一種小鼠肉瘤180多藥耐藥細胞株的體內構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明提供一種小鼠肉瘤180多藥耐藥細胞株的體內構建方法，屬于生物醫學技 術領域。
【背景技術】
[0002] 腫瘤多藥耐藥性（Multi-drug resistance，MDR)是指腫瘤細胞對一種抗腫瘤藥物 產生耐藥性的同時，對結構和作用機制不同的其他抗腫瘤藥物產生交叉耐藥性，使抗腫瘤 化學治療達不到預期的臨床效果。目前，已有很多研宄文獻顯示，一些藥物在體外試驗具有 很好的MDR逆轉作用，但真正可用于臨床的逆轉劑卻很少，其主要原因之一是逆轉劑的藥 效學研宄大多采用體外給藥方法誘導的MDR細胞株及其動物模型，而癌癥患者MDR的形成 過程是受機體各種內環境影響的。因此，采用體內給藥方法建立腫瘤MDR模型更符合臨床 特點。目前，采用恒定劑量體內給藥方法建立腫瘤MDR細胞株已有一些文獻報道，但本發明 模擬臨床常用聯合化療方案，采用體內給藥劑量遞增法誘導肉瘤180腹水瘤小鼠，建立了 獲得性肉瘤180MDR細胞株。

【發明內容】

[0003] 本發明是針對目前現有技術存在的不足，其目的是提供一種小鼠肉瘤多藥耐藥細 胞株的體內構建方法。
[0004] 本發明是這樣實現的，一種小鼠肉瘤180多藥耐藥細胞株的體內構建方法，其特 征是包括以下步驟：
[0005] (1)常規復蘇凍存的小鼠肉瘤180 (以下簡稱S180)細胞株，用含牛血清的1640培 養液，于37°C、5% 0)2培養箱中常規體外培養、傳代，以擴增細胞；取體外擴增的對數生長 期的S180細胞懸液，調整細胞濃度為6-8 X l〇7ml，取此細胞懸液0. 15-0. 3ml接種于ICR 小鼠腹腔內，建立S180腹水瘤小鼠模型；
[0006] (2)常規飼養S180腹水瘤小鼠，待肉眼觀察到S180腹水瘤小鼠腹部明顯膨隆 后2-3天抽取腹水，用無菌生理鹽水稀釋，調整細胞濃度為4-6X 106/ml，取此細胞懸液 0. 15-0. 3ml接種于ICR小鼠腹腔內，反復重復步驟（2)進行反復傳代，建立穩定生長的 S180腹水瘤小鼠模型；
[0007] (3)取穩定生長的S180腹水瘤小鼠，待肉眼觀察到穩定生長的S180腹水瘤小鼠腹 部明顯膨隆后2-3天抽取腹水，用無菌生理鹽水調整細胞濃度為1-3X 106/mL，取此細胞懸 液0. 15-0. 3mL注入ICR小鼠腹腔內進行傳代，傳代18-24小時后給予DDP (順鉑）、FU (氟 尿嘧啶）和CPA (環磷酰胺）3種藥物；
[0008] 其中，DDP、ip (ip為腹腔注射給藥的英文Intraperitoneal injection的縮寫）每 周一次；FU、ig(ig為灌胃給藥的英文Intragastric administration的縮寫）每天一次； CPA、ig每天一次；3種藥物的劑量按小、中、大遞增的方法連續給藥，小劑量為在每Ikg的 ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分別為3mg、3mg、3mg，給藥時間為第1代和第2代沖劑量為在 每Ikg的ICR小鼠中含DDP、FU、CPA分別為4mg、6mg、6mg，給藥時間為第3代和第4代；大 劑量為在11^的10?小鼠中含00?、？10?4分別為51^、121^、1211^，給藥時間為第5代和第 6代；
[0009] 在6代的傳代中，皆待肉眼看到ICR小鼠腹部明顯膨隆后3-5天抽取腹水，用無菌 生理鹽水調整細胞濃度為1-3 X 106/mL，取此細胞懸液0. 15-0. 3mL注入ICR小鼠腹腔內進 行下一代的傳代，直至傳到第6代看到ICR小鼠腹部明顯膨隆后3-5天抽取腹水，得到的第 6代腹水瘤小鼠的腹水瘤細胞，即耐藥強度較高、耐藥穩定時間較長的小鼠肉瘤180多藥耐 藥細胞株。
[0010] 所述步驟（1)中，含牛血清的1640培養液指的是含5-10%胎牛血清的1640培養 液。
[0011] 所述步驟（1)中，對體外擴增的對數生長期的S180細胞懸液，用無菌生理鹽水離 心、洗絳2_3次。
[0012] 所述步驟⑵中，細胞懸液0. 15-0. 3ml接種于ICR小鼠腹腔內并反復傳代3-5代 以后建立的穩定生長的腹水瘤小鼠模型。
[0013] 所述小鼠肉瘤180多藥耐藥細胞株在小劑量、中劑量和大劑量給藥分別停藥后的 穩定耐藥時間分別為不少于1周、2周和3周。
[0014] 所述小鼠肉瘤180多藥耐藥細胞株不但對誘導的藥物DDP和FU耐藥，對從未接觸 過的作用機制不同的阿霉素也耐藥。
[0015] 本發明設計科學，簡單易行。選用順鉑、氟尿嘧啶和環磷酰胺3種臨床常用化療藥 物體內給藥并逐漸增加劑量所建立的肉瘤180耐藥細胞株，其耐藥強度較高，在給藥誘導 后傳代第二代時其細胞即具有耐藥性，在所設計的劑量范圍內，對化療藥物的耐藥倍數隨 著給藥劑量增大與給藥時間延長而增大。該細胞模型的耐藥穩定時間較長，在小劑量、中劑 量和大劑量給藥分別停藥后的穩定耐藥時間分別為不少于1周、2周和3周。該方法所建立 的耐藥細胞株不但對所誘導的藥物具有耐藥性，而且對沒有接觸過的、化學結構不同的其 它抗腫瘤化學藥阿霉素（Adriamycin，ADR)也具有交叉耐藥性，具有多藥耐藥的特點。本發 明為研宄腫瘤多藥耐藥機制、篩選各類抗腫瘤藥物、研發包括中藥或天然藥物類在內的腫 瘤耐藥逆轉藥物提供了小鼠腫瘤多藥耐藥細胞株與動物模型，應用范圍較廣。
[0016] 本發明采用MTT法和流式細胞術，檢測低、中、高劑量所誘導細胞對化療藥物的體 外耐藥倍數、細胞內ADR積累量，驗證所誘導細胞的耐藥強度。將不同劑量誘導的小鼠腹水 瘤細胞末次傳代后，停止給予化療藥物，正常飼養、傳代，分別在停藥1、2或3周后的不同時 間，取所誘導的腹水瘤細胞，按上述方法測定細胞對各化療藥物體外的耐藥倍數和細胞內 ADR積累量，以檢測所誘導細胞在不同階段停止給藥后的耐藥穩定時間。此外，取誘導并傳 代第6代的腹水瘤細胞接種于小鼠腋下，制備移植性實體瘤耐藥模型，觀察化療藥物體內 給藥對耐藥腫瘤移植瘤的影響。
[0017] 具體實驗方法與結果如下：
[0018] 1.耐藥倍數測定
[0019] 取親本S180細胞和DDP/FU/CPA低、中、高不同劑量所誘導的S180腹水瘤細胞， 制備細胞懸液，以IX IO5AiL濃度接種于96孔培養板，100 μ L/孔，分別給予5個不同 濃度的DDP、FU和ADR，每種濃度各設6個復孔，另設空白對照組、親本細胞對照組、誘導 細胞對照組，37 °C、5 % CO2恒溫箱培養44h后，吸取上清IOO μ L棄之，每孔加 MTT (5mg/ mL)溶液10 μ L，繼續孵育4h后，每孔加酸化異丙醇100 μ L，振蕩lOmin，吹打均勾后于自 動酶標儀490nm波長下測定OD值，計算細胞生長抑制率、半數抑制濃度（IC5tl)及耐藥倍 數。耐藥程度判斷參考 Sonw 標準（SnowK, Judd W. Characteristics of adriamycinand amsacrine-resistant human IeukaemicTcell lines[J]· BrJCancer, 1991，63(I):17-28)， 即：耐藥倍數〈5為低度耐藥，5-15為中度耐藥，>15為高度耐藥。
[0020] 計算公式：細胞生長抑制率=(1-實驗組吸光度OD/對照組吸光度0D) X 100% ;
[0021] 耐藥倍數=誘導細胞IC5tl/親本細胞IC5tl。
[0022] 結果見表1、表2。
[0023] 表1結果顯示，隨著誘導劑量增加，所誘導的S180細胞對各化療藥物的耐藥倍數 逐漸增大，其中低劑量誘導的細胞其耐藥強度為低度耐藥，中、高劑量誘導的細胞可達到中 度耐藥，提示所誘導的MDR模型其耐藥強度隨著誘導時間延長和誘導劑量的遞增而逐漸增 強。結果還顯示，所誘導的S180細胞對ADR具有一定的耐藥性，提示其對結構不同的其他 化療藥物也產生了耐藥性，具有MDR的特點。
[0024] 表2結果顯示，低劑量所誘導的S180細胞停藥1周時對各化療藥物仍具有一定的 耐藥性，但停藥2周后其耐藥倍數大多低于1. 0,提示其耐藥穩定時間大于1周，但小于2 周；中劑量所誘導的S180細胞停藥2周后其各耐藥倍數均大于2. 50,而停藥3周后的耐藥 倍數接已近于1. 0,提示其耐藥穩定時間大于2周，但小于3周；從高劑量所誘導的細胞停 藥2和3周后其對化療藥物的耐藥倍數結果可看出，經高劑量誘導后細胞的耐藥穩定期不 小于3周。與低劑量停藥1周后細胞各耐藥倍數比較，中、高劑量誘導細胞停藥2周后其各 耐藥倍數均比較高，且停藥2周后，高劑量誘導細胞的耐藥倍數均比中劑量誘導細胞高，提 示隨著誘導劑量的增加，所誘導細胞耐藥穩定性更好。
[0025] 表1不同劑量誘導的S180細胞對各化療藥物的耐藥倍數（η = 6, X 士 S )
[0026]
[0027] 表2不同劑量誘導細胞停止給藥后耐藥倍數測定
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[0029] 2. ADR積累量測定
[0030] 收集親本S180細胞和所誘導的S180細胞，用含5yg/mL ADR的RPMI 1640完全 培養基調整細胞至細胞數I X 106/mL，分別接種于24孔板，每孔終體積為2. OmL，每組3個平 行樣品。37°C、5% CO2恒溫培養箱中溫育3h后將細胞轉移到流式細胞管內，用適量冷PBS 吹洗，