一種nad發酵液的生產方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及發酵技術領域，尤其涉及一種NAD發酵液的生產方法。
【背景技術】
[0002] 煙酰胺腺嘌呤二核苷（NAD)是有機體必不可少的多功能小分子，主要作為氧化還 原酶的重要輔酶和NADP的來源。NAD(H)參與的多酶氧化還原體系是生物體細胞呼吸鏈中 電子傳遞過程的主要生物氧化體系，糖、脂、蛋白質三大代謝物質分解中的氧化反應絕大部 分也都是通過這一體系完成的。NAD +、NADP、NADH和NADPH共同作為氫化物的受體和供體， 在細胞的能量代謝中起著關鍵的作用，在醫藥領域具有巨大應用價值。
[0003] 目前NAD生產主要通過兩種途徑：（1)生物催化合成，現代的生物催化技術模擬 了生物體內利用酶來完成的反應，這種的模擬條件是嚴格根據生物體內的代謝特征來進行 的，所以條件苛刻、產量低、價格昂貴；（2)酵母直接發酵合成，以葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、 硫酸銨等配制的培養基經過發酵獲得酵母菌，然后經過破壁等工藝分離獲得，發酵罐中NAD 的產量約為lg/1，NAD含量低也是導致目前NAD市場價格高昂的重要原因。
[0004] 福壽螺屬軟體動物，外觀與田螺極其相似，個體大、食性廣、適應性強、生長繁殖 快、產量高。1981年引入中國，目前已被列入中國首批外來入侵物種。在廣東、廣西等地都 有大量分布，嚴重威脅水稻等農作物的種植，每年為殺死福壽螺所需的農藥人工等成本數 億元。食用未充分加熱的福壽螺，可能引起廣州管圓線蟲等寄生蟲在人體內感染，可引起頭 痛、發熱、頸部僵硬等癥狀，嚴重者可致癡呆，甚至死亡。因此，合理開發，高價值利用福壽螺 資源具有重要的經濟效益和社會效益。
[0005] 木薯屬于非糧作物，其根莖富含淀粉，是灌木狀多年生作物，適應性強，耐旱耐瘠， 在旱地農業中起著日益重要的作用，在我國廣西、海南以及廣東農村種植廣泛，產量大，市 場價格低，應用成本低。

【發明內容】

[0006] 基于【背景技術】存在的技術問題，本發明提出了一種NAD發酵液的生產方法，本發 明以福壽螺、木薯為原料，廉價易得，成本低，緩解了福壽螺帶來的生態問題，保護環境，大 大增加了發酵液中NAD的積累量，NAD的積累量達到4. 5-6. 5g/l，且操作簡單，適合工業化 生產。
[0007] 本發明提出的一種NAD發酵液的生產方法，包括如下步驟：
[0008] S1、制備福壽螺軟組織蛋白溶出物：將福壽螺軟組織碎末和枯草桿菌中性蛋白酶 溶液混勻，酶解，過濾，取上清液干燥得到福壽螺軟組織蛋白溶出物；
[0009] S2、制備木薯糖化液：將木薯粉與水混勻，加 α -淀粉酶進行液化后，加糖化液進 行糖化得到木薯糖化液；
[0010] S3、發酵：將福壽螺軟組織蛋白溶出物與木薯糖化液混勻得到溶液Α，加入維生素 復合液混勻得到溶液Β，滅菌，冷卻至室溫，加入發酵菌種，升溫至28-32Γ，保溫36-48h得 到NAD發酵液，其中，福壽螺軟組織蛋白溶出物與木薯糖化液的重量比為1 :30-50,維生素 復合液與溶液A的體積比為0. 8-1. 2 :200,發酵菌種與溶液B的體積比為3-5 :100。
[0011] 優選地，Sl中，將福壽螺軟組織碎末和濃度為4-6wt%的枯草桿菌中性蛋白酶溶 液混勻，升溫至50-54Γ，保溫6-7h后，過濾，取上清液，噴霧干燥得到福壽螺軟組織蛋白溶 出物，其中，福壽螺軟組織碎末和枯草桿菌中性蛋白酶溶液的重量比為1 :20-30。
[0012] 優選地，Sl中，枯草桿菌中性蛋白酶溶液的溶劑為pH = 7. 0-7. 3的磷酸鹽緩沖液， 其中，磷酸鹽緩沖液含有 130-140mmol/l 的 NaCl、2. 4-3mmol/l 的 KCl、l-2mmol/l 的 NaH2PO4 和 7-9mmo 1/1 的 Na2HP04。
[0013] 優選地，S2中，將木薯粉與水混勻，升溫至75-80°C，保溫30-40min，保溫過程中不 停攪拌，加 α -淀粉酶，保溫20-25min，升溫至93-95°C，保溫70-80min，降溫至55-56°C，加 糖化液，保溫45-50min，調節可溶性糖濃度至10-15wt%得到木薯糖化液。
[0014] 優選地，S2中，木署粉與水的重量比為1 :4_5,木署粉與α -淀粉酶的重量比為1 : 0. 003-0. 005,木薯粉和糖化液的重量比為1 :0. 03-0. 04。
[0015] 優選地，S2中，糖化液是糖化酶活性為4000-6000IU/g的溶液。
[0016] 優選地，S3中，將福壽螺軟組織蛋白溶出物與木薯糖化液混勻得到溶液A，加入維 生素復合液混勻得到溶液B，升溫至121-125Γ，保溫15-20min進行滅菌，冷卻至室溫，加入 發酵菌種，置于速度為150_200rpm的搖床上，升溫至28-32°C，保溫40-44h得到NAD發酵 液，其中，福壽螺軟組織蛋白溶出物與木薯糖化液的重量比為1 :35-45，維生素復合液與溶 液A的體積比為0. 9-1. 1 :200,發酵菌種與溶液B的體積比為3. 5-4. 5 :100。
[0017] 優選地，S3中，發酵菌種采用釀酒酵母。
[0018] 優選地，S3中，活化釀酒酵母，將種子培養基置于速度為ISOrpm的搖床上，室溫 至28-32Γ，保溫48h擴大培養得到發酵菌種，其中，種子培養基含有40-60g/l的葡萄糖、 10-30g/l的酵母膏、10-30g/l的蛋白胨和4-8g/l的硫酸銨。
[0019] 優選地，S3中，維生素復合液含有0. 03-0. 04g/l的維生素 H、0. 5-0. 8g/l的煙酸、 0. 2-0. 5g/l的煙堿、10-15g/l的肌醇、0. 1-0. 15g/l的對氨基苯甲酸、I. 5-2g/l的硫胺素和 1. 5-3g/l的吡哆醇。
[0020] 上述枯草桿菌中性蛋白酶的活性為50000IU/g，α -淀粉酶活性為5000-8000IU/ g，糖化酶的活性為IU/g。
[0021] 上述釀酒酵母來自中國工業微生物菌種保藏管理中心，菌株保藏編號為 ClCOlH
[0022] 本發明用枯草桿菌中性蛋白酶水解福壽螺軟組織得到的蛋白溶出物中含有大量 色氨酸，色氨酸是合成NAD的主要前提物質；選用的木薯粉含有豐富的淀粉，經液化、糖化 得到木薯淀粉水解糖作為發酵生產NAD的碳源；發酵時，維生素復合液中的硫胺素和吡哆 醇是酵母合成NAD中間產物的類似物，能夠高效刺激合成NAD關鍵酶煙酸磷酸核糖轉移酶 NAPRTase的過量表達，在發酵過程中能夠有效促進NAD的大量積累；各物質相互配合，在合 適的工藝條件下大大增加了發酵液中NAD的積累量，NAD的積累量達到4. 5-6. 5g/l ;福壽螺 是農田重要的有害生物，本發明合理利用福壽螺，緩解了福壽螺帶來的生態問題，保護了環 境，且福壽螺和木薯廉價易得，成本低，增加了本發明的經濟和社會效益；操作簡單，適合工 業化大生產。
【具體實施方式】
[0023] 下面，通過具體實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。
[0024] 實施例1
[0025] -種NAD發酵液的生產方法，包括如下步驟：
[0026] S1、制備福壽螺軟組織蛋白溶出物：將福壽螺軟組織碎末和濃度為4wt%的枯草 桿菌中性蛋白酶磷酸鹽緩沖液按重量比為1 :30混勻，升溫至50°C，保溫7h后，過濾，取 上清液，噴霧干燥得到福壽螺軟組織蛋白溶出物，其中，磷酸鹽緩沖液的pH = 7. 0,含有 140mmo1 /1 的 NaCl、2. 4mmoI /1 的 KCl、2mmo 1/1 的 NaH2POz^P 7mmo1 /1 的 Na 2ΗΡ04;
[0027] S2、制備木薯糖化液：將木薯粉與水混勻，升溫至80°C，保溫30min，保溫過程中不 停攪拌，加 α -淀粉酶，保溫25min，升溫至93°C，保溫80min，降溫至55°C，加糖化酶活性為 6000IU/g的糖化液，保溫45min，調節可溶性糖濃度至15wt%得到木薯糖化液，其中，木薯 粉與水的重量比為1 :4,木薯粉與α -淀粉酶的重量比為1 :〇. 〇〇5,木薯粉和糖化液的重量 比為 1 :0· 03 ;
[0028] S3、發酵：將福壽螺軟組織蛋白溶出物與木薯糖化液混勻得到溶液Α，加入含有 0. 04g/l的維生素 H、0. 5g/l的煙酸、0. 5g/l的煙堿、10g/l的肌醇、0. 15g/l的對氨基苯甲 酸、I. 5g/l的硫胺素和3g/l的吡哆醇的維生素復合液混勻得到溶液B，升溫至122°C，保溫 20min進行滅菌，冷卻至室溫，加入發酵菌種，置于速度為150rpm的搖床上，升溫至32°C，保 溫36h得到NAD發酵液，其中，福壽螺軟組織蛋白溶出物與木薯糖化液的重量比為1 :50,維 生素復合液與溶液A的體積比為0. 8 :200,發酵菌種與溶液B的體積比為5 :100,發酵菌種 是活化釀酒酵母，將含有40g/l的葡萄糖、30g/l的酵母膏、10g/l的蛋白胨和8g/l的硫酸 銨的種子培養基置于速度為ISOrpm的搖床上，室溫至28°C，保溫48h擴大培養得到發酵菌 種。
[0029] 實施例2
[0030] -種NAD發酵液的生產方法，包括如下步驟：
[0031] S1、制備福壽螺軟組織蛋白溶出物：將福壽螺軟組織碎末和濃度為6wt%的枯草 桿菌中性蛋白酶磷酸鹽緩沖液按重量比為1 :20混勻，升溫至54°C，保溫6h后，過濾，取 上清液，噴霧干燥得到福壽螺軟組織蛋白溶出物，其中，磷酸鹽緩沖液的pH = 7. 3,含有 130mmol/l 的 NaCl、3mmol/l 的 KCI、1mmo 1 /1 的 NaH2POz^P QmmoI /1 的 Na 2ΗΡ04;
[0032] S2、制備木薯糖化液：將木薯粉與水混勻，升溫至75°C，保溫40min，保溫過程中不 停攪拌，加 α -淀粉酶，保溫20min，升溫至95°C，保溫70min，降溫至56°C，加糖化酶活性為 400011]/^的糖化液，保溫50!^11，調節可溶性糖濃度至10被％得到木薯糖化液，其中，木薯 粉與水的重量比為1 :5,木薯粉與α -淀粉酶的重量比為1 :〇. 〇〇3,木薯粉和糖化液的重量 比為 1 :0· 04 ;
[0033] S3、發酵：將福壽螺軟組織蛋白溶出物與木薯糖化液混勻得到溶液Α，加入含有 0.03g/l的維生素 H、0.8g/1的煙酸、0. 2g/l的煙堿、15g/l的肌醇、0. lg/Ι的對氨基苯甲 酸、2g/l的硫胺素和I. 5g/l的吡哆醇的維生素復合液混勻得到溶液B，升溫至125°C，保溫 15min進行滅菌，冷卻至室溫，加入發酵菌種，置于速度為200rpm的搖床上，升溫至28°C，保 溫48h得到NAD發酵液，其中，福壽螺軟組織蛋白溶出物與木薯糖化液的重量比為1 :30,維 生素復合液與溶液A的體積比為I. 2 :200,發酵菌種與溶液B的體積比為3 :100,發酵菌種 是活化釀酒酵母，將含有60g/l的葡萄糖、10g/l的酵母膏、30g/l的蛋白胨和4g/l的硫酸 銨的種子培養基置于速度為ISOrpm的搖床上，室溫至32°C，保溫48h擴大培養得到發酵菌 種。
[0034] 實施例3
[0035] -種NAD發酵液的生產方法，包括如下步驟：
[0036] S1、制備福壽螺軟組織蛋白溶出物：將福壽螺軟組織碎末和濃度為4. 5wt%的枯 草桿菌中性蛋白酶磷酸鹽緩沖液按重量