關系的研究主要集中在子宮內膜癌、胃癌、膀胱癌、結直腸癌方面，尚沒有對肺癌組織中miR-129-2甲基化的研究結果發表。


【發明內容】

[0005]針對上述問題， 申請人:使用一對甲基化和一對非甲基化引物以甲基化特異性引物PCR(MSP)檢測了肺癌細胞株和正常樣本中的miR-129-2甲基化情況，發現多個肺癌細胞株中普遍存在miR-129-2甲基化，而正常樣本中并沒有miR-129-2甲基化，由此提供了檢測miR-129-2甲基化以診斷肺癌的方法。此外，針對普通PCR特異性不足的問題， 申請人:提供了使用touch-down PCR方法非診斷檢測miR-129-2甲基化的方法，以用于癌癥發生分子機制的實驗室研究。
[0006]一方面，本發明提供了檢測微小RNA甲基化的試劑在制備檢測癌癥試劑盒中的應用。
[0007]在進一步的方面，該應用中的微小RNA為miR-129-2，癌癥為肺癌。
[0008]在進一步的方面，該應用中檢測微小RNA甲基化的試劑為一組檢測微小RNA甲基化的引物，引物序列為SEQ ID NO: 1-4。
[0009]另一方面，本發明提供了非診斷檢測miR-129-2甲基化程度的方法，其中使用甲基化和非甲基化引物對樣品DNA進行PCR擴增(MSP)，根據擴增結果來判斷miR-129-2甲基化程度。非診斷檢測方法可以是用于科研用途的方法，例如可以非診斷的檢測來自各保藏機構的細胞株樣本，或者醫療機構所收集的研究用細胞/血液樣本，這些樣本的樣本主體已經去世/治愈/去向不明，所以顯然檢測其miR-129-2甲基化程度并不是為了檢測樣本主體的健康狀態而是為了科研。
[0010]在進一步的方面，該方法中甲基化和非甲基化引物的序列為SEQ ID NO:1_4，PCR方法為touch-down PCR方法。
[0011]在進一步的方面，該方法中PCR的具體步驟為:
[0012]20 μ I反應體系:
[0013]I μ I重亞硫酸鹽處理的DNA、250 μΜ正向引物和反向引物、0.75 μ MdNTPs、3.75mM MgCl2、0.625 單位 AmpliTaq GoldDNA 聚合酶(Roche MolecularSystems, Inc., Branchburg, NJ)
[0014]循環參數:
[0015]

【權利要求】
1.檢測微小RNA甲基化的試劑在制備檢測癌癥試劑盒中的應用。
2.權利要求1所述的應用，其中的微小RNA為miR-129-2，癌癥為肺癌。
3.權利要求2所述的應用，其中檢測微小RNA甲基化的試劑為一組檢測微小RNA甲基化的引物，引物序列為SEQ ID NO:1-40
4.檢測miR-129-2甲基化程度的非診斷方法，其中使用甲基化和非甲基化引物對樣品DNA進行PCR擴增(MSP)，根據擴增結果來判斷miR-129-2甲基化程度。
5.權利要求4所述的方法，其中甲基化和非甲基化引物的序列為SEQID NO: 1-4, PCR方法為touch-down PCR方法。
6.權利要求5所述的方法，其中touch-downPCR方法具體為: .20 μ I反應體系: I μ I重亞硫酸鹽處理的DNA、250 μΜ正向引物和反向引物、0.75 μ M dNTPs、.3.75mM MgCl2、0.625 單位 AmpliTaq Gold DNA 聚合酶(Roche MolecularSystems, Inc., Branchburg, NJ) 循環參數: 預變性 95 °C 1min I個循環 TD 程序 95°C 3 0s, 60°C 30s, 72°C 30s 2 個循環 .95°C 30s, 59°C 30s, 72°C 30s 2 個循環 . 95°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s 2 個循環 .95°C 30s, 57°C 30s, 72°C 30s 2 個循環 . 95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 30s 2 個循環 .95°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s 2 個循環 .95°C 30s, 54°C 30s, 72°C 30s 2 個循環 .95°C 30s, 53°C 30s, 72°C 30s 2 個循環 .95°C 30s, 52°C 30s, 72°C 30s 2 個循環 .95°C 30s, 51°C 30s, 72°C 30s 2 個循環 主程序 95°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s 15 個循環 最后延伸72°C 1min I個循環。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164484SQ201410252553
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年6月9日 優先權日:2014年6月9日
【發明者】湯郡, 肖瑩瑩, 李曉霞 申請人:濟南金域醫學檢驗中心有限公司, 廣州金域醫學檢驗中心有限公司