一種卵黃高磷蛋白磷酸肽富集方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種卵黃高磷蛋白磷酸肽富集方法，屬于提取純化分離領域。
【背景技術】
[0002] 蛋黃蛋白粉是蛋黃卵磷脂工業化生產的副產物，越來越來的學者對其進行了綜合 研究并取得了一些進展。卵黃高磷蛋白（Phosvitin，PV)是脫脂蛋黃蛋白粉中的主要含磷 蛋白，一級結構中含有217個氨基酸殘基，其中124個是絲氨酸殘基，約占總氨基酸殘基含 量的56%。已有眾多研究表明，卵黃高磷蛋白可與Ca 2+，Mg2+，Mn2+，Co2+，Sr2+，Fe 2+，Fe3+等 結合。由于卵黃高磷蛋白與金屬離子結合牢固，不易被水解，使得其生物學效價較低，不 利于營養吸收。現已證實，能與鈣形成可溶性絡合物的主要功能團是磷酸酰絲氨酸，所以 將磷酸酰絲氨酸殘基含量高的卵黃高磷蛋白進行水解，其水解產物卵黃高磷蛋白磷酸肽 (Phosvitin Phosphopeptides，PPPs)可作為很好的鈣吸收促進劑，不僅能增加 鈣在小腸內 的吸收及其在體內的蓄積，而且卵黃高磷蛋白磷酸肽誘導的鈣代謝無需維生素 D的參與， 且能促進鐵、鋅等離子的吸收。
[0003]目前關于卵黃高磷蛋白磷酸肽研究僅限于實驗室水平。常規的PPPs制備方法是 先從蛋黃粉中提取出卵黃高磷蛋白PV，然后對PV進行處理，純化得到PPPs。也有報道，是 先對蛋黃粉進行脫脂，然后對脫脂后的蛋黃粉進行處理得到粗多肽，再純化得到PPPs。采用 的純化方法為乙醇鈣沉淀法、膜分離法和離子交換樹脂等方法。乙醇鈣沉淀法雖然方法簡 單，但是有機試劑用量大，對環境有一定的污染；膜分離法膜污染情況嚴重，需要進行清洗 維護；離子交換樹脂法需要使用前和再生時進行處理，操作復雜。也有報道是磁納米顆粒富 集法進行純化的，但是磁納米顆粒不僅穩定性差（重復使用三次時已不能發生吸附），而且 洗脫過程中使用的咪唑溶劑不符合食品領域的應用。

【發明內容】

[0004] 為了克服目前卵黃高磷蛋白磷酸肽（Phosvitin Phosphopeptides，PPPs)，純化過 程中存在的上述問題，本發明一種卵黃高磷蛋白磷酸肽富集方法，直接以利用蛋黃卵磷脂 生產的副產物為原料，省去脫脂步驟，然后進行脫磷、酶解，制備粗多肽。本發明采用介孔/ 大孔 TiO2 (macro-mesoporous titanium dioxide，MMTD)為富集材料，直接將 PPPs 特異性 吸附出來，然后根據1102的性質進行洗脫（堿性條件下PPPs與TiO 2發生離子排斥反應）， 操作簡便、節省時間，不僅提高了吸附效率，也大大減少了生產成本。
[0005] 本發明提供了一種卵黃高磷蛋白磷酸肽富集方法，所述方法是先將蛋黃蛋白粉進 行部分脫磷處理，然后使用胰蛋白酶對部分脫磷后的蛋黃蛋白粉進行酶解，得到粗多肽，再 采用介孔/大孔TiO 2M料對粗多肽進行吸附，洗脫，即得到卵黃高磷蛋白磷酸肽。
[0006] 所述蛋黃蛋白粉，在本發明的一種實施方式中，是蛋黃卵磷脂生產中的副產物。
[0007] 所述吸附、洗脫，在本發明的一種實施方式中，是將粗多肽配制成濃度為6mg/ mL-22mg/mL的溶液，按每30mL粗多肽溶液加入Ig介孔/大孔1102材料，在pH 1. 0-6. 0下 震蕩吸附5-60min，然后過濾，洗滌濾渣以去除表面吸附的雜質，然后用堿性溶液將濾渣表 面富集的卵黃高磷蛋白磷酸肽進行洗脫。
[0008] 所述粗多肽溶液，在本發明的一種實施方式中，粗多肽濃度為12mg/mL-20mg/mL。
[0009] 所述pH，在本發明的一種實施方式中，pH 2. 5-4。
[0010] 所述吸附，在本發明的一種實施方式中，吸附時間為5-30min，優選5-20min。
[0011] 所述吸附，在本發明的一種實施方式中，是在15-25°C，150-220rpm進行。
[0012] 所述洗脫，在本發明的一種實施方式中，是使用0. 05-0. 20m〇L/L的NaOH溶液。
[0013] 所述吸附、洗脫，在本發明的一種實施方式中，條件是：pH為3.0,粗多肽濃度為 17mg/mL，吸附時間為20min。
[0014] 所述部分脫磷處理，在本發明的一種實施方式中，是采用堿法脫磷。
[0015] 所述部分脫磷處理，在本發明的一種實施方式中，是將蛋黃蛋白粉置于堿性溶液 中，攪拌處理，然后超濾除去磷酸根離子。在本發明的一種實施方式中，脫磷率為48-64%。
[0016] 所述部分脫磷處理，在本發明的一種實施方式中，具體是：將蛋黃蛋白粉置于 0. 1-0. 2mol/L的NaOH溶液中，37°C條件下攪拌3h進行堿法脫磷處理，將處理后的溶液進行 超濾除去磷酸根離子（超濾膜為3000K，回流口壓力為5~IOpsi，進口壓力為20~30psi)。
[0017] 所述酶解，在本發明的一種實施方式中，是將經脫磷處理的蛋黃蛋白粉（脫磷率 為48-64% )和水加入酶解反應器中，攪拌均勻，在37-50°C，pH 7. 0-9. 0條件下，加入胰蛋 白酶進行酶解；酶解結束后進行滅酶處理，得到含有PPPs的蛋黃蛋白水解多肽，即粗多肽； 所述底物蛋黃蛋白粉的濃度為〇. 5-2. 0%，酶：底物=1:20-1:200。在本發明的一種實施方 式，水解度為12%以上。
[0018] 所述酶解，在本發明的一種實施方式中，時間為0. 4-4h。優選50-100min。
[0019] 所述酶解，在本發明的一種實施方式中，是在50°C、pH 8的條件下進行，底物蛋黃 蛋白粉的濃度為1% (m/v)，酶與底物質量比為5:100。滅酶處理后，先調節pH至中性，再 冷凍干燥得粗多肽。
[0020] 所述介孔/大孔TiO2，在本發明的一種實施方式中，是采用溶膠凝膠法得到的。
[0021] 所述介孔/大孔TiO2，在本發明的一種實施方式中，是按照以下步驟制備得到的： 檸檬酸溶于乙醇中，攪拌，然后加入氨水溶液，繼續攪拌，之后將鈦酸四正丁酯在攪拌狀態 下，逐滴加入上述溶液，攪拌，然后靜置；然后依次用水和無水乙醇對沉淀進行清洗，將洗滌 后的材料干燥，最后將上述材料置于馬弗爐中進行煅燒；其中每〇. 3g的檸檬酸，加入ISmL 質量濃度為25% -28%的氨水和5mL鈦酸四正丁酯。
[0022] 所述介孔/大孔TiO2，在本發明的一種實施方式中，是按照以下步驟制備得到的： 每〇. 3g的檸檬酸溶于乙醇中，攪拌30min，然后加入質量濃度為25% -28%氨水溶液18mL， 繼續攪拌l〇min，之后將5mL鈦酸四正丁酯在攪拌狀態下，逐滴加入上述溶液，繼續攪拌lh， 然后靜置；然后依次用水和無水乙醇對沉淀進行清洗，將洗滌后的材料干燥，最后將上述材 料置于550°C煅燒4h。
[0023] 所述溶解檸檬酸的乙醇，在本發明的一種實施方式中，為40mL 95%無水乙醇。
[0024] 所述煅燒，在本發明的一種實施方式中，煅燒條件為550°C，4h。
[0025] 本發明還要求保護按照上述方法得到的卵黃高磷蛋白磷酸肽，以及其在食品方面 的應用。
[0026] 本發明的有益效果：
[0027] (1)本發明提供的卵黃高磷蛋白磷酸肽的富集方法操作簡單、分離純化周期較短， 適合工業化應用；從吸附、清洗到洗脫整個過程在1~3小時內完成；而常規乙醇沉淀法 時間為2-3個小時，膜分離法時間為4個小時，且步驟繁多，膜容易污染；（2)本發明方法 所得卵黃高磷蛋白磷酸肽產品的N/P為4. 3-5. 0,與目前報道方法得到的磷酸肽相比，純度 較高；（3)本發明方法還對現有的脫磷方法和酶解方法進行了改進，直接對蛋黃蛋白粉進 行堿法脫磷，脫磷率可達64%，酶解的水解度為15.67% ;同時采用具有規則的孔道結構與 較大的比表面積的介孔/大孔TiO2富集PPPs，吸附效率高，吸附量可達42-53mg/g(PPPs/ MMTD)，遠遠高于已有報道。
【附圖說明】
[0028] 圖1 :介孔/大孔1102材料的掃描電鏡。
【具體實施方式】 [0029] 脫磷率：
[0030] 根據GB/T 5009. 87- 2003,通過分光光度計法對脫磷前后的EYP進行磷含量的測 定。通過下述公式進行脫磷率的計算：
[0032] p :EYP 的脫磷率（％ )
[0033] Cpl:脫磷前EYP中磷的含量（mg/g)
[0034] Cp2:脫磷后EYP中磷的含量（mg/g)
[0035]水解度（DH):
[0036] 根據反應過程中記錄所消耗的NaOH溶液的體積，按下述公式進行計算：
[0038] DH :脫磷EYP的水解度（％ )
[0039] VNaffl:滴定過程中消耗的NaOH的體積（mL)
[0040] CNaffl:反應使用的NaOH的摩爾濃度（m〇L/L)
[0041] MP :底物中蛋白質的總量（g)
[0042] α :氨基酸解離度（50°C，pH = 8. 0 時，I/ a = L 13)
[0043] htot:每克蛋白質中肽鍵的克當量（8.38)
[0044] N/P ：
[0045] 計算方法如以下公式：
[0047] r :待測樣品中N和P的摩爾比
[0048] CN:待測樣品中N的含量（mg/g)
[0049] Cp:待測樣品中P的含量（mg/g)
[0050] 31 :P的相對分子質量
[0051] 14 :N的相對分子質量
[0052] 實施例1 :蛋黃蛋白粉部分脫磷方法
[0053] 將蛋黃蛋白粉置于0. 05-0. 2mol/L的不同濃度的NaOH溶液中，37°C條件下攪拌3h 進行堿法脫磷處理，將處理后的溶液進行超濾除去磷酸根離子（超濾膜為3000K，回流口壓 力為5~lOpsi，進口壓力為20~30psi)，比較了不同濃度的NaOH溶液處理下蛋黃蛋白粉 的脫磷率。
[0054] 結果顯示 0· 05mol/LNa0H，脫磷率為 27%;0· Imol/LNaOH，脫磷率為 46%;0· 15mol/ L時，脫磷率為53% 2mol/L時，脫磷率為64%。
[0055] 實施例2 :部分脫磷的蛋黃蛋白粉的酶解
[0056] 對部分脫磷處理的蛋黃蛋白粉進行酶解，結果發現脫磷率低，導致水解度低。但是 如果脫磷過度，得到的PPPs持鈣功能降低。所以選用脫磷率在46 % -64 %的脫磷后的蛋黃 蛋白粉進行酶解。
[0057] 酶解過程如下：將脫磷蛋黃蛋白粉和去離子水加入酶解反應器中（底物濃度為 1 % )，50°C水浴循環加熱，待溶液攪拌均勻后，調節pH至8. 0,將一定量的胰蛋白酶加入上 述溶液（酶：底物=5 :100)，反應過程中用0. lmol/L的NaOH溶液進行滴定，維持pH為8.0， 反應時間4h。酶解結束后將上述反應溶液置于90°C條件下，IOmin處理進行滅酶處理，冷卻 后將酶解液PH調至7. 0。最后將酶解液進行冷凍干燥得到含有PPPs的蛋黃蛋白水解多肽 (簡稱粗多肽）。采用脫磷率在64%的蛋黃蛋白粉的酶解的水解度為15. 67%。而且在Ih 內就可以得到14%以上的水解度。
[0058] 實施例3 :介孔/大孔1102材料的制備