一種酮還原酶突變體及其制備和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及一種酮還原酶突變體及其制備和應用。
【背景技術】
[0002] 孟魯司特（Montelukast),商品名順爾寧（Singulair)，化學名為 [R-(E)]-1-[[[l_[3-[2-(7-氯-2-喹啉基）乙烯基]苯基]-3-[2-(l-羥基-1甲基乙基） 苯基]丙基]硫代]甲基]環丙基乙酸鈉，是由默克公司研制開發的一種高選擇性半胱氨 酞白三烯（Cys-LT)受體拮抗劑，它能競爭性拮抗白三烯D4與Cys-LTl受體的結合，是治 療阿司匹林過敏性哮喘和運動性哮喘的最優選擇。孟魯司特不僅可以改善哮喘患者的肺 功能，而且在抗炎、免疫等諸多方面也有重要的應用價值，具有廣闊的應用前景。（S，E)_甲 基-2-[3-[3-(2-(7-氯喹啉基-2-基）乙烯基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸叔丁酯(分子 式C28H24NO3Cl，分子量457. 96, CAS號142569-69-5)，是合成孟魯司特鈉(順耳寧Singulair) 的關鍵中間體。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的之一在于提供一種催化活性高、對映選擇性好的酮還原酶突變體基 因，及其編碼的酮還原酶突變體，含有該基因的重組表達載體、基因工程菌及其制備方法， 以及該酮還原酶突變體在催化還原其他酮類底物中的應用。特別的，將該酮還原酶突變體 用于不對稱還原酮類化合物的生產中。
[0004] 本發明提供一種酮還原酶突變體基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，或者由 SEQ ID NO. 1中所示的核苷酸序列經過取代、缺失或者添加一個或者幾個核苷酸且具有酮 還原酶活性的由（1)衍生的基因。
[0005] 本發明提供一種高活性的酮還原酶突變體，其是（1)由SEQ ID NO. 2所示氨基酸 序列組成的蛋白質；（2)或是由SEQ ID NO. 2中所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加 一個或者幾個氨基酸且具有酮還原酶活性的由（1)衍生的蛋白質。
[0006] 本發明的另一目的在于提供一種包含所述的的酮還原酶突變體基因的重組表達 載體。其可通過本領域常規方法將本發明的酮還原酶突變體基因的核苷酸序列連接于各種 載體上構建而成。所述的載體可為本領域常規的各種載體，優選PUC19。
[0007] 本發明的另一目的在于提供一種包含本發明的重組酮還原酶基因或其重組表達 載體的基因工程菌，本發明優選大腸埃希氏菌（Escherichia coli)BL21(DE3)。將前述重 組表達質粒轉化至大腸埃希氏菌（Escherichia coli)BL21(DE3)中，即可得到本發明優選 的基因工程菌。
[0008] 本發明的另一目的在于提供一種利用該基因工程菌制備酮還原酶突變體的方法， 包括構建該基因工程菌；篩選得到該基因工程菌；發酵培養該基因工程菌；以及收集和制 備酮還原酶突變體。
[0009] 本發明的另一個目的在于將由基因工程菌生產出的酮還原酶突變體應用到不對 稱還原酮類化合物以制備光學活性手性醇。
[0010] 根據本發明提供的該基因工程菌的應用，其中，底物的結構式為：
[0011]
[0012] 有益效果：
[0013] 本發明通過化學、分子生物學、生物信息學及高通量篩選方法，開發了一個具有較 高特異性（對映體過量值>99. 9%)及較好催化活性的重組酮還原酶，并將其與甲酸脫氫 酶（FDH)及NADH共同使用，用于不對稱還原2-[3-[3-(2-(7-氯-2-喹啉基）乙烯基]苯 基]-3-氧代丙基]苯甲酸甲酯以制備（S，E)-甲基-2-[3-[3-(2-(7-氯喹啉基-2-基）乙 烯基]苯基]-3-羥基丙基]苯甲酸叔丁酯。甲酸/甲酸脫氫酶是成功的輔酶再生體系，此 反應產生的副產物CO2對任何酶的活性均沒有影響，底物甲酸價格低廉，且很多酶對甲酸有 很高的耐受性。本發明的反應條件溫和：常溫、常壓、中性或接近中性PH，設備要求不高，投 入資金相對較少，且反應轉化率高、對映體選擇性高。
【附圖說明】
[0014] 圖1本發明酮還原酶突變體催化不對稱還原酮類化合物以制備光學活性手性醇 的反應原理圖。
[0015] 生物材料保藏信息
[0016] 大腸桿菌 BL21(DE3)KRED1306 (Escherichia coli BL21(DE3)KRED1306)，已于 2014年3月14日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏號 為 CCTCC NO :M2014078。
【具體實施方式】
[0017] 根據本發明一個實施例的重組酮還原酶基因，其來源于乳酸菌（Lactobacillus sp. Hon2N)，根據聚合酶鏈反應擴增（PCR)方法從乳酸菌細胞基因組中得到基因序列，通過 對其進行突變，從而獲得該重組酮還原酶突變體目的基因，其基因序列為SEQ ID NO. 1。
[0018] 根據本發明一個實施例的酮還原酶突變體突變體的蛋白序列為SEQ ID NO. 2。
[0019] 根據本發明一個實施例的重組載體，包括本發明實施例的酮還原酶突變體突變體 基因，載體為PUC19,采用乳糖啟動子，誘導劑為IPTG。
[0020] 根據本發明一個實施例的生產酮還原酶多肽突變體的基因工程菌具有包括酮還 原酶多肽基因突變體的重組載體。
[0021] 具體地，本發明的基因工程菌為保藏于中國典型培養物保藏中心（CCTCC)的保藏 編號為CCTCC NO :M2014078的基因工程菌。
[0022] 實施例1基因工程菌的建立
[0023] 通過NCBI查閱酮還原酶基因（NCBI登錄號為KC790015)，人工合成酮還原酶基因 片段，以該基因片段為模版，通過PCR擴增擴展該片段（片段兩側加 Hind3和EcoRl內切酶 片段）其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。并利用Hind3和EcoRl內切酶位點將基因插入 PUC19質粒中，將連接后的載體轉入大腸桿菌BL21(DE3)中建立酮還原酶基因工程菌。其 中PCR擴增酮還原酶基因的引物為：正向引物Fl :ATGGCTCATATTGTAATTTT(SEQ ID NO. 4)， 反向引物 F2:TTAATTCGGTTTTTTCAGTC(SEQ ID N0.5)。
[0024] 實施例2酮還原酶突變體基因的獲得
[0025] 本研究利用易錯PCR隨機突變的方法，對酮還原酶進行了蛋白質工程改造。易錯 PCR是在采用DNA聚合酶進行目的基因擴增時，通過調整反應條件，如提高鎂離子濃度、加 入錳離子、改變體系中四種的dNTPs濃度或運用低保真度DNA聚合酶等，來改變擴增過程中 的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機引入突變，獲得蛋白質分子的隨機突變 體。
[0026] 本研究采用較低的Taq聚合酶在特定措施下很容易向擴增產物中摻入隨機突變 的原理，同時利用Mn2+替代天然輔助因子Mg2+增加易錯概率。
[0027] 50 μ IPCR反應體系為：10 X擴增緩沖液5 μ 1，4種dNTP混合物各100 μ mol/L，引 物各 40pmol，模板 DNA0. 5 μ g，Taq DNA 聚合酶 0· 5 μ , Mn2+2mmol/L，加雙蒸水至 50 μ 1。
[0028] PCR 反應條件為：94°C預變性 5min，94°C變性 45s，50°C變性 30s，72°C變性 120s， 進行30個循環；于72°C下繼續延伸lOmin，冷卻至4°C。
[0029] 實驗流程
[0030] 按照實施例1的方法PCR擴增酮還原酶基因并利用Hind3和EcoRl內切酶位點將 基因括入至PUC19質粒中，作為基因突變模板；
[0031 ] 易錯PCR擴增酮還原酶的基因，擴增后基因片段鏈接至PUC19-T載體，將連接后的 載體轉入之大腸桿菌BL21 (DE3)中建立酮還原酶基因突變文庫；利用大腸桿菌BL21 (DE3) 為宿主，PUC19質粒為載體，表達擴展酮還原酶，高通量篩選高活性突變株；突變后對高活 性酮還原酶基因進行鑒定。篩選出的高活性酮還原酶突變體基因的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0032] 酮還原酶基因引物為：正向引物Fl :ATGGCTCATATTGTAATTTT (SEQ ID NO. 4)，反向 $*F2:TTAATTCGGTTTTTTCAGTC(SEQIDN0.5)。
[0033] 按實施例1所述方法構建表達該酮還原酶多肽突變體的基因工程菌，并將其命名 為 E. Coli BL21(DE3)KRED1306。
[0034] 實例3酮還原酶的搖瓶制備
[0035] 將實施例1所得的酮還原酶基因工程菌或實施例2所得的酮還原酶多肽突變體基 因工程菌E. Coli BL21(DE3)KRED1306接種至含卡拉霉素（50yg/mL)的LB培養基(蛋白胨 l〇g/L，酵母膏5g/L，NaC110g/L，ρΗ7·2)中，于30