一種從杜仲葉中提取京尼平甙酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物技術領域的提取方法，具體說是一種從杜仲葉中提取京尼平甙酸的方法。
【背景技術】
[0002]杜仲(學名Eucommia ulmoides Oliver)，又名膠木，為杜仲科植物。杜仲游離氨基酸極少，含有的少量蛋白質，是和絕大多數食品類似的完全蛋白，即能夠水解檢出對人體必需的8種氨基酸。測定了杜仲所含的15種礦物元素，其中有鋅、銅、鐵等微量元素，及鈣、磷、鉀、鎂等宏量元素。藥用杜仲，即為杜仲科植物杜仲的干燥樹皮，是中國名貴滋補藥材。其味甘，性溫。有補益肝腎、強筋壯骨、調理沖任、固經安胎的功效。可治療腎陽虛引起的腰腿痛或酸軟無力，肝氣虛引起的胞胎不固，陰囊濕癢等癥。在《神農本草經》中被列為上品。現代研究杜仲具有清除體內垃圾，加強人體細胞物質代謝，防止肌肉骨骼老化，平衡人體血壓，分解體內膽固醇，降低體內脂肪，恢復血管彈性，利尿清熱，廣譜抗菌，興奮中樞神經，提高白血球藥理作用。
[0003]京尼平苷酸，又名京尼平甙酸、金尼泊甙酸，英文名稱:Geniposidic acid。來源:茜草科植物龍船花 ixora chinensis Lam.葉和小枝，梔子Gardenia jasminoides Ellis.的果實，傘房花耳草(水線草)Hedyotis corymbosa lam.(Oldenlandi corymbosa L.)，杜仲科杜仲屬植物杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)的皮、葉和雄花。藥理藥效:1.預防性功能降低。2.增強記憶功能(抗健忘)。3.防癌、抗癌作用:日本專家佐佐木教授等人查明，杜仲具有抑制導致癌細胞突然變異的作用。這主要是由于杜仲中含有許多環烯醚萜類化合物。如京尼平甙、京尼平甙酸及甙元等具有此生理活性。京尼平苷酸和京尼平苷可用以防止X射線導致的腫瘤發生，對血液系統的輻射損害起到一定的減輕作用。4.抗氧化、抗衰老等作用:京尼平苷酸能有效促進膠原蛋白合成，防止衰老。5.瀉下及促進膽汁分泌作用。6.降壓作用:環烯醚萜類的京尼平苷酸具有多優良的降低血壓和調節血壓的功效。京尼平苷酸對大鼠心臟有明顯的負性肌力作用、負性變時作用及負性冠狀動脈注率作用。7.抗應激作用。
[0004]京尼平甙酸主要存在于桅子、杜仲等天然植物中。杜仲是我國特有的經濟型樹種，分布區域大、資源豐富，杜仲葉中京尼平甙酸的含量為1_4%，是提取京尼平甙的理想原料，國內現有提取工藝方案中存在著提取率不高、產品純度低、能源消耗大、大量使用有機溶劑、廢水量大等問題。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種從杜仲葉中提取京尼平甙酸的方法，具有工藝簡單，適合生產，生產成本低等優點。
[0006]本發明通過以下技術方案實現，具體包括如下步驟:
[0007]I)預濕堆放:將杜仲葉在陰涼處建堆，噴水，待水從堆底部流出后，自然堆放；
[0008]2)原料處理:將步驟I)得到的杜仲葉粉碎，加入相當于原料2-3倍重量的純凈水，加熱至50-60°C維持5-10分鐘，得到膏狀漿液；
[0009]3)第一次酶解:將步驟2)得到的膏狀漿液，調pH為4-5，加入膏狀漿液
0.05-0.1 %重量份的果膠-纖維素復合酶和0.001重量份的甘露醇進行酶解40-60分鐘，得到第一次酶解液；
[0010]4)去油:將步驟3)得到的第一次酶解液，加入2-3倍重量的純凈水，加熱至60-70°C浸提60-120分鐘，得上層浮油液與下層液、渣混合物，分離；
[0011]5)第二次酶解:將步驟4)得到的下層液、渣混合物，調pH為4.5，加入相當于混合物0.1-0.2%重量份的纖維素酶進行酶解40-60分鐘，得到第二次酶解液，重復兩次；
[0012]6)柱層析:合并第二次酶解液，過濾，濃縮，通過柱層析，用大孔吸附樹脂進行吸附，用去離子水清洗樹脂至流出液體為無色，再用濃度為60-70%的乙醇溶液洗脫，收集洗脫液；
[0013]7)干燥:將洗脫液濃縮，得到膏狀的京尼平甙酸，再通過干燥得到京尼平甙酸。
[0014]本發明步驟I)所述的預濕的堆放，優選6-12小時。
[0015]步驟3)所述的果膠-纖維素復合酶，優選活性是1-3萬活性單位/克(毫升)的固態或液態果膠-纖維復合酶。
[0016]步驟6)所述的大孔吸附樹脂型號優選DlOl型、DA201型。
[0017]與現有技術相比，本發明的優點:
[0018]1、杜仲葉的植物細胞內含有大量的油脂，主要由成分為甘油三酯的化合物組成的混合物，這些油脂以油粒和油體原生質體形式、呈不連續顆粒狀、與顆粒蛋白體一起無規則地分散在細胞內等存在形式存在。現有的提取方法，都是直接對杜仲葉等原料打碎或粉碎后通過水提/醇提、酶解、或者微波提取等方式直接提取，在提取的時候，細胞中的油脂會同時分離出，含有油脂的基團和京尼平甙、京尼平甙酸、色素等成分混在一起，從而影響后續有效成分的分離，增加了工序的處理難度。本發明先采用酶提取植物油脂，利用非油成分對油和水的親和力差異及油水比重不同而將油和非油成分分離，增加了產品收率和提高了提取率。
[0019]2、本發明采用杜仲葉預濕堆放，加適量水，建堆發酵，隨著發酵過程溫度的上升，杜仲葉逐漸軟化，水分自然進入到內部，利于植物油脂的分離，利于后續酶解、去油。
[0020]3、本發明先采用果膠-纖維素復合酶去除細胞壁，釋放植物細胞中的油脂，加入甘露醇，可以保持滲透壓，利于油脂的釋放。
[0021 ] 4、本發明得到的京尼平甙酸，經HPLC檢測，含量在96 %以上，得率3 %以上。
【具體實施方式】
[0022]下面以實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不局限于這些實施例。
[0023]實施例1:
[0024]一種從杜仲葉中提取京尼平甙酸的方法，具體包括如下步驟:
[0025]I)預濕堆放:將杜仲葉在陰涼處建堆，噴水，待水從堆底部流出后，自然堆放6小時；
[0026]2)原料處理:將步驟I)得到的杜仲葉粉碎，加入相當于原料2-3倍重量的純凈水，加熱至50°C維持5分鐘，得到膏狀漿液；