一株具有抑制產氣莢膜梭菌作用的枯草芽孢桿菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株具有抑制產氣莢膜梭菌作用的枯草芽孢桿菌及其應用。
【背景技術】
[0002] 壞死性腸炎是1961年在英國肉雞上發現并報道的，隨后在全球大多數家禽生 產國陸續報道。該病對全世界的畜禽生產具有重要的經濟影響，至今被廣泛研究。2011 年，鐘永慶在現代農業科技上指出，雞壞死性腸炎是由A型魏氏梭菌引起的一種急性散 發性傳染病，該菌在體內繁殖后，從大腸和盲腸向小腸迀移并在小腸產生毒素，從而引起 該病的發生。魏氏梭菌（Clostridiumwelchii)原名產氣莢膜梭狀桿菌（Clostridium Perfringengs,CP)，最初是由welchii和Nutall從一具腐敗的人類尸體產生氣泡的血管 中分離得到，命名為魏氏梭菌。據中國禽業導刊報道，關于該病，2005年以前僅有30多篇 報道，而最近3年報道占到總數的2/3,且呈現逐年增加的趨勢。該病對山東半島養雞行業 的沖擊最為嚴重，長江以南對該類疾病很少報道，幾篇相關報道也只是集中在貴州、湖南兩 地。該病的發生主要針對2~5周齡的幼禽，急性病程主要癥狀為采食量突然下降、精神沉 郁、翅下垂、腹瀉、增重率下降，有時突然死亡，有些病例平均每天死亡率可達1%。主要病灶 包括小腸下端腸皺壁的大面積壞死，并伴有肝臟及盲腸壞死。典型的壞死性腸炎對肉用雞 具有很高的致病率與死亡率，在經濟上對肉雞養殖業有很大的影響。目前主要通過硫酸新 霉素、硫酸粘菌素等抗生素進行治療，但這種方法容易造成耐藥性和藥物殘留問題。因此研 制安全有效而又價格低廉的產品是防治此病的關鍵。
[0003] 微生態制劑是一種新型活菌制劑，廣泛用于人類、動物和植物，利用動物體正常微 生物群成員，通過鑒定、培養、干燥等系列工藝制成的一種活菌制劑。益生菌作為活的微生 物制劑，當攝入充足數量時能改善腸道微生物系統，有利于宿主健康。益生菌作為一種特殊 的飼料添加劑或食材原料對動物的生長起到有利作用，可通過調節腸道菌群動態平衡來維 持宿主健康狀態。益生菌可作為抗生素替代物，其主要作用是提高動物對致病菌抵抗力的 同時能加強宿主的黏膜屏障作用，可減少動物體內致病菌的入侵，改善其健康狀態進而減 少食品中的食源性致病菌。Hara等人發現乳桿菌屬和雙歧桿菌屬細菌均可有效改善腸道疾 病。Takahashi等人發現仔豬飼料中添加屎腸球菌可使仔豬體重增加，免疫能力顯著提高， 且體內的大腸桿菌數量明顯減少，乳酸菌數量增多。益生菌還可降低新生兒壞死性腸炎的 發病率。Butel發現，將腸道雙歧桿菌定植到一對3日齡的雙胞胎中，可防治新生兒壞死性 小腸結腸炎的發生。Srinivas等人通過實驗證明，補充雙歧桿菌能夠降低新生大鼠壞死性 小腸結腸炎的發病率。Lin等人的研究表明，母乳喂養的同時添加微生態制劑可降低早產兒 壞死性小腸結腸炎的發病率并減緩癥狀。Caplan等人通過實驗證明，腸內雙歧桿菌定植后 可通過下調炎癥級聯反應等作用降低新生鼠發生壞死性腸炎的危險性。黃生樹等人用枯草 芽孢桿菌PB6代替抗生素來控制肉種雞壞死性腸炎，平均2X 106cfu/只，達到了良好的防 治效果。
[0004] 但是，不同芽孢桿菌的益生性能差異較大，篩選出新的具有較強抑制產氣莢膜梭 菌作用的枯草芽孢桿菌，對于開發新的用于壞死性腸炎疾病防治的藥物具有重要的意義。
【發明內容】

[0005] 針對上述現有技術中存在的不足，本發明的目的是提供一株具有抑制產氣莢膜梭 菌作用的枯草芽孢桿菌。
[0006] 本發明的另一目的是提供以該枯草芽孢桿菌為有效成分的微生態制劑在防治肉 雞壞死性腸炎中的應用。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：
[0008] -株具有抑制產氣莢膜梭菌作用的枯草芽孢桿菌，該菌株命名為枯草芽孢桿菌 (Bacillussubtilis)BLCCl_0155,于2015年05月07日保藏于位于中國武漢市武漢大學 的中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCCN0:M2015278。
[0009] 所述枯草芽孢桿菌BLCC1-0155的菌種生物學特性如下：菌落呈圓形或不規則 性，邊緣不整齊，表面有皺褶、粗糙，污白色或微帶黃色，有隆起；該菌種的細胞大小為 (0. 7ym~0. 8ym)X(2. 0ym~3. 0ym)，呈桿狀，染色均勻，無莢膜，鞭毛側生，能運動；芽 孢呈卵圓形或柱狀，中生或偏生，大小為0. 8ymX(1. 5ym~1. 8ym);游離孢子表面著色 弱；革蘭氏陽性，接觸酶陽性，能發生V-P反應；能利用葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇產 酸，能水解淀粉，分解色氨酸形成吲哚；生長溫度最高值45~55°C，最低值5~20°C，最適 溫度為37°C。
[0010] 本發明還提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為枯草芽孢桿菌BLCC1-0155。
[0011] 該菌劑具體可采用如下制備工藝，具體步驟為：
[0012]⑴菌種：選用枯草芽孢桿菌 BacillussubtilisBLCC1-0155,CCTCCN0:M 2015278 ；
[0013] (ii)斜面培養：將枯草芽孢桿菌BacillussubtilisBLCC1-0155的凍干粉菌種 接種于固體斜面培養基上，在32~40°C培養20~28h;
[0014] (iii) -級種子培養：將培養好的斜面，在無菌條件下用接種環接兩環于50mL~ 100mL種子液體培養基中，在32~40°C條件下，靜置培養14~18h，制得一級種子液；
[0015] (iv)擴大培養：以4-6 % (v/v)的接種量，將一級種子液接于500mL~1000mL種 子液體培養基中，在32~40°C條件下，靜置培養10~16h，制得二級種子液；
[0016] (v)發酵罐培養：以4-6% (v/v)的接種量，將二級種子液接于液體發酵培養基中， 于32~40°C條件下，靜置培養16~24h;
[0017] ( vi)收集發酵產物：待步驟（v)之發酵液黏度達12000~15000cP時，收集發 酵液；
[0018] ( vii)發酵結束后，立即將發酵液離心，菌體沉淀用生理鹽水清洗，如此反復2~3 遍后加入凍干保護劑冷凍干燥，粉碎，即為菌粉成品；或：發酵結束后，立即噴霧干燥，即得 菌粉成品；
[0019] 上述步驟（iii)、（iv)中所述種子液體培養基配方為：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/ L、酵母膏5g/L，使用時，調節pH至6. 5~7. 5,115°C條件下滅菌20min;步驟（ii)中所述 固體斜面培養基為上述種子液體培養基中添加1. 5~2. 0%的瓊脂粉；步驟（v)中所述 液體發酵培養基配方為：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L，氯化鈉5g/L，使用時，調 節pH至6. 5~7. 5〇
[0020] 所述菌株和/或菌劑在制備防治肉雞壞死性腸炎的微生態制劑中的應用也屬于 本發明的保護范圍。
[0021] 本發明還提供了一種用于預防和/或治療肉雞壞死性腸炎的微生態制劑，該微生 態制劑以枯草芽孢桿菌BLCC1-0155為有效成分。
[0022] 該微生態制劑為枯草芽孢桿菌BLCC1-0155的菌粉與玉米淀粉載體復配而成，復 配后微生態制劑中枯草芽孢桿菌BLCC1-0155的活菌數大于或等于lX10scfu/g。
[0023] 本發明的有益效果：
[0024] 本發明的枯草芽孢桿菌BLCC1-0155對產氣莢膜梭菌具有較強的抑制作用，同 時對雞大腸桿菌與金黃色葡萄球菌也具有抑制作用。動物試驗證明以枯草芽孢桿菌 BLCC1-0155為有效成分的微生態制劑產品能夠較好的預防肉雞的壞死性腸炎，減少壞死性 腸炎對肉雞腸道的傷害，并大大降低了死亡率，同時該微生態制劑產品還能夠提高肉雞的 日增重，是一種能夠應用于臨床的較為理想的預防肉雞壞死性腸炎的微生態制劑產品。
【附圖說明】
[0025] 圖1 :兩株枯草芽孢桿菌抑菌效果圖；
[0026] 圖2 :BLCC1-0155的菌落培養性狀；
[0027] 圖3 :BLCC1_0155的菌體形態（油鏡觀察）；
[0028] 圖4 :菌株BLCC1-0155的系統發育進化分析。
【具體實施方式】
[0029] 結合實施例對本發明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發明，并不對其內容進行限定。
[0030] 實施例1 :具有抑制產氣莢膜梭菌作用的枯草芽孢桿菌的分離鑒定
[0031] 1材料與方法
[0032] 1. 1 材料
[0033] 1. 1. 1 分離源
[0034] 泰安及周邊地區杜仲的枝條、根、葉、皮等。
[0035] 1. 1. 2分尚培養基
[0036] LB固體培養基：酵母膏0. 5%、蛋白胨l%、NaCl1%、瓊脂粉1.5%，pH值為7. 0; 以質量百分數計。
[0037] 1. 1. 3斜面培養基
[0038] 同1. 1. 2分尚培養基；
[0039] 1. 1. 4發酵培養基
[0040] 發酵培養基為LB液體培養基，成分為：酵母膏0. 5%、蛋白胨1%、NaCl1 %，pH值 為7.0;以質量百分數計。
[0041] 1.1. 5指示菌培養基
[0042] 大腸桿菌、金黃色葡萄球菌使用LB培養基進行培養，其培養基配方為：酵母膏 0.5%、蛋白胨l%、NaCl1%，以質量百分數計，pH值為7.0 ;
[0043] 產氣莢膜梭菌的培養：液體培養基使用液體硫乙醇酸鹽-HB5190培養基培養， 購買于青島海博生物技術有限公司；其固體培養基為胰蛋白胨一亞硫酸鐵一環絲氨酸 (TSC) -HB0253培養基，購買于青島海博生物技術有限公司。
[0044] 1. 1. 6 指示菌
[0045] 雞大腸桿菌078(購買于中國獸醫微生物菌種保藏管理中心，菌種編號