一種提取分離神經節苷脂的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物制藥領域，具體的說是涉及一種提取分離神經節苷脂的方法。
【背景技術】
[0002] 神經節苷脂是最復雜的鞘糖脂，微量地存在于脊椎動物幾乎所有的組織中，但在 哺乳動物的大腦和脊髓組織中含量最高，約含0. 3%左右（RobertW.Ledeen，RobertK.Yu， MethodsinEnzymology. 1982,83:139-191)。哺乳動物腦和脊髓組織中主要的神經節苷脂 為GM1、⑶lb、⑶la和GTlb等。神經節苷脂分子的生理功能主要包括：1)作為膜脂質雙層 和細胞糖萼的組分；2)維持膜表面負電荷；3)參與細胞識別與信號傳遞；4)保護缺血（氧） 性神經損害等（唐向東，生命的化學，1995,15 (2)，32-34)。神經節苷脂呈乳白色粉末狀，無 味，具吸濕性，可溶于水，在水溶液中呈高度規律性的球形聚合體，也可溶于甲醇-水溶液 和甲醇-氯仿溶液，微溶于甲醇，不溶于氯仿、丙酮、乙醚、乙酸乙酯及乙醇，平均分子量為 1800Da左右。
[0003] 伴隨神經節苷脂生理功能及藥用價值的不斷研究與應用，從機體 組織中提取分離神經節苷脂的方法也不斷獲得研究和發展。如J.Folch，M. Lees,andG.H.SloaneStanley,JBiolChem, 1957,226 (1) :497 - 509；Suzuki K.JNeurochem. 1965, 12 (7) :629-638；TettamantiG,BonaliF,Marchesini S,ZambottiV,BiochimBiophysActa. 1973, 19 ；296 (1) :160-170 ；Phi11ips F,Privett0S,Lipids, 1979, 14 (6) : 590-595；SvennerholmL,Fredman P,BiochimBiophysActa. 1980,617 (1) :97-109；LedeenRff,YuRK,Methods Enzymol, 1982,83:139-191；ByrneMC,Sbaschnig-AglerM,AquinoDA,Sclafani JR,LedeenRff,AnalBiochem,1985, 148 (1) :163-73；ffangWQ,GustafsonA,Acta ChemScand, 1995, 49 (12) : 929-36；LydicTA,BusikJV,ReidGE,JLipid Res, 2014, 55(8) : 1797-1809等文獻系統描述了從神經組織中提取分離神經節苷脂的方 法及發展，這些方法都是基于J.Folch提出的以氯仿-甲醇混合溶劑為組織脂類物質 提取溶劑，然后再通過增加水份比例的分配分離法使神經節苷脂與其他脂類物質分離 以獲得神經節苷脂的經典方法的修正與完善。DiazRS，MonrealJ，RegueiroP,Lucas M，JNeurosciRes. 1992, 31 (1) : 136-145等文獻提出以四氫呋喃為溶劑進行組織脂類物 質的提取，然后通過增加乙醚進行兩相分配分離獲得神經節苷脂。HeitmannD，Lissel M，KempkenR，MUthingJ，BiomedChromatogr. 1996, 10 (5): 245-250 等文獻描述了 以正丙 醇-水（40:10,v/v)和甲基異丁基酮-甲醇-水（40:80:30,v/v/v)混合溶劑體系為提取 溶劑替代氯仿-甲醇-水提取溶劑進行組織中神經節苷脂的提取，以期希望規避氯仿溶劑 的使用。SchwarzA，TerstappenGC，FutermanAH,AnalBiochem. 1997, 254 (2): 221-225; TerstappenGC,FutermanAH,SchwarzA,MethodsEnzymol, 2000, 312:187-196 等文獻描 述用一種叫C14E06的非離子去垢劑形成膠束進行神經節苷脂的提取分離。國內文獻涉及 從神經組織中提取分離神經節苷脂的描述幾乎都是沿用J.Folch的氯仿/甲醇混合溶劑提 取及分配分離法。（朱正美等，上海第一醫學院學報，1983, 03:234-236 ;夏霞娟等，生物化 學雜志，1985,02:13-17 ;夏霞娟等，生物化學與生物物理進展，1985,05:27-31 ;夏霞娟等， 上海第一醫學院學報，1985,06:467-470 ;歐陽啟楣等，大連醫學院學報，1987,01:8-12 ;崔 肇春等，生物化學與生物物理進展，1990,03:206-209 ;張新波等，生物化學與生物物理進 展，1990, 03:243-244 ;陳榮等，安慶師范學院學報（自然科學版），1992, 01:1-9 ;張新波等， 生物化學與生物物理進展，1992,06:477-478 ;潘穎等，生物化學雜志，1994,04:387-391 ; 潘穎等，生物化學與生物物理進展，1994,04:353-356+380 ;黃如彬等，生物化學與生物物 理進展，1994,05:444-446+476 ;高劍峰等；氨基酸和生物資源，1996,04:5-8 ;王江雁等，生 物化學與生物物理進展，1997, 01:75-78 ;侯衛紅等，白血病，1997, 01:12-15 ;李欽選等，新 鄉醫學院學報，1997,01:46-49)
[0004] 自FIDIA公司在20世紀80年代首先把牛腦來源的混合神經節苷脂開發為臨床 周圍神經系統疾病用藥以來，先后有FIDIA公司的混合神經節苷脂"Cronassial?"、單唾 液酸四己糖神經節苷脂鈉"Sygen?",上市銷售，其后國內齊魯藥業的單唾液酸四己糖神 經節苷脂鈉"申捷"也在國內首先上市銷售，神經節苷脂的藥用研究及開發利用日趨成為 熱點。FIDIASPA公司于20世紀70年代開始陸續公開制備神經節苷脂的方法（公開號 FR2320760A1、JPS5234912A、GR61663A1、JPS62187412A、IN171530A1、US2003153517A1)， 其系列方法中對于從牛腦或豬腦中進行神經節苷脂提取與分離的方法都是沿用J.Folch 提出的以氯仿-甲醇混合溶劑為主的提取液從組織中進行脂類物質的提取，然后用分配 分離法獲得神經節苷脂的方法。同時，其他的諸多機構公開的相關的從組織中進行神 經節苷脂提取與分離方法亦是如此（公開號EP0150712A2、CA2002155A1、EP0319890A1、 EP0409473A2、US5532141A、CN1158295C、CN101108868A、CN101838295A、CN102731584A、 CN103524572A)。略有不同的是，日本國MITSUITOATSUCHEMICALS公司在1985年曾公開 了一種提取分離制備神經節苷脂的方法（公開號JPS60181019A)，該方法以甲醇為溶劑替 代JFolch經典方法的氯仿-甲醇-水溶劑體系進行加熱提取和降溫冷卻獲得脂類物質， 然后再把脂類提取物溶解在氯仿-甲醇溶劑體系中參照JFolch經典方法進行分配分離獲 得神經節苷脂，以期減少氯仿和甲醇溶劑的用量。
[0005] 其他機構也陸續公開了一些與J.Folch經典方法相當不同的方法。中科院上海 生理所在1999年公開了一種以酒精-石油醚混合溶劑提取動物腦組織獲得含神經節苷 脂的提取物制備保健食品的方法（公開號CN1046734C)。吳浩青于2007年公開了一種用 "有機溶液-緩沖溶液"混合萃取體系進行動物組織神經節苷脂成分提取的方法（公開號 CN101003553A)，其中有機溶劑包括氯仿、甲醇、四氫呋喃、乙醚。上海綠谷公司2004年公開 了一種在不高于室溫條件下用含水酒精提取動物鮮腦組織中神經節苷脂的方法（公開號 CN1535974A)。魯南制藥集團2008年公開了一種基于鮮腦組織原料用甲醇溶液在低溫（2~ 8°C)條件下提取神經節苷脂成分的方法（公開號CN101177439A)，2011年又公開了一種基 于鮮腦組織用無水乙醇提取神經節苷脂的方法（公開號CN102093440A)。湖北利諾生物藥 業公司2014年公開了一種用甲醇-堿水混合溶劑提取經酸處理過的鮮腦組織獲得神經節 苷脂成分的方法（公開號CN104151372A)。長春英聯生物技術公司于2008年公開了一種應 用C02超臨界萃取法進行腦組織神經節苷脂成分的提取方法（公開號CN101270137A)。北 京賽生藥業于2010年公開了一種用含非離子型