專利名稱：：順鉑誘導建立的宮頸癌多藥耐藥細胞株的制作方法
技術領域：
：本發明屬腫瘤生物學領域，涉及一種人宮頸癌耐藥細胞株。具體涉及以人宮頸癌SiHa為親代細胞，通過逐步增加化療藥物順鉑(cDDP)作用濃度，建立了宮頸癌多藥耐藥細胞株SiHa/cDDP。
背景技術：
：宮頸癌嚴重危害著女性健康，其發病率居女性惡性腫瘤第二位。全世界每年的宮頸癌新發病例約50萬，而我國每年新發病人數約占世界總發病人數的1/3。化療是治療宮頸癌的重要手段，但化療中常見且難以解決的問題是多藥耐藥性的產生，即腫瘤同時對多種結構和作用機制不同的化療藥物產生交叉耐藥的現象，它是化療失敗的主要原因。因此研究腫瘤多藥耐藥機制以及防止或逆轉腫瘤多藥耐藥的發生對于提高化療效果十分重要。近年來，腫瘤耐藥細胞株已成為重要的工具，大量研究利用它來揭示腫瘤細胞的耐藥機制、研究腫瘤細胞的耐藥性逆轉、開發及評價新的抗癌方法等。建立腫瘤耐藥細胞株具有重要應用價值。順鉑是宮頸癌化療的常用藥物，因此有必要建立宮頸癌對順鉑的耐藥細胞株。腫瘤耐藥細胞株的建立通常有兩種方法，一是逐步增加藥物濃度、持續誘導法，二是大劑量沖擊間斷給藥法。國內外均有研究對這兩種方法進行了比較，認為不同誘導方式可能獲得不同耐藥機理的耐藥細胞株，同時也可能影響腫瘤細胞耐藥程度，持續誘導比沖擊誘導更易產生耐藥性。持續誘導法以腫瘤細胞最終能在特定濃度化療藥物中穩定生長作為誘導成功的判定標準，細胞耐藥性穩定、直觀，因此本發明主要采用該法來誘導耐藥細胞的產生。腫瘤細胞耐藥程度的判定常用耐藥指數(resistantindex,Rl)來表示，Rl是耐藥細胞半數抑制濃度(50%inhibitoryconcentration,IC50)與親代細胞半數抑制濃度的比值。Snow等按耐藥指數的高低將耐藥性分為低度(<5)、中度(5-15)、高度(>15)。
發明內容本發明的目的是建立宮頸癌耐藥細胞株SiHa/cDDP，為以下相關研究提供耐藥腫瘤細胞模型研究耐藥腫瘤細胞形態學及生物學特點、研究腫瘤多藥耐藥機制、分析化療藥物敏感性及篩選化療藥物、開發腫瘤耐藥逆轉藥物、研發更有效的腫瘤治療方法等。目前國內外尚無SiHa細胞對cDDP的耐藥株，我們的發明為宮頸癌的研究提供了一種重要的基礎研究模型。本發明的耐藥細胞株建立步驟如下(1)人宮頸癌SiHa細胞株，復蘇后用DMEM培養液(含10%小牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml)于37°C、5%C02、95。/。濕度條件下培養；(2)取對數生長期SiHa細胞，換新鮮培養液，加入cDDP，使其作用濃度為0.1ug/ml，在37°C、5%C02、95%濕度條件下繼續培養，適時換液，維持0.1ug/ml藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩定生長、傳代；(3)適當增加cDDP的作用濃度，在37"C、5%C02、95%濕度條件下繼續培養，適時換液，維持藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩定生長、傳代；(4)重復步驟(3)直到獲得能在2ug/mlcDDP中穩定生長、傳代及復蘇的SiHa/cDDP細胞株。在誘導過程中，掌握適當的cDDP增加濃度非常重要，理想狀況是既通過增加藥物濃度篩選出少數耐藥細胞又不致于使全部細胞死亡，從而不斷獲得有更高耐藥性的SiHa細胞。經過探索，在我們的發明中采用每階段增加0.4或0.5ug/mlcDDP的方法取得了較好效果，歷時9個月建立了SiHa/cDDP耐藥細胞株。用光學顯微鏡觀察細胞形態、MTT法繪制細胞生長曲線、檢測細胞耐藥指數。我們發現，SiHa/cDDP較SiHa細胞有以下變化細胞較細長，形態不規則，多核細胞更常見；生長速度明顯減慢；對cDDP明顯耐藥，耐藥指數(Rl)為16.131，除對cDDP耐藥外，對依托泊苷、紫杉醇、長春新堿、氨甲喋呤、多柔比星、絲裂霉素C有低度交叉耐藥。圖1是倒置相差顯微鏡下SiHa活細胞觀察圖；圖2是倒置相差顯微鏡下SiHa/cDDP活細胞觀察圖；圖3是光學顯微鏡下SiHa細胞爬片HE染色觀察圖；圖4是光學顯微鏡下SiHa/cDD細胞爬片HE染色觀察圖；圖5是SiHa及SiHa/cDDP細胞生長曲線。具體實施方式實施例1SiHa/cDDP多藥耐藥細胞株按以下步驟建立(1)人宮頸癌SiHa細胞株，復蘇后用DMEM培養液(含10%小牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml)于37。C、5%C02、95。/。濕度條件下培養；(2)取對數生長期SiHa細胞，換新4鮮培養液，力口入cDDP，使其作用濃度為0.1ng/ml，在37°C、5%CQ2、95%濕度條件下繼續培養，適時換液，維持0.1"g/ml藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩定生長、傳代；(3)適當增加cDDP的作用濃度，在37°C、5%C02、95%濕度條件下繼續培養，適時換液，維持藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩定生長、傳代；(4)重復步驟(3)直到獲得能在2ug/mlcDDP中穩定生長、傳代及復蘇的SiHa/cDDP細胞株。每階段增加cDDP量為0.4或0.5ug/ml。歷吋9個月建立SiHa/cDDP細胞株。當細胞依次對0.1ug/ml、0.5ug/ml、1ug/ml、15tig/ml、2ug/mlcDDP穩定耐藥后，及時凍存該濃度耐藥細胞于液氮中。凍存液由20%小牛血清、5%DMS0、75。/。DMEM培養液組成，凍存過程應逐步降溫，采取4。C30分鐘一-20°C1小時一-7(TC過夜一液氮的順序進行。凍存細胞的復蘇按以下程序進行在--個25cn^的細胞培養瓶中加入至少10ml含10%小牛血清的培養液；從液氮中取出裝有細胞的凍存管，立即放入37。C水浴輕輕搖動使凍存物在1分鐘內解凍，用酒精棉球擦拭凍存管外壁后拿入超凈臺；將解凍后的細胞懸液移入已加了培養液的培養瓶中，稍加搖動混勻，擰松瓶蓋，平放入二氧化碳培養箱中，在37。C、5%C02、95。/。濕度條件下培養，約24小時細胞貼壁后換新鮮培養液35ml繼續培養。實施例2對建立的SiHa/cDDP細胞株進行形態學觀察及生物學特性鑒定1.形態學觀察OM到置相差顯微鏡觀察活細胞形態取對數生長期SiHa、SiHa/cDDP細胞各一瓶，換液后在倒置相差顯微鏡下觀察活細胞形態并照相。可見SiHa細胞呈梭形，大小及形態較規則(如圖l所示)；SiHa/cDDP細胞顯得更加細長，有時甚至呈線狀(如圖2所示)。(2)HE染色觀察細胞形態取對數生長期SiHa、SiHa/cDDP細胞，用0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，調整密度約1xl0Vml，接種于鋪蓋玻片的培養皿，放C02培養箱常規培養，待細胞基本長成單層，取出蓋玻片，棄培養液，0.01MPBS浸洗3次，常規HE染色，于光學顯微鏡下觀察。可見細胞SiHa細胞形態較規則(如圖3所示)，SiHa/cDDP細胞形態不一，見較多細長細胞，多核細胞常見(如圖4所示)。2.測定細胞生長曲線和群體倍增時間(MTT法)取對數生長期SiHa、SiHa/cDDP細胞，用胰酶消化制單細胞懸液，調整細胞密度。每種細胞均以2000/孔種于96孔板，設5個復孔。同時接種8塊96孔板。于實驗的18天每天取出一塊板，用MTT法檢測595nm波長處OD值，通過OD值一細胞數直線回歸方程將OD值換算成細胞數。將8次的實驗數據進行分析，繪制生長曲線(如圖5所示)。按Patterson公式Td=ATxlg2/lg(Nt/No)計算細胞倍增時間，Td為倍增時間，Nt為終末細胞數，No為初始細胞數(此處用OD值代替)，AT為NtNo的時間，算得SiHa和SiHa/cDDP細胞群體倍增時間分別為38.04士2.39h和45.82士3.69h，耐藥細胞生長速度減慢(P<0.001)3.耐藥譜分析(MTT法)取對數生長期的SiHa、SiHa/cDDP細胞，用0.25%胰酶消化，制單細胞懸液，以4X10Vml的密度接種于96孔板，每孔180iU(7200個細胞/孔)。常規培養24h。每孔加20ul用培養液配制的化療藥物，使八種藥物(依托泊苷、順鉑、紫杉醇、長春新堿、5-氟尿嘧啶、氨甲喋呤、多柔比星、'絲裂霉素C)分別以78個梯度濃度作用于細胞(梯度濃度根據預實驗所得，務必使半數抑制濃度在此梯度范圍中間位置)。每一濃度設3復孔，同時設僅接種細胞的無藥對照孔和僅加培養液的調零孔。于37°C、5%C02、95%濕度培養72h。每孔加5mg/mlMTT液20"l，繼續培養4h。吸棄上清液，每孔加DMSO150lU,震蕩儀震蕩10min，用酶標儀檢測595nm波長OD值，每三個復孔取其平均值。根據OD值計算細胞抑制率，計算公式細胞抑制率=(l-實驗組OD值/對照組OD值)X100。/。。根據每種藥物不同濃度抑制率，利用SPSS15.0軟件Regression中的Probit過程計算該藥半數抑制濃度(IC50)，從而計算每種藥物的耐藥指數RI，R^耐藥細胞IC50/親代細胞IC50，比較耐藥細胞和親代細胞的差異。分析表明，SiHa/cDDP細胞對cDDP的耐藥指數(RI)為16.131，屬高度耐藥，除對cDDP耐藥外，對依托泊苷、紫杉醇、長春新堿、氨甲喋呤、多柔比星、絲裂霉素C有低度交叉耐藥，耐藥指數分別為4.018、1.909、4.087、3.966、2.299、2.652，而對5-氟尿嘧啶基本無耐藥性，耐藥指數為1.00。詳細數據如表1所示。6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表l保藏該生物材料樣品的單位中國典型培養物保藏中心地址湖北省武漢市武昌珞珈山培養物名稱人宮頸癌多藥耐藥細胞株SiHa/cDDP保藏日期2009年1月20日保藏編號CCTCC一C20090權利要求1.一種宮頸癌多藥耐藥細胞株，其特征在于細胞株命名為SiHa/cDDP，系利用化療藥物順鉑(cDDP)誘導人宮頸癌SiHa細胞株建立而成，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC—C200903。2.根據權利要求1所述的一種宮頸癌多藥耐藥細胞株，其特征在于宮頸癌多藥耐藥細胞株按以下步驟建立(1)人宮頸癌SiHa細胞株，復蘇后用DMEM培養液(含10%小牛血清、青霉素100U/ml、鏈霉素100ug/ml)于37。C、50線、95%濕度條件下培養；(2)取對數生長期SiHa細胞，、換新鮮培養液，加入cDDP，使其作用濃度為0.1wg/ml，在37°C、5%C02、95%濕度條件下繼續培養，適時換液，維持0.lug/ml藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩定生長、傳代；(3)適當增加cDDP的作用濃度，在37"C、5%C02、95%濕度條件下繼續培養，適時換液，維持藥物濃度直至存活細胞能在此濃度穩定生長、傳代；(4)重復步驟(3)直到獲得能在2ug/mlcDDP中穩定生長、傳代及復蘇的SiHa/cDDP細胞株。3.根據權利要求1和2所述的一種宮頸癌多藥耐藥細胞株，其特征在于步驟(3)每次增加的cDDP濃度為0.4或0.5ug/ml。4.根據權利要求1和2所述的一種宮頸癌多藥耐藥細胞株，其特征在于該細胞株對cDDP的耐藥指數(RI)為16.131，除對cDDP耐藥外，對依托泊苷、紫杉醇、長春新堿、氨甲喋呤、多柔比星、絲裂霉素C有交叉耐藥。5.權利要求1、2、3和4所述的一種宮頸癌多藥耐藥細胞株SiHa/cDDP在腫瘤研究中的應用。全文摘要本發明涉及一種宮頸癌多藥耐藥細胞株，特征是選擇人宮頸癌SiHa細胞株作為親代細胞，從0.1μg/ml逐步增加化療藥物順鉑(cDDP)的作用濃度至2μg/ml，建立SiHa/cDDP耐藥細胞株。SiHa/cDDP細胞能在2μg/mlcDDP中穩定生長、傳代及復蘇，對cDDP的耐藥指數(RI)為16.131，除對cDDP耐藥外，對依托泊苷、紫杉醇、長春新堿、氨甲喋呤、多柔比星、絲裂霉素C有交叉耐藥。本發明目的是為腫瘤相關研究提供耐藥腫瘤細胞模型。文檔編號C12N5/08GK101503674SQ20091005826公開日2009年8月12日申請日期2009年2月2日優先權日2009年2月2日發明者劉珊玲,和王,陳新蓮申請人:四川大學華西第二醫院