一組耐螯合劑乙二胺四乙酸的重組堿性木聚糖酶及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于工業酶開發利用領域，特別涉及一組耐螯合劑乙二胺四乙酸（EDTA) 的重組堿性木聚糖酶和其編碼基因，及其構建方法。 技術背景
[0002] 造紙工業是世界上六大污染工業之一，我國造紙行業年排放廢水量達40萬噸，占 全國工業廢水排放量的1 / 6。多年來，人們不懈地努力，試圖開發出無污染和高效率的制 漿造紙新工藝，以減少污染，保護環境。造紙工藝中的制漿和漂白工序是污染物產生的主要 工序。生物技術可以幫助解決這些問題，其中最具吸引力和挑戰性的是生物制漿和生物漂 白。因為造紙工業廢水主要由蒸煮黑液和漂白廢液組成，采用生物制漿和生物漂白可以有 效減少這些廢液的產生。傳統的化學漂白法是采用多段的氯/二氧化氯漂白及堿提取來去 掉木質素，在廢水中會含有大量含氯的、致癌致畸的物質，如呋喃、二噁英等，造成嚴重的環 境污染和生態破壞。80年代初，西方工業國家工業污染控制戰略出現了重大變革，以污染預 防取代了污染治理。芬蘭率先將生物漂白技術引進紙漿造紙工業中。用木聚糖酶對紙漿進 行預漂白，可以減少隨后的化學漂白用氯量30 %-40 %，廢液中有機氯化物與毒化物含量 顯著減少。酶法助漂新工藝在歐洲和北美的30余家大型紙廠得到應用，成為生物技術在造 紙工業應用最成功的一例。采用基因工程與蛋白質工程手段獲得性質優良的耐熱耐堿耐化 學試劑的木聚糖酶已成為各相關實驗室的研究熱點。
[0003] 木聚糖是一種多聚五碳糖，是植物細胞中主要的半纖維素成分。木聚糖酶是可將 木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶，它在飼料、造紙、食品、能源工業和環境科學上有 著廣闊的應用前景。目前一些國家已經開展使用木聚糖酶漂白紙漿，如歐洲、北美、南美、日 本等，將酶作為工業漂白預漂劑。木聚糖酶助漂新工藝已成為發達國家造紙工業中較為成 熟的生物技術，在加拿大有超過10%的硫酸鹽漂白漿采用了木聚糖酶漂白。1986年，在國 際造紙工藝生物技術研討會上，芬蘭人Viikari等首次報道，松木和樺木Kraft楽經過木 聚糖酶預處理后可以降低漂白氯耗，提高白度。
[0004] 本發明前期研究的堿性木聚糖酶基因 XynA來源于短小芽孢桿菌Baci I Ius pumilus，含有687bp的開放閱讀框，編碼228個氨基酸，通過信號肽預測工具SignalP分 析，顯示該氨基酸序列含有27個氨基酸的信號肽。將該基因的成熟片段xynA-M在大腸桿 菌中進行了表達，表達所得成熟木聚糖酶經純化后進行酶學性質的研究表明，這種堿性木 聚糖酶在pH9. 2、60°C和5mMEDTA條件下，酶活顯著降低。
[0005] 在工業應用中，大部分堿性木聚糖酶不具備耐螯合劑乙二胺四乙酸（EDTA)的能 力，在造紙漂白工藝中，據芬蘭統計，其國內超過1 / 2的化學漿廠和2 / 3的機械漿廠在 使用螯合劑。隨著 TCF (Total Chlorine Free)和 ECF (Elemental Chlorine Free)漂白流程 以及水封閉循環的更廣泛應用，EDTA在全世界的用量有不斷增加的趨勢，對螯合劑的研究 也得到更多地重視，因此，獲得更多高效、穩定的耐EDTA的堿性木聚糖酶有利于推動木聚 糖酶在溶解紙漿和漂白紙漿生產中發揮重要作用。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的是提出一組高效、穩定的耐乙二胺四乙酸（EDTA)的重組堿性木聚 糖酶及編碼基因，及其構建方法。
[0007] 本發明是這樣實現的。在GenBank收錄號EU421717. 1中含有的木聚糖酶基因 xynA，對應木聚糖酶XynA的氨基酸序列收錄號為ACA00160. 1，除去N-段的27個氨基酸信 號肽，剩下的201個氨基酸是該木聚糖酶的成熟片段XynA-M，對應的木聚糖酶基因成熟片 段是xynA-M。針對xynA-M，分別設計點突變引物（FP1 :、1^14?2、1^2、？?3和1^3，序列如 下）進行定點誘變。利用突變引物FPl和RPl將公布的基因56、57位的鳥嘌呤G分別變成 腺嘌呤A和胸腺嘧啶T，利用突變引物FP2和RP2將公布的基因將56、57位的鳥嘌呤G分 別變成胸腺嘧啶T和胞嘧啶C，利用突變引物FP3和RP3將公布的基因將55、56和57位的 胸腺嘧啶T、鳥嘌呤G分別變成胞嘧啶C、腺嘌呤A和胞嘧啶C，使得編碼的木聚糖酶的成熟 肽第19位的色氨酸W分別突變成酪氨酸Y、苯丙氨酸F和組氨酸H，獲得一組耐5~IOmM EDTA 的重組堿性木聚糖酶基因 xynA-M-W19Y、xynA-M-W19F 和 xynA-M-W19H。
[0008] 重組堿性木聚糖酶基因 xynA-M_W19Y的氨基酸序列具體如下：
[0011] 其G、G分別變A、T的DNA序列如下：[0012]
[0009]
[0010]
[0013] 重組堿性木聚糖酶基因 xynA-M-W19的氨基酸序列具體如下：
[0014]
[0015] 其G、G分別變T、C的DNA序列如下：
[0016]
[0017] 重組堿性木聚糖酶基因 xynA-M-W19H的氨基酸序列具體如下：
[0018]
[0019] 其T、G、G分別變C、A、C的DNA序列如下：
[0020]
[0022] 本發明的重組堿性木聚糖酶蛋白質XynA-M-W19Y、XynA-M_W19F和XynA-M_W19H構 建方法，具體包括如下步驟：
[0023] 1)采用化學全合成或PCR方法克隆得到xynA (收錄號ACAOO160. 1)，其氨基酸序 列如下面SEQ NO. 1所示：
[0024] SEQ No. 1
[0025]
[0026] 其中，該酶基因編碼201個氨基酸，N端27個氨基酸為信號肽序列如下面SEQ NO. 3 所不：
[0027] SEQ No. 3
[0028] 1MNLKRLRLLF VMCIGFVLTL TAVPAHA27
[0029] 因此，成熟的堿性木聚糖酶XynA-M理論分子量為22KDa，其氨基酸序列如下面SEQ NO. 2所示：
[0030] SEQ No. 2
[0031]
[0032] 設計引物FP和RP，并分別引入BamHI、HindiII酶切位點，采用PCR方法分離克隆 了成熟木聚糖酶基因 xynA-M，全長606個堿基（包括終止密碼子），將基因 xynA-M用限制 性內切酶BamHI和HindlII酶切處理，瓊脂糖凝膠電泳膠回收，得到酶切產物xynA-M ;
[0033] FP ：CGCGGATCCGAGACAATCTACGACAACCG
[0034] RP ：CCCAAGCTTCTGCAGTTATCTGCCGATC
[0035] 2)將步驟1)獲得的酶切產物xynA-M連接到用兩種同樣限制性內切酶酶切過的大 腸桿菌表達載體pET28a (+)上，得到重組載體pET28a-xynA-M ;
[0036] 3)分別設計將成熟肽的第19位氨基酸W突變成Y的點突變引物FPl和RP1，將第 19位氨基酸W突變成F的點突變引物FP2和RP2,以及將第19位氨基酸W突變成H的點突 變引物FP3和RP3 :
[0037] FPl :5' CTTCGAGCTGTATAAGGACTACGGCAACACGAGCATGACGCTG3'
[0038] RPl :5, TCATAGCCGCTGTGCGTGCCGATGCGGTTG3'
[0039] FP2 :5, CTTCGAGCTGTTCAAGGACTACGGCAACACGAGCATGACGCTG3'
[0040] RP2 :5, TCATAGCCGCTGTGCGTGCCGATGCGGTTG3'
[0041] FP3 :5, CTTCGAGCTGCACAAGGACTACGGCAACACGAGCATGACGCTG3'
[0042] RP3 :5' TCATAGCCGCTGTGCGTGCCGATGCGGTTG3'
[0043] 將步驟2)獲得的重組載體pET28a-xynA_M作為模板進行全質粒反向PCR，體系為： 5XFast Pfu Buffer，10y I ;dNTP，5y 1 ;模板 pET28a-xynA，0. 3μ 1 ;10μΜ 的點突變引物 卩？$?1、卩？2、卩卩3)和1^〇^1、1^2、1^3)各1.5以1，卩&8七？包，0.5以1，加滅菌(1(1!120至5(^1。 (空白對照：將以上體系中的DNA模板換成ddH20,其他不變）
[0044] PCR 擴增條件為 95°C / 2 分鐘；95°C / 30 秒，55°C / 30 秒，72°C / 3 分鐘，35 個 循環；72°C / 10 分鐘，4°C / ^。
[0045] 4)將步驟3)獲得的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，用PCR產物回收試劑盒 回收PCR片段，用限制性內切酶DpnI和T4多聚核苷酸激酶（PNK)對回收的PCR片段 進行模板消解和磷酸化，體系為：DpnI, 1 μ I ;PNK，1 μ 1，IOXFerments Digest Buffer, 2 μ I ;dATP2 μ I ;PCR 片段，10 μ 1，加滅菌 ddH20 至 20 μ 1。37 °C 處理 12 小時，70 °C 處 理 15 分鐘滅活后，向上述體系中加入 T4Ligase Bufier，ly I ;PEG4000，ly I ;T4Ligase， ΙμL。置于22°C金屬浴保溫30分鐘后，直接轉化到大腸桿菌BL21(DE3)表達感受態 細胞中，各挑選兩個轉化子經測序驗證后，分別得到含點突變的重組載體的重組菌株 BL21(DE3)/pET28a-xynA-M-W19Y、BL21(DE3) / pET28a-xynA-M-W19F 和 BL21(DE3) / pET28a-xyhA-M-W19H ；
[0046] 5)將重組菌株 BL21 (DE3) / pET28a-xyhA-M-W19Y、BL21 (DE3) / pET28a-xynA-M-W19F 和 BL21 (DE3) / pET28a-xynA-M-W19H 按照常規的大腸桿菌誘導表達 重組蛋白方法，獲得重組蛋白XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F和XynA-M-W19H，測定木聚糖酶的 活性。
[0047] 本發明采用定點突變技術將短小芽孢桿菌Bacillus pumilus的堿性木聚糖酶成 熟肽編碼基因 xynA-M進行定點突變并克隆連接到大腸桿菌表達載體pET28a(+)上，轉化到 大腸桿菌表達菌株BL21 (DE3)感受態中，篩選重組子表達菌株，經誘導表達、破菌、純化獲 得突變體蛋白XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F和XynA-M-W19H(附圖1)，測定突變體蛋白的活 性，發現突變體是一組耐EDTA、酶活穩定的堿性木聚糖酶，該重組木聚糖酶突變體在OmM、 lmM、5Mm、10mMEDTA(pH9. 2,60°C)條件下，酶活有明顯的遞增趨勢，而原始酶XynA-M酶活有 下降趨勢（附圖2)。其中，IOmM EDTApH9. 260°C條件下XynA-M-W19Y比酶活比XynA-M高接 近20%，這為堿性木聚糖酶的廣泛應用奠定了良好的基礎。
[0048] 本發明通過定點誘變技術提高了堿性木聚糖酶的耐EDTA的活性。這種堿性木聚 糖酶的推廣應用，不僅在工業生產發展中產生可觀的經濟效益和社會效益，同時也可產生 巨大的生態效益。例如在造紙工業的生物助漂中，利用高效的，耐EDTA的堿性木聚糖酶，可 減少漂白用化學助劑的使用，節約大量工藝用水、生產時間、能耗、原料及對廢水的處理費 用，減少對環境排放水中的鹽含量及C0D，最大程度的保護生態環境。
【附圖說明】：
[0049] 附圖1 :重組木聚糖酶純化的SDS-PAGE電泳檢測。M-蛋白質分子量標準；1-4 :分 別是 XynA-M、XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F 和 XynA-M-W19H 純化后酶液；5-8 :分別是 XynA-M、 XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F 和 XynA-M-W19H 發酵粗酶液；
[0050] 附圖 2 :XynA-M、XynA-M-W19Y、XynA-M-W19F和 XynA-M-W19H蛋白在pH為 9. 2、60°C 及不同EDTA濃度下的相對酶活。
【具體實施方式】
[0051] 以下為列舉的實施例，以便于更好地理解本發明。
[0052] 實施例一
[0053] 本發明公開了一組耐EDTA的堿性木聚糖酶和編碼基因，其特征在于在GenBank收 錄號EU421717. 1中含有的堿性木聚糖酶基因 xynA，對應木聚糖酶xynA的氨基酸序列收錄 號為ACAOO160. 1，除去N-段的27個氨基酸信號肽，剩下的201個氨基酸是該木聚糖酶的成 熟片段XynA-M，對應的木聚糖酶基因成熟片段是xynA-Μ。針對xynA-M，分別設計點突變引 物（FP1、RP1、FP2、RP2、FP3、RP3)進行定點誘變