一種利于七次跨膜蛋白ccr5功能性表達的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利于七次跨膜蛋白CCR5功能性表達的方法發明，屬于分子伴侶輔助的無細胞表達方式高效重組表達膜蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]絕大多數膜蛋白在自然組織中的表達量很低，尤其是含有七個疏水跨膜螺旋的膜蛋白，其穩定性和功能受兩親性環境的影響很大，蛋白容易聚集和發生錯誤折疊，從而導致蛋白樣品的有效制備比水溶性蛋白要困難得多。所以，通過大量體外蛋白質再折疊研究來進一步完善包括分子伴侶作用機制在內的膜蛋白折疊理論面臨著非常實際的困難。另一方面，由于細胞內環境和生物膜組成相當復雜，通過體內研究探討膜蛋白折疊過程，確定分子伴侶作用的決定因素也存在相當難度。
[0003]無細胞表達體系是高效的體外蛋白表達技術，該體系中含有蛋白質合成所必需的各種主要組分(如核糖體、酶、氨基酸、各種因子等)。進行無細胞表達時，將構建好的表達質粒加入到該體系中，在適宜溫度下(一般在30-37°C之間)經幾個小時即可實現目標蛋白的高量表達。與傳統的細胞表達體系相比，無細胞表達具有操作簡便、耗時少、體積小、不產生細胞毒性及體系開放等顯著特點。
[0004]但由于無細胞表達體系中缺乏生物膜環境，進行包括七次跨膜在內的膜蛋白表達時，需要通過向反應體系中加入表面活性劑來彌補。這樣，在膜蛋白無細胞表達過程中，隨著新生肽鏈由核糖體中不斷地往外延長，表面活性劑形成的膠束會即時包圍新生肽鏈的跨膜疏水部分，同時也為膜蛋白功能性折疊提供必要的疏水環境；否則，膜蛋白新生肽鏈會很快聚集變性并發生沉降。大量研究表明，在適宜表面活性劑或類脂雙層結構存在下，無細胞體系表達的膜蛋白是溶解的且具有生物活性，從而適合結構和功能研究膜蛋白正確折疊是其發揮生物功能的先決條件，對于膜蛋白折疊機制及關鍵因素的研究，能夠極大地加深對其結構與功能的認識，既是揭示生命基本過程的必要手段，也勢必對相關疾病的治療產生深遠影響，因此具有極其重要的理論和現實意義。
[0005]基于無細胞表達體系開放性的特點，除了表面活性劑，還可以添加配基、分子伴侶等各種物質進行相關研究。這樣，由無細胞表達體系提供溶液環境，通過直接添加分子伴侶，可以系統研究它們在目標膜蛋白新生肽鏈折疊過程中的作用及其機制，從而有效克服上述膜蛋白樣品制備困難以及體內研究所面臨的細胞內環境和磷脂雙分子層復雜等瓶頸因素。
[0006]CCR5是HIV-1侵入宿主細胞的主要輔助受體之一，并且參與介導免疫細胞的趨化作用，在腫瘤的發生和發展過程中也起著重要作用，是極其重要的藥物靶標分子。最近，CCR5三維結構的成功解析將極大地推動相關藥物的開發，同時該突破也更利于針對CCR5開展系列生物物理化學研究。
[0007]文獻檢索結果表明，利用無細胞表達體系，用修飾和標記好的帶6XHis_tag的蛋白基因，添加HSP60和HSP10、Bri j35以及大腸桿菌提取物和氨基酸、甲硫氨酸以及反應緩沖液表達七次跨膜蛋白CCR5的方法鮮有報道。

【發明內容】

[0008]本發明的目的在于克服上述不足，提供了一種新的用無細胞表達體系制備七次跨膜蛋白的方法。
[0009]為了實現上述目的，本發明的技術方案如下。
[0010]—種利于七次跨膜蛋白功能性表達的方法，其特征在于:其步驟如下:
Cl)表達基因的制備:將CCR5的編碼DNA在C端接入6XHis-tagged，并且插入到PIVEX2.3d載體序列中。
[0011](2)七次跨膜蛋白的表達:將步驟(I)得到的載體基因，連同蛋白表達必需的無細胞表達體系:大腸桿菌提取物、反應緩沖液、去甲硫氨酸氨基酸以及甲硫氨酸、T7聚合酶、表面活性劑和分子伴侶混合，按一定體積，置于反應容器中，并在33°C條件下，于恒溫搖床培養3.5h，搖床轉速165rpm。
[0012](3)在步驟(2)反應開始30min后，再加入與步驟(2)等體積的補給緩沖液、氨基酸和甲硫氨酸的混合液，作為養料補充，使其能夠充分表達折疊。
[0013]進一步地，所述步驟(2)中氨基酸:甲硫氨酸=5: 4。
[0014]進一步地，所述步驟(2)中所用反應緩沖液為2.5X，補給緩沖液TL.
[0015]進一步地，所述步驟(2)中的反應恒溫搖床，振蕩轉速為165rpm，反應溫度為33。。。
[0016]進一步地，所述步驟(2)中蛋白反應體系中同時加入分子伴侶濃度是lOOmg/lOOml的HSP60和濃度為50mg/50ml的HSP10，所加入的體積比例為HSP60: HSP10=6: I。
[0017]進一步地，所述步驟(3)中，在蛋白反應30min后，再加入與步驟(2)中等體積的補給溶液和氨基酸和甲硫氨酸。
[0018]進一步地，所述步驟(2)中所使用的表面活性劑為Brij35。
[0019]該發明的有益效果在于:本發明七次跨膜蛋白CCR5表達制備設備和工藝簡單，以無細胞表達體系為載體進行研究，不受細胞生理限制可進行較大量的毒性蛋白表達；產物的活性和溶解性增加；產物不受胞內蛋白酶的降解；反應可以在短時間內進行；無需繁雜的下游處理；適合于高通量表達。通過直接添加不同的分子伴侶及其組合來研究它們在目標七次跨膜蛋白折疊中的作用機制，有效克服了膜蛋白樣品制備困難以及體內研究所面臨的細胞內環境和磷脂雙分子層復雜等瓶頸因素，同時還保持了 CCR5本身的生物活性。
【附圖說明】
圖1、本發明所使用的分子伴侶的結構圖以及所表達的實例七次跨膜蛋白CCR5的結構圖。
[0020]圖2、本發明所表達的實例七次跨膜蛋白CCR5的可溶性表達量和表達分子量條帶表征。
[0021]圖3、本發明所表達的實例七次跨膜蛋白CCR5的生物活性表征。
【具體實施方式】
[0022]下面結合實例對本發明的【具體實施方式】進行描述，以便更好的理解本發明。
[0023]實例:
以10ul反應體系表達七次跨膜蛋白CCR5為例。
[0024]步驟(I)首先是CCR5基因的設計與合成和載體的構建，在CCR5基因的C端插入6XHis-tag序列，使所表達的CCR5新生肽鏈能夠通過免疫沉淀印跡法進行表達量的檢測。
[0025]步驟(2)然后在離心管中，依次加入20ul大腸桿菌提取液，20ul的2.5X反應緩沖液，1.25ul50mM的去甲硫氨酸氨基酸，Iul甲硫氨酸，lulT7聚合酶，1ulBri j35，3ulHSP60，0.5ulHSP10，最后加入4ul修飾的CCR5表達基因。溶液組分配置好后，將離心管置于恒溫搖床中進行蛋白培養表達，培養溫度33°C，搖床轉速165rpm，培養3.5h。
[0026]步驟(3)另取一只離心管，加入25ul的2X補給緩沖液、1.25ul50nM的去甲硫氨酸氨基酸、Iul甲硫氨酸和22.75ul的超純水。
[0027]步驟(4)是在步驟(2)的離心管培養表達30min后，將步驟(3)中所配置的溶液加入到步驟(2)的反應溶液中，繼續在恒溫搖床中培養表達3h，以確保所表達的CCR5有足夠的營養成分以進行表達折疊。
[0028]步驟(5)在步驟(4)表達3h后，將離心管從恒溫搖床中取出，進行蛋白含量的表征，經表征，本方法10ul表達體系所制備的CCR5可溶性含量高達0.9mg0
[0029]以上所述是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種利于七次跨膜蛋白CCR5功能性表達的方法，其特征在于:其步驟如下: (1)表達基因的制備:將CCR5的編碼DNA在C端接入6XHis-tagged，并且插入到PIVEX2.3d載體序列中。 (2)七次跨膜蛋白的表達:將步驟(I)得到的載體基因，連同蛋白表達必需的無細胞表達體系:大腸桿菌提取物、反應緩沖液、去甲硫氨酸氨基酸以及甲硫氨酸、T7聚合酶、表面活性劑和分子伴侶混合，按一定體積，置于反應容器中，并在33°C條件下，于恒溫搖床培養3.5h0 (3)在步驟⑵反應開始30min后，再加入與步驟⑵等體積的補給緩沖液、氨基酸和甲硫氨酸的混合液，作為養料補充，使其能夠充分表達折疊。2.按照權利要求1所述，其特征在于:所述步驟⑴中所使用的蛋白表達DNA為在C端修飾過的，便于后續蛋白產量表征的基因。3.按照權利要求1所述，其特征在于:所述步驟(2)中的氨基酸是去甲硫氨酸的，而甲硫氨酸是按照氨基酸:甲硫氨酸=5: 4的比例添加的。4.按照權利要求1所述，其特征在于:所述步驟(2)中的無細胞表達體系，是由各種蛋白表達所必需的成分按照一定比例構成，而且所用反應緩沖液為2.5X，補給緩沖液TL。5.按照權利要求1所述，其特征在于:所述步驟(2)中的反應恒溫搖床，振蕩轉速為165rpm，反應溫度為33 °C。6.按照權利要求1所述，其特征在于:所述步驟(2)中蛋白反應體系中同時加入了分子伴侶濃度是lOOmg/lOOml的HSP60和濃度為50mg/50ml的HSP10，所加入的體積比例為HSP60: HSPlO = 6: I。7.按照權利要求1所述，其特征在于:所述步驟⑶中，在蛋白反應30min后，再加入與步驟(2)中等體積的補給溶液和氨基酸和甲硫氨酸。8.按照權利要求1所述，其特征在于蛋白表達折疊的時間為3.5h。9.按照權利要求1所述，其特征在于所表達的蛋白為七次跨膜蛋白質。10.按照權利要求1所述，其特征在于所使用的表面活性劑為Brij35。
【專利摘要】本發明涉及一種利于七次跨膜蛋白CCR5功能性表達的方法，其步驟如下：（1）將CCR5外源DNA模版經編碼修飾后，插入到載體上，直接添加到無細胞表達體系中，通過添加DNA轉錄翻譯以及蛋白質表達所必需的氨基酸、能量物質、T7聚合酶和表面活性劑，優化實驗條件，來實現蛋白質的體外表達。（2）由于在步驟（1）表達CCR5時，膜蛋白易產生聚集形成包涵體或者產生錯誤折疊的現象，所以在步驟（1）的同時，加入相對應的分子伴侶，為目標蛋白質的正確折疊提供封閉的疏水環境，使所表達的CCR5能夠充分的正確折疊，并且提高膜蛋白的可溶性表達量。本發明中CCR5制備設備工藝簡單，適合跨膜蛋白質的快速和高通量表達，活性也得到很好得改善。
【IPC分類】C07K14/705
【公開號】CN105198983
【申請號】CN201510574703
【發明人】王小強, 遲海霞, 黃方
【申請人】中國石油大學(華東)
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月11日