一種可控性的核酸抽提法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術和醫學領域，特別涉及一種可控性的核酸抽提法。
【背景技術】
[0002]近年來血清或血漿中的核酸分析在疾病的早期檢測和應用方面顯示了很多優勢。傳統的血清或血漿的核酸抽提法，對小量的血清或血漿樣本限制很多，同時處理樣本時使用蛋白酶，既造成了樣本核酸抽提不穩定性，也因為酶的作用，損失了相當大的比例的核酸成分，使用起來限制多，又很不方便。有些基因的突變，在大的非突變基因的背景中，根本檢測不到，沒有好的濃縮方法。已報道的磁珠核酸抽提法，是直接將磁珠試劑加入到試樣中，一方面磁珠容易損壞核酸樣本，另一方面，結合前處理(如:高溫處理)會破壞和降低磁珠的結合效率。有報道稱，磁珠抽提核酸法容易隨機丟失大量的核酸樣本，無法有效控制所需檢測基因的核酸抽提的質和量。

【發明內容】

[0003]本發明的目的是為解決上述問題而提供了一種可控性的核酸抽提法，可以從血清或血漿或生物體液中利用可控性探針和特異性磁珠相結合，來提取所需核酸的方法。
[0004]本發明所采用的技術方案是:
[0005]一種可控性的核酸抽提法，包括以下步驟:
[0006](I)將特殊標記的核酸探針加入需要抽提核酸的試樣中，讓所述核酸探針與所述試樣中的核酸相結合；
[0007](2)將可以與上述(I)中的核酸探針相結合的修飾磁珠加入到步驟(I)所述的試樣中，使所述核酸探針的標記部位與磁珠表面的修飾物相結合；
[0008](3)用磁場吸附和收集上述磁珠，從而所述試樣中的核酸樣本也得到富集、分離和抽提；
[0009](4)將核酸樣本從磁珠或磁鐵上釋放出來，用于各種核酸檢測和分析。
[0010]進一步地，所述特殊標記的核酸探針在普通的核酸探針上加上一個或多個特定的化學分子結構。
[0011]優選地，所述特定的化學分子結構是可以和磁珠或磁珠表面的修飾物在一定的條件下相結合的；所述特定的化學分子結構為生物素(B1tin)，可以和磁珠表面的親和素(Strepavidin)穩定結合。
[0012]優選地，所述特殊標記的核酸探針包括脫氧核糖核酸、核糖核酸探針及兩者的雜交結構、或生物代替物的探針，探針序列包括隨機探針序列和特異性核酸探針序列。
[0013]優選地，所述試樣包括血清、血漿、體液、各種試劑液或由細胞或組織由來的細胞裂解液。
[0014]進一步地，所述核酸探針與所述試樣中的核酸相結合適合有高溫處理，酸堿處理以及急速冷卻處理，結合穩定并有特異性等特點。
[0015]進一步地，所述磁珠表面修飾物指的是能和探針標記物相結合的分子結構，包括親和素(Strepavidin)，該種結合是可以在一定條件(酶處理，高溫處理和試劑處理)下分開。
[0016]優選地，所述磁場包括使用電磁鐵、永久磁鐵或兩者兼用。
[0017]進一步地，所述步驟(4)的從磁鐵或磁珠上釋放核酸產物的方法，包括酶切反應，加溫和試劑處理。
[0018]進一步地，所述步驟(4)從磁鐵上，釋放磁珠或核酸時，可在磁鐵上套上非磁性套，使要捕獲的磁珠體，先結合在插有磁鐵的塑料套表面，當抽去磁鐵后，磁珠體就容易釋放下來。
[0019]進一步地，所述試樣中的核酸包括使用標記的隨機核酸探針抽提全脫氧核糖核酸，全核糖核酸以及小分子核糖核酸，使用標記的特殊核酸序列結構的定位核酸探針抽提特定基因或相應核酸序列結構的目標核酸，包括大分子和小分子核酸分子。
[0020]進一步地，使用特殊核酸序列結構的定位核酸探針，可以從抽提好的核酸試樣中，濃縮所需核酸。
[0021 ] 該方法的發明原理核心是用標記好的核酸探針，加入到試驗樣本中，與樣本中的核酸結合。核酸探針的標記可以結合到磁珠表面的修飾物，此時加入該種磁珠到樣本中，就可以與核酸探針的標記部位相結合，用磁場吸附原理，吸附磁珠，所需的核酸樣本也就從試樣中被抽提出來，直接作為樣本檢測核酸，或作收集后處理，獲得純化的目的核酸。
[0022]本發明具有以下優點:
[0023]本發明方法的最大優點是抽提不同樣本中的核酸時具有可控性，通過標記探針的設計，可以控制抽提核酸的質和量(全核糖核酸，全脫氧核糖核酸，特定基因核酸、所需抽提核酸的量)以及最終獲得核酸樣本的純度，特別是對小量樣本可以有效地抽提所含核酸樣本，試樣可以是少量的血清、血漿、各種體液或少量的細胞液或細胞裂解液等。與其他磁珠法相比，該方法第一步加入試樣中的是標記的核酸探針，適合于高溫和酸堿等不同的物理和化學處理，不損傷后續加入的磁珠性能，既可用于抽提核酸樣本，又可用于濃縮目的核酸樣本。該方法過程簡單，容易操作，容易實現儀器自動化，不需作蛋白酶處理，極大地降低了樣本中的核酸丟失，特別是核酸結合蛋白中的核酸丟失。該方法可用于全脫氧核糖核酸、全核糖核酸、大小分子核酸和目的基因的抽提、濃縮。
【附圖說明】
[0024]圖1為本發明實施示例I提供的一種可控性的核酸抽提法的原理圖；
[0025]圖2為本發明方法抽提到的血漿中游離DNA ；
[0026]圖3為實施例4中磷脂酰肌醇3-激酶基因外顯子9和20的檢測圖。
【具體實施方式】
[0027]下面結合附圖和實施方式對本發明做進一步詳細的說明。
[0028]實施例1
[0029]本實施例提供了一種可控性的核酸抽提法。
[0030]參照圖1，正常人和疾病患者的血漿中有各種游離的核酸分子(圖1步驟1:a, b, c,單鏈或雙鏈，蛋白結合或非結合的)，加入生物素(B1tin)的核酸探針后(圖1中①)，充分混合，加熱處理后，立即放置在冰上，急速降溫，核酸探針就會和核酸樣本隨機相結合(圖1步驟2);加入親和素修飾的磁珠(圖1中②)至上述樣本中，混合，生物素就和親和素相結合(圖1步驟3);在磁場的作用下(圖1中③)，磁珠被吸附，富集(圖1步驟4);此時抽離磁鐵或同時加入釋放磁鐵(圖1中④)，富集的磁珠產物就從磁鐵的套上，釋放下來(圖1步驟5)，可以收集到純的磁珠產物(圖1中⑤，步驟6)。加溫處理(60-90度)，生物素和親和素的結合破裂，隨機探針在高溫下也會失去和相應核酸樣本的結合，從而釋放帶有生物素或更純的核酸樣本，作后續核酸分析之用。圖2中箭頭所指，從乳腺癌患者血漿中抽提的游離DNA (圖2)。
[0031]實施例2
[0032]用隨機RNA探針抽提血漿中的游離核酸。
[0033]2.1取100毫微升血漿，加入10毫微升的B1tin標記了的RNA隨機探針。混合均勻后，加熱、冷卻處理，然后放置在冰上。
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