馬鈴薯中的轉化酶沉默使由斑馬片和糖端所致的損失最小化的用圖
【專利說明】馬鈴薯中的轉化酶沉默使由斑馬片和糖端所致的損失最小 化的用途
[0001] 相關申請案的奪叉參考
[0002] 本申請要求2012年11月9日提交的美國臨時申請第61/724, 632號和2013年3 月14日提交的美國臨時申請第61/783, 390號的優先權，其中的每一者以全文引用的方式 并入本文中。
技術領域
[0003] 本發明提供生產包括薯片和薯條的馬鈴薯產品的便利方法，所述產品糖端的發生 率較低和/或歸因于感染斑馬片病原體的顯色不佳較少。
【背景技術】
[0004] 馬鈴薯（Potato/Solanum tuberosum)為世界上第三重要的糧食作物。其用于人 類食用、動物飼料以及作為淀粉和醇的來源。全球產量的超過三分之二被人類直接食用，其 余的中的許多喂食動物或用于生產淀粉。21世紀的第一個十年的平均全球公民的每年飲食 包括約33kg (或731b)馬鈴薯。
[0005] 在每一個生長季期間，馬鈴薯植株經受多種影響植物健康、產量和最終塊莖品質 的生物和非生物逆境。由于田間的環境和栽培措施的綜合效應所致的不佳塊莖品質可以在 如薯條或薯片的最終產品中顯現。次優生長年份和不佳栽培措施導致如褐斑病、空心病、內 部壞死、維管變色、斑馬片和糖端的內部塊莖病癥的明顯增加。具有這些病癥的薯條成品必 須丟棄，對加工商構成經濟損失。一些經濟負擔以違約處罰形式傳遞至種植者或以產品的 較高價格形式傳遞至消費者。
[0006] 因此，繼續需要馬鈴薯塊莖品質的提高，其為本發明所闡述的。

【發明內容】

[0007] 本發明提供使馬鈴薯塊莖或由所述馬鈴薯塊莖制得的產品中的糖端的頻率最小 化的方法，其中馬鈴薯塊莖中的糖端的頻率相比于對照馬鈴薯塊莖減少。在一些實施例中， 所述方法包含破壞所述馬鈴薯塊莖中的液泡轉化酶活性。
[0008] 本發明也提供使馬鈴薯塊莖或由所述馬鈴薯塊莖制得的產品中的斑馬片癥狀最 小化的方法，其中馬鈴薯塊莖中的斑馬片癥狀相比于對照馬鈴薯塊莖減少。在一些實施例 中，所述方法包含破壞所述馬鈴薯塊莖中的液泡轉化酶活性，
[0009] 可以通過任何合適的方法破壞液泡轉化酶活性。在一些實施例中，通過將編碼液 泡轉化酶的液泡轉化酶基因的一或多個核苷酸變化引入至馬鈴薯塊莖中破壞液泡轉化酶 活性。在一些實施例中，核苷酸變化自然地發生，或通過任何合適的方法人工地創造。在一 些實施例中，通過引入一或多個抑制性核苷酸序列破壞液泡轉化酶活性。在一些實施例中， 抑制性核苷酸序列選自由反義RNA序列、dsRNAi序列和反向重復序列組成的群組。
[0010] 在一些實施例中，抑制性核苷酸可操作地連接于植物啟動子。在一些實施例中，植 物啟動子選自由組成性啟動子、非組成性啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子和細胞 型特異性啟動子組成的群組。
[0011] 在一些實施例中，組織特異性啟動子為塊莖特異性啟動子。在一些實施例中，塊莖 特異性啟動子為與ADP葡萄糖焦磷酸酶基因相關的啟動子。在一些實施例中，塊莖特異性 啟動子包含核酸序列SEQ ID NO:6,或任何因此的功能變異體或其功能片段。
[0012] 在一些實施例中，抑制性核苷酸序列為反向重復序列。在一些實施例中，反向重復 序列來源于SEQ ID NO: 5。在一些實施例中，反向重復序列包含至少一個有義序列和至少一 個反義序列，其與SEQ ID N0:5或其逆向互補序列的某一或某些部分具有至少80%、85%、 90%、95%、99%或99%以上的一致性。在一些實施例中，反向重復序列包含至少一個有義 序列和至少一個反義序列，其可以與SEQ ID N0:5或其逆向互補序列雜交。
[0013] 在一些實施例中，反向重復序列包含對應于SEQ ID NO: 5的+53至+733的有義序 列。在一些實施例中，反向重復序列包含對應于SEQ ID NO:5的+552至+49的反義序列。
[0014] 本發明也提供生產在通常導致誘發糖端的田間條件下并不產生具有糖端的塊莖 的轉基因植物的方法，和使用轉化酶沉默使斑馬片癥狀最小化或降低糖端頻率的方法。
[0015] 在一些實施例中，本發明的方法包含在馬鈴薯植株中表達基因沉默盒。在一些實 施例中，所述盒包含有義序列和反義序列，其以反向重復序列形式定向。在一些實施例中， 有義序列與SEQ ID NO: 5具有100 %-致性。在一些實施例中，反義序列為有義序列的全長 或部分逆向和互補序列。在一些實施例中，有義序列和反義序列通過間隔子分離。在一些 實施例中，表達盒包含塊莖特異性啟動子。在一些實施例中，塊莖特異性啟動子可操作地連 接于有義和反義序列。在一些實施例中，盒的表達下調至少一個內源性轉化酶基因的表達 從而使馬鈴薯塊莖或由所述馬鈴薯塊莖制得的產品中的糖端的頻率最小化，和/或使馬鈴 薯塊莖或由所述馬鈴薯塊莖制得的產品中的斑馬片癥狀最小化。在一些實施例中，有義序 列與SEQ ID N0:5的全長或部分序列100%-致。在一些實施例中，反義序列與有義序列 的逆向和互補序列100%-致。舉例來說，有義序列可以是SEQ ID N0:3,并且反義序列可 以是SEQ ID N0:21。在一些實施例中，反義序列與有義序列的逆向和互補序列并非100% 一致，而是與其部分重疊，例如有義序列可以是SEQ ID N0:3,并且反義序列可以是SEQ ID N0:4〇
[0016] 本發明的方法為出乎意料的，因為基因功效與預先冷溫度誘導嚴密相關（克蘭 (Klann)等人，植物生理學（Plant Physiol) 1993 ;貝思克（Bethke)和江（Jiang),植物生 理學2010 ;葉（Ye)等人農業和食品化學雜志（J. Agric Food Chem) 2010)。
【附圖說明】
[0017] 圖1.糖端（SE)在幾乎一半的'游俠'（A)和空白載體（B)對照薯條上顯而易見。 品系1632-1(0和1632-4(D)關于轉化酶沉默并且在與對照組相同的條件下生長和油炸時 不顯示SEo
[0018] 圖2.新鮮馬鈴薯切片上的重度㈧和輕度⑶斑馬片癥狀。在整個塊莖肉中的 組織壞死的嚴重癥狀在收獲前35和28天（dbh)感染的塊莖上顯而易見。在收獲前21天 的輕度感染塊莖切片上可見較少壞死。在收獲前14和7天的塊莖上看見極少壞死或無壞 死。
[0019] 圖3. (A)收獲前35天（dbh) ; (B)收獲前28天；（C)收獲前21天；(D)收獲前14 天；和（E)收獲前7天來自'游俠'對照組（左側）和轉化酶沉默品系1632-1 (右側）的薯 片樣品。薯片由6-8個塊莖的切片制得并且在375 T下油炸3分鐘。達到最終2%水分含 量。
[0020] 圖4.沉默多酚氧化酶（Ppo)消除斑馬片感染塊莖的氧化暗化。未感染CV. '大西 洋'塊莖（A)中的多酚氧化酶作用將無色兒茶酚底物轉化為切割塊莖表面上的暗色沉淀。 未感染（B)或感染（C)Ppo沉默塊莖均不顯示暗化。顯示三種不同塊莖。在將0.4M兒茶酚 溶液涂覆于切割塊莖表面上方15分鐘之后拍攝照片。
[0021] 圖5. Northerns展示轉化酶（A)和Ppo (B)的沉默。每個Northern以下的溴化乙 錠染色RNA凝膠用于負載參考物。自溫室生長塊莖分離總RNA (20yg)。屬于基因內事件和 對照組并且與Inv(A)和Ppo(B)探針雜交的塊莖組織。
【具體實施方式】
[0022] 用電子方式提交的文本文件的描述
[0023] 提交的文本文件的內容以全文引用的方式并入本文中：序列表的計算機可讀格式 復本（文件名：JRSI00202US_ST25.txt，錄入日期：2013年11月8日，文件大小20千字節）。
[0024] 定義
[0025] 如本文所使用，如用于本說明書和權利要求書中的動詞"包含"和其詞形變化形式 在其非限制性意義上用于意指包括所述詞語之后的項目，但不排除未專門提到的項目。
[0026] 術語"一（a) "或"一（an) "是指所述實體中的一或多者；舉例來說，"一種基因"是 指一或多種基因或至少一種基因。因此，術語"一（a)"（或"一（an)"）、"一或多個（一或 多種）"和"至少一個（至少一種）"在本文中可互換地使用。另外，通過不定冠詞"一（a) " 或"一（an) "提及"一個要素"并不排除存在一個以上要素的可能性，除非上下文明確要求 存在一個且僅存在一個要素。
[0027] 如本文所使用，術語"植物"是指屬于植物界的任何活有機體（即植物界中的任 何屬/種）。此包括熟悉的有機體，如（但不限于）樹木、草本植物、灌木、禾草、藤本植物、 蕨類植物、蘚類植物和綠色藻類。所述術語是指單子葉植物（monocotyledonous plant，也 稱為monocot)和雙子葉植物（dicotyledonous plant，也稱為dicot)二者。舉例來說， 在一些實施例中，植物為前屬（Solanum genus)中的種，如馬鈴薯（S. tuberosum)、窄刀薯 (S.stenotomum)、富利哈薯（S.phureja)、角萼薯（S.goniocalyx)、阿加薯（S.ajanhuiri)、 喬查薯（S. chaucha)、尤杰普氏薯（S. juzepczukii)和短葉薯（S. curtilobum)。在一些實 施例中，植物為馬鈴薯種中的馬鈴薯品種。
[0028] 如本文所使用，術語"植物部分"是指植物的任何部分，包括（但不限于）芽、根、 莖、腋芽、種子、托葉、葉子、花瓣、花、胚珠、苞、分枝、柄、節、節間、莖皮、柔毛、新芽、根莖、 葉、葉片、花粉、花蕊、微管等。
[0029] 如本文所使用，術語"胚質"是指包含生物體的遺傳素質的物理基礎的基因材料以 及其特定分子和化學組成。
[0030] 如本文所使用，短語"來源于"是指起源或來源，并且可以包括天然存在的、重組、 未純化或純化分子。來源于起源或來源的核酸或胺基酸可以具有如在本文中其它地方定義 的所有類別的核苷酸變化或蛋白質修飾。
[0031] 如本文所使用，術語"后代"是指任何以來自一或多種親本植物或其后代的無性或 有性繁殖的后代形式產生的植物。舉例來說，后代植物可以通過親本植物的克隆或自交或 通過兩種親本植物的雜交獲得并且包括自交體以及Fl或F2或再另一代。Fl為產生自親本 的第一代后代，其中的至少一者第一次用作具有性狀的供體，而第二代（F2)或后續代（F3、 F4等）后代為產生自Fl's、F2's等的自交的標本。Fl因此可以是（并且通常是）由兩個 真實遺傳親本（真實遺傳對于性狀純合）之間的雜交產生的雜種，而F2可以是（并且通常 是）由所述Fl雜種的自花授粉產生的后代。
[0032] 如本文所使用，術語"雜交（cross/crossing) "、"異花授粉（cross pollination) " 或"雜交育種（cross-breeding)"是指將一株植物上的一朵花的花粉涂覆（人工或自然地） 到另一株植物上的花的胚珠（柱頭）的過程。
[0033] 如本文所使用，術語"栽培品種"是指已通過園藝或農藝技術產生并且通常不發現 于野生型群體中的植物品種、品系或族類。
[0034] 如本文所使用，術語"植物組織"是指植物的任何部分。植物器官的實例包括（但 不限于）葉子、莖、根、塊莖、種子、分枝、柔毛、節結、葉腋、花、花粉、花蕊、雌蕊、花瓣、梗、莖 桿、柱頭、花柱、苞、果實、軀干、心皮、萼片、花藥、胚珠、花梗、針葉、球果、根莖、匍匐莖、芽、 果皮、內胚乳、胎盤、漿果、雄蕊和葉鞘。
[0035] 如本文所使用，"植物啟動子"為能夠起始植物細胞中的轉錄，無論其來源是否為 植物細胞的啟動子。
[0036] 如本文所使用，"嚴格雜交條件"包含在存在50%甲酰胺的情況下在42°C下雜交過 夜（12-24小時），接著洗絳，或在約65°C下持續約12到約24小時的5XSSC，接著在65°C 下在0.1 XSSC中洗滌約一小時。
[0037] 如本文所使用，"組成性啟動子"為在大部分條件下和/或在大部分發育階段期 間具活性的啟動子。在用于植物生物技術的表達載體中使用組成性啟動子存在若干優勢， 如：用于選擇轉基因細胞或植物的蛋白質的高生產水準；報告蛋白或評估標記物的高表達 水準，使得易于檢測和定量；調節轉錄系統的一部分的轉錄因子的高生產水準；生產在植 物中需要普遍存在的活性的化合物；和生產在植物發育的所有階段期間所需的化合物。非 限制性示范性組成性啟動子包括CaMV 35S啟動子、冠癭堿啟動子、泛素啟動子、肌動蛋白 啟動子、醇脫氫酶啟動子等。
[0038] 如本文所使用，"非組成性啟動子"為在某些條件下、在某些類型的細胞中和/或在 某些發育階段期間具活性的啟動子。舉例來說，組織特異性、組織優先、細胞類型特異性、細 胞類型優先、誘導型啟動子和在發育控制下為非組成性啟動子的啟動子。在發育控制下的 啟動子的實例包括優先起始在某些組織，如莖、葉子、根或種子中的轉錄的啟動子。
[0039] 如本文所使用，"誘導型"或"阻抑型"啟動子為在化學或環境因素控制下的啟動 子。可能影響通過誘導型啟動子的轉錄的環境條件的實例包括厭氧條件或某些化學品或存 在光。
[0040] 如本文所使用，"組織特異性"啟動子為僅僅在某些組織中起始轉錄的啟動子。不 同于基因的組成性表達，組織特異性表達為若干相互作用水準的基因調節的結果。因此，在 所屬領域中，有時優選的是使用來自同源或緊密相關植物種的啟動子以實現轉基因在特定 組織中的有效和可靠表達。這是大量自特定植物和組織分離的組織特異性啟動子發現于科 學和專利文獻中的主要原因之一。組織特異啟動子的非限制性實例包括塊莖特異性啟動 子、葉特異性啟動子、根特異性啟動子、花特異性啟動子、種子特異性啟動子、分生組織特異 性啟動子等。
[0041] 如本文所使用，"細胞類型特異性"啟動子為主要驅動一或多個器官中的某些細胞 類型中的表達的啟動子。
[0042] 如本文所使用，術語"品種"是指種的亞門，其由種內的在形式或功能上不同于其 它類似陣列的個體的一組個體組成。
[0043] 如本文所使用，術語"基因型"是指個別細胞、細胞培養物、組織、有機體（例如植 物）或有機體群組的基因組成。
[0044] 如本文所使用，術語"克隆體"是指起源于或來源于單一前驅物并且與其在基因上 相同或實質上相同的細胞、細胞群組、一部分、組織、有機體（例如植物）或有機體群組。在 一些實施例中，克隆體以包含至少一個無性生殖步驟的方法產生。
[0045] 如本文所使用，術語"雜種"是指由在一或多種基因中不同的親本之間的雜交產生 的任何個別細胞、組織或植物。
[0046] 如本文所使用，術語"近交系"或"近交品系"是指相對真實遺傳品系。
[0047] 如本文所使用，術語"群體"意指具有共同的基因起源的植物的遺傳上同質或異質 的集合。
[0048] 如本文所使用，術語"品種"或"栽培品種"意指一組類似植物，其可以通過結構特 征和性能與相同種內的其它品種鑒別開來。如本文所用的術語"品種"與1961年12月2 日的保護植物新品種國際公約（International Convention for the Protection of New Variet