一種脂肪酶及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于功能酶技術領域，具體涉及一種脂肪酶及其應用。
【背景技術】
[0002] 脂肪酶（LipaseE.C. 3.LL3)是一類特殊的界面酯酶，能夠水解甘油三酯的酯鍵 產生脂肪酸、二酸甘油酯、單酸甘油酯及甘油，其天然底物一般是不溶于水的長鏈脂肪酸酰 基酯。在非水反應體系中脂肪酶還能夠催化其逆反應，發生酯化反應、酯交換反應、醇解反 應、酸解反應以及氨解反應等。微生物脂肪酶由于其種類多、生產周期短、便于結構修飾，且 相比動植物脂肪酶具有更加廣泛的溫度、pH適應性，廣泛的底物特異性，高度的位置選擇性 和異構體選擇性，催化活性高，副反應少等特點使其廣泛應用于食品加工、新型生物材料、 生物傳感器、生物醫學、手性藥物拆分等領域。同時微生物脂肪酶催化的條件溫和性和環 境友好性，已經改變了傳統的酯化或轉酯化反應所需要的高溫、強酸、強堿等相對苛刻的條 件，在提高生產效率的同時減少了對環境的污染，所以從自然界中篩選具有特異性活力的 脂肪酶是非常有必要的。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的是提供一種脂肪酶及其應用，即從寡養單胞菌發酵粗酶液中分離純 化的脂肪酶，從而彌補現有技術的不足。
[0004] 本發明的脂肪酶，包含有：
[0005] 1)氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的多肽，
[0006] 2)與1)中的多肽具有85%以上序列同一性，且具有1)中酶學功能的，由1)所衍 生的多肽。
[0007] 作為優選，所述的2)中的多肽與1)中的多肽具有90%以上序列同一性；更進一 步的，具有95%以上序列同一性。
[0008] 本發明還提供編碼上述脂肪酶的核酸，其一種具體的序列為SEQ ID N0:2;
[0009] 上述的脂肪酶是從寡養單胞菌中分離純化得到，其SDS-PAGE電泳分子量大小為 22kDa〇
[0010] 上述的脂肪酶，Fe3+和SDS能夠完全抑制酶活，Cu2+，Zn2+，Al3+，Mn2+以及H202 (1 %， v/v)，Phenol(5%，w/v)能夠部分抑制酶活。
[0011] 上述的脂肪酶，其最適的pH為7-8 ;在pH5-12的范圍內4°C放置過夜能夠保持 80%以上的活力。
[0012] 上述的脂肪酶，其最適的反應溫度為40°C;在10-40°C范圍內放置lh能夠維持 80%以上的活力。
[0013] 本發明還提供一種重組微生物，用于重組表達上述的脂肪酶。
[0014] 本發明脂肪酶用于以甘油和DHA乙酯為底物轉酯合成DHA甘油酯。
[0015] 相比較于現有的利用脂肪酶催化法制備DHA產品的工藝：EPA濃縮油和DHA濃縮 油的制造方法（CN101765662A)、一種脂肪酶催化合成魚油乙酯的方法（CN101979622A)、高 純度DHA藻油乙酯及其轉化為甘油酯的制備方法（CN103880672A)，利用本發明的脂肪酶 合成的DHA甘油酯不含飽和脂肪酸及單不飽和脂肪酸等低效成分，合成產物中甘油酯含量 高，且催化合成過程時間短，在產品品質和合成效率方面具有較明顯的優勢。
【附圖說明】
[0016] 圖1 :本發明的脂肪酶純化過程電泳圖；其中泳道1為蛋白Marker，泳道2為 SephadexG-75分離樣品，泳道3為DEAESepharoseFastFlow分離樣品，泳道4為80% 硫酸銨沉淀透析液，泳道5為發酵粗酶液。
[0017] 圖2 :本發明的脂肪酶最適pH及pH穩定性不意圖；1為最適pH不意圖，2為pH穩 定性不意圖。
[0018] 圖3 :本發明的脂肪酶最適溫度及溫度穩定性示意；1為最適溫度示意圖，2為溫度 穩定性不意圖。
[0019] 圖4 :本發明克隆脂肪酶基因PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道1為PCR擴增 產物，泳道2為DNAMarker。
[0020] 圖5 :本發明脂肪酶的重組表達電泳示意圖；泳道1為蛋白Marker，泳道2為鎳柱 純化蛋白，泳道3為重組表達粗酶液。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合【具體實施方式】對本發明的酶的分離純化、酶學性質、克隆表達及應用進 行詳細的描述。
[0022] 實施例1 :LH15脂肪酶的分離純化
[0023] 本發明的酶是從寡養單胞菌（Stenotrophomonassp.)發酵粗酶液中分離純化，該 菌株是本實驗從富油土壤中篩選得到的，于2015年03月30日保藏在位于北京市朝陽區北 辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心（ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，保藏編號 為CGMCCNO. 10672。
[0024] 將寡養單胞菌種子培養液按照2 % (v/v)的接種量接種于發酵培養基中， 28°C180rpm震蕩培養72h，4°C8000rpm離心10min得到發酵粗酶液。
[0025] 種子培養基：10g/L葡萄糖，7. 5g/L牛肉膏，7. 5g/L蛋白胨，3g/LNaCl，lg/L MgS04 ? 7H20,pH7. 0,115°C蒸氣滅菌 20min。
[0026] 發酵培養基：10g/L葡萄糖，20g/L酵母粉，5g/L蛋白胨，2g/LK2HP04,0. 5g/L MgS04 ? 7H20,pH7. 0,115°C蒸氣滅菌 20min。
[0027] 離心得到的發酵粗酶液進行80%硫酸銨沉淀。冰水浴保溫，磁力攪拌的條件下均 勻緩慢地向發酵粗酶液加入粉碎并干燥的硫酸銨。4°C靜置過夜后離心收集沉淀，用10mM pH7. 5Tris-Hclbuffer復溶沉淀，并在此緩沖液中透析。
[0028] 用pH8. 5的10mMTris-HCl緩沖液充分平衡DEAES印haroseFF離子交換柱 (10cm*l. 2cm)，上樣吸附。然后用pH8. 5 的 10mMTris-HCl含有NaCl(0? 1-0. 6MNaCl)進 行梯度洗脫，3min/管分管收集。對收集管中的溶液測酶活和蛋白質分析。
[0029] 將上步0. 2MNaCl洗脫峰用超濾管超濾濃縮，上樣lmL于以平衡好的S印hadex G-75FF柱（80cm*lcm)，用超純水洗脫2. 5mL/3min分管收集。對收集管中的溶液測酶活和 蛋白質分析。
[0030] 分別測定以上幾個步驟樣品的酶活力和蛋白質含量并進行SDS-PAGE電泳檢測。 純化結果見表1，粗酶液經過幾步純化后，比活從0. 57U/mg提高到154. 29U/mg，純化倍數 為270. 67倍。蛋白電泳結果（圖1)表明，純化后的脂肪酶在電泳上為一條帶，分子量約為 22kDa〇
[0031] 表1:脂肪酶的純化步驟及結果
[0032]
[0033] 實施例2 :LH15脂肪酶的酶學性質
[0034] (1)LH15脂肪酶分子量的測定
[0035] 在SDS-PAGE電泳中蛋白質的迀移率與其相對分子質量的對數成正比。因此可以 通過SDS-PAGE測定目標蛋白的相對分子質量。根據SDS-PAGE中標準分子量蛋白和目標蛋 白的相對迀移率計算出目的蛋白的相對分子量為22kDa。
[0036] ⑵LH15脂肪酶的最適pH及pH穩定性
[0037] 純化后的脂肪酶在不同的pH下進行酶活測定，結果如圖2所示。LH15脂肪酶pH適 用范圍比較窄，PH7