抗ilt7抗體的制作方法
【專利說明】抗丨LT7抗體
[0001] 本申請是申請日為2006年12月20日、中國申請號為201310270779. 4、發明名稱 為"抗ILT7抗體"的發明申請的分案申請。
技術領域
[0002] 本發明涉及能夠結合人ILT7的抗體。
【背景技術】
[0003] 干擾素a(IFNa:在下文中"干擾素"以縮寫IFN代表）以及干擾素0 (IFNP)作 為1型IFN為人們所知，該類型IFN具有抗病毒活性或者抗腫瘤活性。另一方面，已經有研 究表明IFNa涉及自身免疫病。例如，已經報道過在以下的自身免疫病的病人體內有IFNa 的異常產生。已經有研究提示可以通過中和IFNa來減輕自身免疫病的癥狀。
[0004] 系統性紅斑狼瘡（Shiozawaetal.，Arthr. &Rheum. 35,412,1992)
[0005] 慢性風濕（Hopkinsetal.，Clin.Exp.Immunol. 73,88,1988)
[0006] 已經有報道在給藥重組的IFNa2或IFN之后自身免疫病的癥狀出現或者惡化的 例子（Wadaetal.，Am.J.Gastroenterol. 90,136,1995;Perezetal.，Am.J.Hematol. 49， 365,1995；ffilsonLEetal,SeminArthritis.Rheum. 32,163-173,2002.).
[0007] 進一步地，還有研究提示IFNa能夠誘導樹突細胞（dendriticcell)的分化。樹 突細胞也是一種抗原呈遞細胞。因此，認為樹突細胞的分化誘導包括自身免疫病的重要的 機制。已經有研究表明在IFNa誘導樹突細胞分化和系統性紅斑狼瘡的發作之間有很深的 聯系（Blancoetal.，Science，16:294,1540-1543, 2001)。因此，已經有研究指出IFNa與 抗腫瘤活性以及自身免疫病密切相關。而且，IFNa與銀肩病的發作有密切的關系（Nestle F0etal.，J.Exp.Med. 202,135-143, 2005)。
[0008] 將當病毒感染時能夠產生大量1型IFN的細胞鑒定為干擾素生成細胞 (InterferonProducingcell，IPC)。很少有IPC在血液中出現。研究者認為在外周血淋 巴細胞中僅有1%或者更少的IPC。然而，IPC具有很高的產生IFN的能力。IPC產生IFN 的能力能夠達到，例如，3000pg/毫升/104細胞。也就是說，可以說雖然只有很少的細胞，但 是在病毒感染時血液中產生的大部分的IFNa或IFNP是由IPC產生的。
[0009] 另一方面，IPC是未分化的淋巴樣樹突細胞，該細胞被認為是樹突細胞的前體細 胞。IPC可能指的是類衆樹突細胞（Plasmacytoiddendriticcell)。在病毒的刺激下IPC 會分化成樹突細胞并且誘導T細胞產生IFNy或IL-10。IPC也可以在IL-3的刺激下分化 成樹突細胞。在IL-3的刺激下所分化的樹突細胞會誘導T細胞產生Th2細胞因子（IL-4， IL-5和IL-10)。因此，IPC具有在不同的刺激下分化成不同樹突細胞的性質。
[0010] 相應地，IPC具有兩種類型：IFN產生細胞和樹突細胞的前體細胞。在免疫系統中 兩種細胞都起重要的作用。換言之，IPC是在多個方面支持免疫系統的重要細胞。
[0011] 非專利文獻 1:Shiozawaetal.，Arthr. &Rheum. 35,412，1992
[0012] 非專利文獻 2:Hopkinsetal.，Clin.Exp.Immunol. 73,88,1988
[0013] 非專利文獻 3:Wadaetal.，Am.J.Gastroenterol. 90,136,1995
[0014] 非專利文獻 4:Parezetal.，Am.J.Hematol. 49,365,1"5
[0015] 非專利文獻 5:Biancoetal.，Science，16 :294,1540-1543, 2001
[0016] 非專利文獻 6:Juetal.，Gene. 2004Apr28 ;331 :159-64.
[0017] 非專利文獻 7:ColonnaMetal.，SeminarsinImmunology12 :121-127, 2000.
[0018] 非專利文獻 8:NakajimaH.etal.，J.Immunology162 :5_8. 1999
[0019] 非專利文獻 9:WilsonLEetal，SeminArthritis.Rheum. 32,163-173, 2002
[0020] 非專利文獻 10:NestleF0etal.，J.Exp.Med. 202,135-143, 2005
[0021] 專利文獻 1 :TO03/12061(U.S.PatentPublishedApplicationNo. )

【發明內容】

[0022] [本發明所要解決的問題]
[0023] 本發明的目的是提供能結合免疫球蛋白樣轉錄物7(Immunoglobulin-Like transcript-7，ILT7)的抗體，并且檢測，鑒定或者分離IPC。本發明的另一個目的是調節 IPC的活性。
[0024] 為了調節諸如IFN這樣的體液因子的活性，給藥能夠識別該因子的抗體是有效 的。例如，已經實現了通過針對白介素（IL)-l或者IL-4的抗體來治療自身免疫病的嘗試 (Guleretal.，ArthritisRheum.，44.S307, 2001)。進一步地，設想中和抗體可以和干 擾素一樣作為種自身免疫病的治療制劑來起作用（Stewart，TA.CytokineGrowthFactor Rev. 14 ;139-154,2003)。可以預言與上述相同的方法對于由IPC所產生的IFN同樣有效。 然而，這樣的方法是基于在產生體液因子之后抑制該因子的效力。如果可以直接地控制所 需體液因子的產生，就可以得到更明顯的療效。
[0025] 已經報道過能夠識別人IPC的抗體。例如，抗BDCA-2單克隆抗體是人IPC-特異的 單克隆抗體（DzionekA.etal.J.Immunol. 165 :6037-6046, 2000)。研究者發現抗BDCA-2 單克隆抗體能夠有效地抑制人IPC產生IFN(J.Exp.Med. 194 :1823-1834,2001.)。而且， 還報道過能夠識別小鼠中干擾素生成細胞的單克隆抗體能夠抑制干擾素的產生（Blood 2004Junl;103/ll:4201-4206.Epub2003Dec)。已經有報道稱針對小鼠類漿樹突細胞的 單克隆抗體會造成樹突細胞數目的減少（J.Immunol. 2003,171 :6466-6477)。
[0026] 相似地，如果能夠提供識別人IPC、并且調節其活性的抗體，那么會非常有用。例 如，本發明的發明者已經顯示了能夠識別Ly49Q的抗體會特異地結合小鼠的IPC。然而， 針對Ly49Q的抗體不會干擾小鼠IPC的活性（Blood，lApril2005,Vol. 105,No. 7,和 pp. 2787-2792. ;W02004/13325)。另一方面，已知ILT7是一種特異表達在類漿樹突細胞中 的分子（JuXSetal.andGene. 2004Apr28 ;331 :159-64. ;TO03/12061)。然而，還沒有獲 得過任何針對ILT7的抗體。因此，抗體對于IPC的作用仍然未知。
[0027] ILT7是一種含有免疫球蛋白樣基序的膜蛋白。已經有報道稱該分子是在骨髓系統 或者淋巴系統的細胞中表達的分子之一（ColonnaMetal.，SeminarsinImmunology12 : 121-127, 2000.)。一類具有類似于ILT7結構的分子被指定為ILT家族。ILT家族也與殺傷 細胞抑制受體（killercellinhibitoryreceptor，KIR)的結構、功能相近。ILT7 與ILT 家族其它分子一樣具有4個C-型免疫球蛋白樣結構域。研究者認為ILT7像ILTUILT1樣 蛋白、ILT8和LIR6a等一樣將活化的信號送入到細胞內。已經確認了，在血系統細胞中有 屬于ILT家族的分子的表達（Youngetal.，Immunogenetics53:270_278,2001;"TheKIR GeneCluster. "Carrington，MaryandNorman,Paul.Bethesda(MD)：NationalLibrary ofMedicine(US),NCBI；2003)〇
[0028] 于是，通過減除雜交法檢測到了ILT7在類衆樹突細胞（Plasmacytoiddendritic cell，roC)中的高表達以及在單核細胞衍生的樹突細胞（monocyte-deriveddendritic cell，MDDC)中的低表達。ILT2和ILT3不僅在H)C中有表達，而且在從MDDC或CD34陽性 細胞中獲得的DC中也有表達。然而，由于ILT7的mRNA在H)C中特異地表達，所以發現了 可以使用該mRNA作為TOC的標記。另外，當時已經發現了，通過CpG的刺激可以降低ILT7 的表達（JuXSetal.Gene. 2004Apr28 ;331 :159-64. ;W003/12061)〇
[0029] 本發明的發明者通過研究人IPC確認了：在IPC中ILT7的表達特異性地亢進。于 是，本發明的發明者嘗試了制備ILT7抗體，并且闡述其作用。例如，諸如ILT2和ILT3這樣 的構成ILT家族的分子，特別是在其胞外域的氨基酸序列上具有高保守性（圖9)。這些ILT 家族分子分別在不同的血細胞中展示特有的表達譜。因此，獲得能夠從免疫學上區分ILT7 與其他的ILT家族分子的抗體是非常重要的。然而，實際上，由于下述的障礙，制備以ILT7 為免疫原特異性結合人IPC的抗體是困難的。
[0030] 通常，將通過基因重組技術制備的蛋白用作免疫原，以便獲得能夠識別從活體組 織中得到的微量蛋白的抗體。本發明的發明者以人ILT7的cDNA序列、以及根據該堿基序 列翻譯而成的氨基酸序列的信息（GenBankAccessionNo.NM_012276)為基礎設法表達了 人ILT7。然而，在常規條件，不能作為重組體表達人ILT7。
[0031] 為了獲得蛋白的抗體，也經常嘗試使用天然蛋白的部分氨基酸序列作為免疫原。 然而，由于在ILT家族中其氨基酸序列同源性極高，所以對于人ILT7幾乎沒有氨基酸序列 是特異的。而且，為了使抗體能夠識別細胞表面的分子，選擇位于細胞表面的區域是必要 的，其中該區域是由能夠作為抗原表位被抗體識別的部分組成的。因此，研究者已經認識到 利用氨基酸序列片段作為免疫原來制備特異針對ILT7的抗體是不現實的。
[0032] 本發明的發明者明確了在這種條件下可以通過利用特異的免疫原獲得能夠結合 IPC的抗體。更進一步地，本發明的發明者發現：以這種方法獲得的抗體能夠特異地識別人 IPC并且進一步地具有調節其活性的作用，因此成功的完成了本發明。就是說，本發明涉及 下述的抗ILT-7抗體、其制備方法及其應用。
[0033][本發明的效果]
[0034] 本發明提供了可以用于制備能夠識別人ILT7的抗體的免疫原以及利用該免疫原 制備抗人ILT-7抗體的方法。ILT7是屬于ILT家族的一種膜蛋白。具體地，ILT家族的胞 外區的氨基酸序列是高度保守的。因此，想要通過常規的免疫方法來制備能夠區分ILT家 族成員的抗體是非常困難的。本發明的發明者顯示了可以很方便地利用動物細胞來獲得能 夠識別人ILT7的抗體，其中該動物細胞共表達了ILT7與細胞膜蛋白。通過本發明的方法 獲得的抗ILT-7抗體具有高特異性，該抗體能夠區分人IPC與其他表達ILT家族成員的細 胞。
[0035] 在優選應用實例中，本發明所提供的抗人ILT-7抗體能夠結合人IPC。另外，本發 明的抗體特異地識別人IPC。因此，該抗體可用于檢測和分離IPC。IPC是產生大部分1型 干擾素的細胞。因此，在診斷和研究諸如自身免疫病這樣的與IPC相關的疾病時，檢測和分 離IPC是很重要的。具體地，按照本發明的發明者的發現，IPC中ILT7的表達不因IFNa的 存在而降低。在患有自身免疫病的病人體內，IFNa的表達經常被促進。這意味著可以使用 本發明的抗ILT-7的抗體來檢測和分離患有自身免疫病的病人的IPC，在該病人體內IFNa 的表達受到了促進。
[0036] 在優選應用實例中，本發明提供的抗ILT-7抗體具有調節人IPC的活性的作用。 因此，可以使用本發明的抗ILT-7抗體來抑制IPC的活性。如前所述，在IFNa存在的情況 下，IPC中ILT7的表達不會減少。因此，如果利用本發明的抗體對IPC的活性的抑制，那么 可以預期該抗體對于患有自身免疫病的病人具有治療效果，其中在該病人體內IFNa的表 達被促進了。
[0037] 少量的IPC就可以產生大量的IFN。需要與IFN分子一樣多的抗體來中和IFN。然 而，在本發明中直接抑制了生成細胞的活化。因此，可以預期與利用抗IFN抗體中和IFN相 比，即使使用少量的抗體也能獲得強效的IFN抑制作用。此外，在持續產生IFN的情況中， 可以預言通過IFN抗體來進行中和是暫時的抑制。在本發明中，由于抑制了IPC的活性，可 以預期對IFN的產生的抑制作用可以在很長的時間內有效。
[0038] 本發明涉及下述各項。
[0039] 1.能夠結合人ILT7的胞外域的單克隆抗體，或者含有該單克隆抗體的抗原結合 區的片段。
[0040] 2.根據項1的單克隆抗體或者含有該單克隆抗體的抗原結合區的片段，其中，所 述單克隆抗體能夠結合人干擾素生成細胞。
[0041] 3.保藏號為FERMBP-10704的雜交瘤ILT7#11或保藏號為FERMBP-10705的雜交 瘤ILT7#17產生的單克隆抗體，或者含有該單克隆抗體的抗原結合區的片段。
[0042] 4.根據項1的單克隆抗體或者含有該單克隆抗體的抗原結合區的片段，其中，所 述單克隆抗體在重鏈可變區和輕鏈可變區中含有如下i)至iii)任意一項的氨基酸序列作 為CDRUCDR2 和CDR3 :
[0043] i)重鏈可變區的CDR1 :SDYAWN(SEQIDN0 :58);
[0044] 重鏈可變區的CDR2 :YISYSGSTSYNPSLKSR(SEQIDNO:59);和
[0045] 重鏈可變區的CDR3 :SPPYYAMDY(SEQIDNO:60);
[0046] 輕鏈可變區的CDR1 :KASQDVGTAVA(SEQIDNO:61);
[0047] 輕鏈可變區的CDR2 :WASTRHT(SEQIDNO:62);和
[0048] 輕鏈可變區的：CDR3QQYSSYPLT(SEQIDNO:63);
[0049] ii)重鏈可變區的CDR1 :SYWIH(SEQIDNO:64);
[0050] 重鏈可變區的CDR2 :RIYPGTGSTYYNEKFKG(SEQIDNO:65);和
[0051] 重鏈可變區的CDR3 :YPTYDWYFDV(SEQIDNO:66);
[0052] 輕鏈可變區的CDR1 :RASQSISNYLH(SEQIDNO:67);
[0053] 輕鏈可變區的CDR2 :YASQSIS(SEQIDNO:68);
[0054] 輕鏈可變區的CDR3 :QQSNSWPLT(SEQIDNO:69);
[0055] iii)重鏈可變區的CDR1 :SDYAWN(SEQIDNO:70);
[0056] 重鏈可變區的CDR2 :YISYSGSTSYNPSLKSR(SEQIDNO:71);
[0057]重鏈可變區的CDR3 :ALPLPWFAY(SEQIDNO:72);
[0058]輕鏈可變區的CDR1 :KASQDVGTAVA(SEQIDNO:73);
[0059]輕鏈可變區的CDR2 :WASTRHT(SEQIDNO:74);和
[0060]輕鏈可變區的CDR3 :QQYSSYPYT(SEQIDNO:75).
[0061] 5.根據項1的單克隆抗體或者含有該單克隆抗體的抗原結合區的片段，其中，所 述單克隆抗體含有選自如下（a)至（c)的組合中的任意一項的氨基酸序列的成熟序列作為 重鏈可變區和輕鏈可變區：
[0062]a)SEQID N0 :39的重鏈可變區和SEQID N0 :41的輕鏈可變區；
[0063]b)SEQID N0 :43的重鏈可變區和SEQID N0 :45的輕鏈可變區；以及
[0064]c)SEQID N0 :47的重鏈可變區和SEQID N0 :49的輕鏈可變區。
[0065] 6.編碼項4或5的單克隆抗體或者含有該單克隆抗體的抗原結合區的片段的多核 苷酸。
[0066] 7.含有編碼項4或5的單克隆抗體或者含有該單克隆抗體的抗原結合區的片段的 多核苷酸的載體。
[0067] 8.以可表達的方式攜帶項7的載體的轉化細胞。
[0068] 9.制備項4或5的單克隆抗體或者含有該單克隆抗體的抗原結合區的片段的方 法，該方法包括如下步驟：培養項8的轉化細胞，從培養物中回收單克隆抗體或者含有該單 克隆抗體的抗原結合區的片段。
[0069] 10.產生項1或2的單克隆抗體的雜交瘤。
[0070] 11.保藏號為FERMBP-10704的雜交瘤ILT7#11或者保藏號為FERMBP-10705的 雜交瘤ILT7#17。
[0071] 12.制備單克隆抗體的方法，該方法包括以下步驟：培養項11的雜交瘤，從培養物 中收集單克隆抗體。
[0072] 13.制備單克隆抗體產生細胞的方法，其中，所述單克隆抗體能夠結合人ILT7的 胞外域，該方法包括以下步驟：
[0073] (1)給免疫動物施用細胞，所述細胞表達含有人ILT7胞外域的外源蛋白和與人 ILT7結合的外源分子；以及
[0074] (2)從所述免疫動物的抗體生成細胞中選擇下述抗體生成細胞，所述抗體生成細 胞產生能夠結合人ILT7的抗體。
[0075] 14.根據項13的方法，其中與人ILT7結合的分子是細胞膜蛋白。
[0076] 15.根據項14的方法，其中所述細胞膜蛋白是Fc受體y鏈。
[0077] 16.根據項15的方法，其中表達人ILT7和與人ILT7結合的分子的細胞是以可表 達的方式攜帶以下的（a)和（b)的細胞：
[0078] (a)編碼含有人ILT7胞外域的氨基酸序列的外源多核苷酸；以及
[0079] (b)編碼Fc受體y鏈的外源多核苷酸。
[0080] 17.根據項16的方法，其中所述細胞是動物細胞。
[0081] 18.根據項17的方法，其中所述細胞是人源細胞。
[0082] 19.根據項18的方法，其中所述人源細胞是293T細胞。
[0083] 20.根據項13的方法，該方法還包括克隆化按照項13的方法所獲得的抗體生成細 胞的步驟。
[0084] 21.制備能夠結合人ILT7胞外域的單克隆抗體的方法，該方法包括如下步驟：培 養按照項8的方法獲得的抗體生成細胞，從培養物中收集單克隆抗體。
[0085] 22.能夠識別人ILT7的單克隆抗體或者含有該單克隆抗體的抗原結合區的片段， 所述單克隆抗體或片段能夠通過以下的步驟獲得：
[0086] (1)給免疫動物施用細胞，所述細胞外源性表達含有人ILT7胞外域的蛋白和與人 ILT7結合的分子；
[0087] (2)從所述免疫動物的抗體生成細胞中選擇下述抗體生成細胞，所述抗體生成細 胞產生能夠結合人ILT7的抗體；以及
[0088] (3)培養從步驟⑵中選擇出來的抗體生成細胞，從培養物中回收能夠識別人 ILT7的抗體。
[0089] 23.用于制備能夠結合人ILT7胞外域的抗體的免疫原，該免疫原包括下述動物細 胞或者其細胞膜成分，所述細胞以可外源性表達的方式攜帶（a)編碼含有人ILT7胞外域的 氨基酸序列的多核苷酸和（b)編碼Fc受體y鏈的多核苷酸。
[0090] 24.根據項23的免疫原，其中，所述動物細胞是人源細胞。
[0091] 25.檢測干擾素生成細胞的方法，該方法包括以下步驟：
[0092] 使能夠結合人ILT7胞外域的單克隆抗體或者含有該單克隆抗體的抗原結合區的 片段與受試細胞接觸；以及
[0093] 檢測與細胞結合了的單克隆抗體或含有該單克隆抗體的抗原結合區的片段。
[0094] 26.用于檢測干擾素生成細胞的檢測試劑，該檢測試劑包含能夠結合人ILT7胞外 域的單克隆抗體或者含有該單克隆抗體的抗原結合區的片段。
[0095]27.抑制干擾素生成細胞的活性的方法，該方法包括使以下任意成分與干擾素生 成細胞接觸的步驟：
[0096] (a)能夠結合人ILT7并且抑制干擾素生成細胞活性的單克隆抗體或者含有該單 克隆抗體的抗原結合區的片段；以及
[0097] (b)免疫球蛋白或含有該免疫球蛋白的抗原結合區的片段，在所述免疫球蛋白中 導入了（a)的單克隆抗體的互補決定區。
[0098] 28.抑制活體中干擾素生成細胞的活性的方法，該方法包括給活體施用以下任意 成分的步驟：
[0099] (a)能夠結合人ILT7并且抑制干擾素生成細胞活性的單克隆抗體或者含有該單 克隆抗體的抗原結合區的片段；
[0100] (b)免疫球蛋白或含有該免疫球蛋白的抗原結合區的片段，在所述免疫球蛋白中 導入了（a)的單克隆抗體的互補決定區；以及
[0101] (C)編碼（a)或（b)所述成分的多核苷酸。
[0102] 29.根據項27或28的方法，其中，所述干擾素生成細胞的活性是干擾素生成活性， 或者干擾素生成細胞的存活，或者二者皆有。
[0103] 30.干擾素生成細胞活性抑制劑，其包含下述的任意成分作為活性成分：
[0104] (a)能夠結合人ILT7并且抑制干擾素生成細胞活性的單克隆抗體或者含有該單 克隆抗體的抗原結合區的片段；
[0105] (b)免疫球蛋白或含有該免疫球蛋白的抗原結合區的片段，在所述免疫球蛋白中 導入了（a)的單克隆抗體的互補決定區；以及
[0106] (c)編碼（a)或（b)所述成分的多核苷酸。
[0107] 31.根據項30的干擾素生成細胞活性抑制劑，其中，所述干擾素生成細胞的活性 是干擾素生成活性，或者干擾素生成細胞的存活，或者二者皆有。
【附圖說明】
[0108] 圖la是通過RT-PCR方法檢測ILT7基因的mRNA的表達的照片。該圖是對人免疫 細胞中ILT7基因的mRNA的表達的分析結果。
[0109] 圖lb是利用定量PCR方法檢測和比較多種人組織和細胞中ILT7基因的mRNA的表 達的圖表。橫軸顯示的是所檢測的組織和細胞，縱軸顯示的是ILT7的表達水平，其中ILT7 的表達水平按照GAPDH的表達水平進行了標準化。
[0110] 圖2是顯示ILT7蛋白結構的圖表。其中圖2的（a)顯示的是ILT7蛋白的氨基酸 序列，并且進一步在圖中顯示了推定的分泌信號序列以及跨膜區；圖2的（b)顯示了由構建 的表達載體所編碼的ILT7蛋白的簡圖。
[0111] 圖3是一張圖片，該圖片顯示了將ILT7表達載體和FcRy表達載體導入到細胞 內、并且利用FCM檢測ILT7分子在細胞表面的表達的結果。橫軸表示利用抗FLAG抗體檢 測的熒光強度，即帶有FLAG標簽ILT7分子在細胞表面的表達強度，同時縱軸表示細胞數 目。
[0112] 圖4是一張照片，該照片顯示的是利用免疫沉淀和Western印跡方法分析的、在導 入了ILT7表達載體和FcRy表達載體的細胞中的分子結合。左邊的圖表顯示了在利用抗 myc抗體對FcRy分子進行了免疫沉淀之后，利用抗FLAG抗體對ILT7分子進行印跡的結果 的圖片（上方的圖片）、以及利用抗myc抗體對FcRy分子進行印跡的結果的圖片（下方 的圖片）。相似地，右邊的圖片顯示的是在