一種微生物復合菌劑及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物制劑領域，具體涉及一種微生物復合菌劑及其制備方法和應 用，特別涉及丁酸梭菌和蛭弧菌復合菌劑及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 丁酸梭菌又稱酪酸菌，是調節腸道微生態平衡的有益菌，其主要生物特性表現為： ①促進腸道有益菌群（雙歧桿菌，乳酸桿菌）的增殖和發育，抑制腸道內有害菌和腐敗 菌的生長、繁殖，糾正腸道菌群紊亂，減少腸毒素的發生；②在腸道內能產生B族維生素、 維生素K等物質，對機體具有保健作用；③丁酸梭菌的主要代謝產物丁酸是腸道上皮組織 細胞的再生和修復主要營養物質，提高畜禽的飼料消化吸收率；④丁酸梭菌是厭氧芽孢桿 菌，穩定性好，在機體內不受胃酸、膽汁酸等影響，在體外（芽孢狀態）室溫下能保存三年以 上。丁酸梭菌制劑作為飼料添加劑已成為目前的研究熱點，用來治療畜禽腸道菌叢紊亂，提 高生產力，取得了一定的效果。
[0003] 蛭弧菌是寄生于其他細菌并能導致其裂解的一類細菌，蛭弧菌不僅宿主范圍廣 泛，加之特殊的生活方式，使之具有生態學優勢。其一，蛭弧菌進入到其他細菌的周質空間， 可以確保營養需要，不依賴外界的來源。因此，即使在營養物質很少的地方，諸如海洋、江 河、湖泊等生態系統中也能生長；其二，周質內的環境是一個無競爭的小生境。這對生長緩 慢的蛭弧菌無疑是個很有利的條件；另外，周質空間被一個穩定的、堅強的細胞壁所包圍， 有似大分子不能通過，即使小分子也不易透過，這就為蛭弧菌提供了一個保護性環境。由于 上述特性，使蛭弧菌具有很大的潛在應用價值，目前多用于水產養殖動物弧菌病的防治。目 前我國商業化的蛭弧菌制劑主要是水劑，還有少量的凍干粉劑，蛭弧菌水劑因保存時間短， 質量不穩定等因素影響了其使用效果，凍干粉劑也因生產成本高而在很大程度上限制了其 應用。
[0004] 目前還未見有丁酸梭菌和蛭弧菌復合菌劑的相關報道。中國專利 ZL201110110362. 2公開了一種枯草芽孢桿菌與丁酸梭菌復合菌制劑的制備方法，該專利將 枯草芽孢桿菌和丁酸梭菌聯合使用，雖然能有效降低仔豬或蛋雞的腹瀉發生率，但其效果 仍有很大的提升空間，并且該菌劑的用量較大(添加量為飼料重量的〇. 5%)。中國專利申請 CN201410751336. 1公開了一種短小芽孢桿菌和蛭弧菌的液體制劑，該制劑能有效防治弧菌 引起的疾病，但該制劑是將兩種菌的液體發酵液直接混合后制得，不便于保存，并且某些蛭 弧菌菌株有可能對與其復合的菌種具有噬菌作用，采用不當的制備方法可能會大大降低菌 劑的活性。

【發明內容】

[0005] 基于以上技術現狀，本發明的目的在于提供一種丁酸梭菌和蛭弧菌復合菌劑，并 進一步提供其制備方法和應用，該復合菌劑兩種菌之間具有顯著的協同作用，對家禽腹瀉 的防治效果明顯優于各自單獨使用，本發明采用特殊的包埋工藝使該復合菌劑在保存時兩 種菌之間不會相互影響，可大大延長復合菌劑的保存時間，菌活損失小。
[0006] 本發明采用如下技術方案： 一種微生物復合菌劑，其特征在于其有效成分為丁酸梭菌和蛭弧菌。
[0007] 優選地，所述的微生物復合菌劑，其特征在于其包括菌數比為（1-10) :1的丁酸梭 菌和輕弧菌。
[0008] 具體地，所述蛭弧菌為噬菌蛭弧菌、斯托普蛭弧菌和斯塔爾蛭弧菌中的一種或多 種。
[0009] 所述的復合菌劑的制備方法，其特征在于其步驟如下： (1) 在LB液體培養基中接種大腸桿菌，培養，離心，收集菌體，100ml大腸桿菌培養液中 的菌體重新混懸在5-10ml的LB液體培養基中，接入蛭弧菌，于25-37°C、pH6. 0-8. 5下培養 36_48h，輕弧菌培養液于4°C、6000rpm下離心20min，棄沉淀，取上清液于4°C、16000rpm離 心20min，取沉淀，混懸于LB液體培養基中，制成濃度彡10ncfu/ml的輕弧菌濃縮液； (2) 將殼聚糖溶解于體積濃度1%的醋酸中，配制成濃度為5-10mg/ml的殼聚糖溶液，取 等體積的蛭弧菌濃縮液，與殼聚糖溶液混合均勻，得蛭弧菌混合液； (3) 在所述蛭弧菌混合液中逐滴加入三聚磷酸鈉水溶液，充分攪拌，制成蛭弧菌包埋 液，將該包埋液離心，取沉淀備用； (4) 將斜面培養的丁酸梭菌在RCM液體培養基中，于30-38°C、pH6. 5-7. 5下厭氧培養 24-48h，再接種于RCM液體培養基中，于30-38°C、pH6. 5-7. 5的環境下厭氧培養24-48h，得 丁酸梭菌培養液； (5) 將殼聚糖溶解于稀醋酸中，配制成殼聚糖溶液，按比例取丁酸梭菌培養液，與等體 積的殼聚糖溶液混合均勻，得丁酸梭菌混合液； (6) 將步驟（3)所得的沉淀加入所述丁酸梭菌混合液中，然后逐滴加入三聚磷酸鈉水溶 液，充分攪拌，制成復合菌液。
[0010] 優選地，所述稀醋酸的體積濃度為1%，殼聚糖溶液的濃度為5-10mg/ml，殼聚糖粘 均分子量為500-1800kd，三聚磷酸鈉水溶液的濃度為1mg/ml，步驟（3)中三聚磷酸鈉水溶 液用量為蛭弧菌混合液體積的1-2倍，步驟（6)中三聚磷酸鈉水溶液用量為丁酸梭菌混合 液體積的2-5倍。
[0011] 優選地，所述復合菌液經離心、干燥制成復合菌顆粒劑。
[0012] 上述微生物復合菌劑在治療家禽腹瀉中的應用。
[0013] 本發明的積極效果在于：本發明將丁酸梭菌和蛭弧菌聯合使用，二者之間產生顯 著的協同作用，對家禽腹瀉具有優異的防治效果，且具有菌劑用量少、見效快、無任何毒副 作用等優點。本發明選擇的雙層包埋的制備方法能很好地對兩種菌進行固定化，且消除了 存放過程中兩種菌之間的相互影響，最大程度地降低了菌活損失。
【具體實施方式】
[0014] 下面以具體實施例來對本發明技術方案進行詳細說明，顯然，以下實施例僅作為 本發明的優選方案，而不是對保護范圍的限制。
[0015]以下實施例中，丁酸梭菌來自中國工業微生物菌種保藏管理中心CICC，其保藏編 號是：丁酸梭菌N0. 10350,蛭弧菌來自中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏編 號為CGMCCNO. 1045,但本發明的保護范圍并不僅限于這兩種菌株，發明人在實驗過程中 選用了多種菌株進行試驗，其效果相當，這里僅用上述兩種菌株對技術方案進行詳細說明， 其他不再贅述。
[0016] 實施例1 (1) 在LB液體培養基中接種大腸桿菌，培養，離心，收集菌體，100ml大腸桿菌培養液 中的菌體重新混懸在l〇ml的LB液體培養基中，接入噬菌蛭弧菌，于25°C、pH6.0下培養 48h，輕弧菌培養液于4°C、6000rpm下離心20min，棄沉淀，取上清液于4°C、16000rpm離心 20min，取沉淀，混懸于LB液體培養基中，制成濃度1. 3X10ncfu/ml的蛭弧菌濃縮液； (2) 將殼聚糖（500kd)溶解于體積濃度1%的醋酸中，配制成濃度為5mg/ml的殼聚糖溶 液，取等體積的蛭弧菌濃縮液，與殼聚糖溶液混合均勻，得蛭弧菌混合液； (3) 取與所述蛭弧菌混合液等體積的1mg/ml的三聚磷酸鈉水溶液，逐滴加入到蛭弧菌 混合液中，充分攪拌，制成蛭弧菌包埋液，將該包埋液離心，取沉淀備用； (4) 將斜面培養的丁酸梭菌N0. 10350在RCM液體培養基(上海酶聯檢測技術有限公 司生產的RCM培養基原粉按照23g原粉加入1000ml水的比例，121°C高壓滅菌15min制成） 中，于30°C、pH6. 5下厭氧培養48h，再接種于RCM液體培養基中，于30°C、pH6. 5的環境下 厭氧培養48h，得丁酸梭菌培養液；該培養液中含菌量為5. 6X10scfu/ml。
[0017] (5)將殼聚糖（500kd)溶解于體積濃度1%的醋酸中，配制成濃度為5-10mg/ml的 殼聚糖溶液，按丁酸梭菌與蛭弧菌菌數比1:1取丁酸梭菌培養液，與等體積殼聚糖溶液混 合均勻，得丁酸梭菌混合液； (6)將步驟（3)所得的沉淀加入所述丁酸梭菌混合液中，然后取相當于所述丁酸梭菌混 合液2倍體積的1mg/ml的三聚磷酸鈉水溶液，充分攪拌，制成復合菌液，將該復合菌液離 心，沉淀經-40°C冷凍干燥后得復合菌顆粒劑。
[0018] 室溫下儲藏12個月，該復合菌顆粒劑中丁酸梭菌的菌活損失率為4. 3%，蛭弧菌的 菌活損失率為3. 5%。
[0019] 對比例1 (1) 在LB液體培養基中接種大腸桿菌，培養，離心，收集菌體，100ml大腸桿菌培養液中 的菌體重新混懸在5-10ml的LB液體培養基中，接入蛭弧菌，于25-37°C、pH6. 0-8. 5下培養 36_48h，輕弧菌培養液于4°C、6000rpm下離心20min，棄沉淀，取上清液于4°C、16000rpm離 心20min，取沉淀，混懸于LB液體培養基中，制成濃度彡10ncfu/ml的輕弧菌濃縮液； (2) 將斜面培養的丁酸梭菌在RCM液體培養基中，于30-38°C、pH6. 5-7. 5下厭氧培養 24-48h，再接種于RCM液體培養基中，于30-38°C、pH6. 5-7. 5的環境下厭氧培養24-48h，得 丁酸梭菌培養液，該培養液中含菌量為5. 6X10scfu/ml; (3) 按菌數比1:1取所述丁酸梭菌培養液和蛭弧菌濃縮液，其中蛭弧菌濃縮液離心后 取菌體，加入所述丁酸梭菌培養液中，取等體積的殼聚糖溶液(與實施例1中濃度及配制方 法相同)，混合均勻，得混合液； (4) 向步驟（3)的混合液中逐滴加入相當于所述混合液2倍體積的1mg/ml的三聚磷 酸鈉水溶液，充分攪拌，得復合菌液，沉淀經_40°C冷凍干燥后得復合菌顆粒劑。
[0020] 室溫下儲藏12個月，該復合菌顆粒劑中丁酸梭菌的菌活損失率為36. 8%，蛭弧菌 的菌活損失率為13. 1%。
[0021] 可見，采用本發明的方法能有效降低菌活的損失率。
[0022] 實施例2 (1) 在LB液體培養基中接種大腸桿菌，培養，離心，收集菌體，100ml大腸桿菌培養液中 的菌體重新混懸在5ml的LB液體培養基中，接入噬菌蛭弧菌，于30°C、pH8. 5下培養42h，蛭 弧菌培養液于4°C、6000rpm下離心20min，棄沉淀，取上清液于4°C、16000rpm離心20min， 取沉淀，混懸于LB液體培養基中，制成濃度1.OX10ncfu/ml的蛭弧菌濃縮液； (2) 將殼聚糖（1800kd)溶解于體積濃度1%的醋酸中，配制成濃度為10mg/ml的殼聚糖 溶液，取等體積的蛭弧菌濃縮液，與殼聚糖溶液混合均勻，得蛭弧菌混合液； (3 )取相當于所述蛭弧菌混合液2倍體積的1mg/ml的三聚磷酸鈉水溶液，逐滴加入到 蛭弧菌混合液中，充分攪拌，制成蛭弧菌包埋液，將該包埋液離心，取沉淀備用； (4)將斜面培養的丁酸梭菌N0. 10350在RCM液體培養基(上海酶聯檢測技術有限公 司生產的RCM培養基原粉按照23g原粉加入1000ml水的比例，121°C高壓滅菌15min制成） 中，于38°C、p