一種乳酸脫氫酶人源化釀酒酵母及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種乳酸脫氫酶人源化釀酒酵母及其構建方法，屬于微生物技術領域 和分子生物學技術領域。
【背景技術】
[0002] 釀酒酵母在無氧條件下利用糖酵解途徑來產能并采用乙醇發酵來維持糖酵解途 徑的進行。乙醇發酵包含兩個步驟：首先丙酮酸在丙酮酸脫羧酶（roc)的作用下轉化為乙 醛，然后在乙醇脫氫酶（ADH)的作用下，還原乙醛生成乙醇同時NAD +再生。在有氧條件下， 釀酒酵母利用線粒體中的電子傳遞鏈來產能。
[0003] 在有氧條件下，癌細胞能夠利用葡萄糖作為碳源經糖酵解代謝途徑產生大量的乳 酸。糖酵解途徑對于腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移是必需的。乳酸脫氫酶（LDH)主要是定 位于細胞質中，可逆地催化丙酮酸轉化為乳酸同時NADH被氧化為NAD+。因此，乳酸發酵對 于維持腫瘤細胞糖酵解途徑的進行以及NAD +的再生是必需的。來源于人的LDH有三個亞 基組成，分別為LDHA、LDHB和LDHC。LDHA主要存在于厭氧組織，比如骨骼肌；LDHB主要是 在有氧組織中表達，比如心肌；LDHC則是專門在睪丸中表達。
[0004] LDH是癌細胞增殖和轉移的關鍵酶，在釀酒酵母中異源表達的人的乳酸脫氫酶將 可以作為一種潛在的抗癌藥物的篩選工具，研宄人員可以根據藥物對異源表達的人的乳酸 脫氫酶的作用情況，對藥物性能進行初步評價。此外將人基因文庫中的基因導入到LDH酵 母人源化系統可以篩選能夠調節LDH活性的相關基因。
[0005] 本發明將釀酒酵母編碼PDC的基因 H)C1，PDC5和roC6敲除掉，在釀酒酵母中表達 來源于人的LDH并用抗霉素 A來阻斷電子鏈傳遞，使得人源化的乳酸發酵來代替乙醇發酵 來維持糖酵解的進行。

【發明內容】

[0006] 本發明的第一個目的是提供一種乳酸脫氫酶人源化釀酒酵母，所述釀酒酵母缺失 了丙酮酸脫羧酶基因，且表達人的乳酸脫氫酶。
[0007] 所述缺失的丙酮酸脫羧酶基因是H)C1、PDC5和H)C6。
[0008] 所述roCl、PDC5和roC6,在本發明的一種實施方式中，分別是NCBI上Gene ID為 850733、850825、852978 的基因。
[0009] 所述人的乳酸脫氫酶是LDHA、LDHB或LDHC。
[0010] 所述人的乳酸脫氫酶LDHA、LDHB或LDHC，在本發明的一種實施方式中，分別是 NCBI 上 Gene ID 為 3939、3945、3948 的基因。
[0011] 本發明的第二個目的是一種所述乳酸脫氫酶人源化釀酒酵母的構建方法。
[0012] 所述構建方法，在本發明的一種實施方式中，是：（1)構建H)C1、PDC5和H)C6三基 因缺失菌一釀酒酵母口此1八1)(1(35八1)(1(36八；（2)將人的乳酸脫氫酶0)撤、0)耶或0)!1(：連接 到酵母表達質粒上，然后轉化到釀酒酵母pdcl Apdc5 Apdc6 Δ中，篩選正確的轉化子，即 為乳酸脫氫酶人源化釀酒酵母。
[0013] 所述三基因缺失菌，在本發明的一種實施方式，是以釀酒酵母W303-1A為出發菌 株構建得到的。
[0014] 所述構建方法，在本發明的一種實施方式，具體是：（1)以釀酒酵母W303-1A為 出發菌株，通過同源重組的方法，依次敲出其roci、PDC5、roce三個基因得到釀酒酵母 pdcl Δ pdc5 Δ pdc6 Δ ; (2)將LDHA、LDHB或LDHC連接到pRS424TEF質粒上，得到重組質粒 PRS424TEF-LDHA，pRS424TEF-LDHB 和 pRS424TEF-LDHC，然后通過醋酸鋰 /PEG 的轉化方法將 重組質粒導入釀酒酵母pdcl Δ pdc5 Δ pdc6 Δ中，篩選，測序驗證。
[0015] 本發明的第三個目的是提供一種利用所述乳酸脫氫酶人源化釀酒酵母表達人的 乳酸脫氫酶的方法。
[0016] 所述方法是在SD-Trp培養基中培養乳酸脫氫酶人源化釀酒酵母，并用抗霉素 A來 阻斷電子鏈傳遞，使得人源化的乳酸發酵來代替乙醇發酵來維持糖酵解的進行。
[0017] 所述方法，在本發明的一種實施方式是：挑取酵母單菌落培養至OD66tl= 0. 8-1. 0 后，洗滌細胞并重懸于新鮮培養基中，細胞生長至I. 5 X IO7-L 7 X IO7個/mL時加入抗霉素 A，繼續培養22-26h。
[0018] 所述方法，在本發明的一種實施方式，具體是：挑取酵母單菌落在SD-Trp培養基 中生長至OD 66tl= I. 0后，細胞用無菌水洗滌后，重新懸浮新鮮SD-Trp培養基并使細胞數為 I. 6 X IO7個/mL并加入終濃度為10 μ g/mL的抗霉素 A，繼續培養24h。
[0019] 本發明還要求保護乳酸脫氫酶人源化釀酒酵母生產的乳酸脫氫酶，以及其在篩選 抗癌藥物、篩選能夠調節乳酸脫氫酶活性的基因等方面的應用。
[0020] 本發明的有益效果：采用基因同源重組的方法敲除負責編碼釀酒酵母丙酮酸脫 羧酶基因，將表達人的乳酸脫氫酶的重組質粒轉化到釀酒酵母丙酮酸脫羧酶缺陷型菌株， 28°C~32°C培養長出釀酒酵母單菌落，實現了人的乳酸菌脫氫酶的異源表達，在釀酒酵母 pdcl Δ pdc5 Δ pdc6 Δ三缺陷菌株中表達LDHA或LDHC，加入抗霉素 A后，能夠生長并檢測到 乳酸的產生。乳酸脫氫酶人源化釀酒酵母將可以作為一種潛在的篩選抗癌藥物以及能夠調 節乳酸脫氫酶活性相關基因的工具。
【附圖說明】
[0021] 圖1 :乳酸脫氫酶人源化釀酒酵母在含有抗霉素 A的平板上的生長情況；
[0022] 圖2 :乳酸脫氫酶人源化釀酒酵母產乳酸情況的測定；
[0023] 圖 3 :表達產物的 western blot。
【具體實施方式】
[0024] 實施例1 :pdcl Δ pdc5 Δ pdc6 Δ三基因缺陷菌株的構建
[0025] 乳酸脫氫酶人源化釀酒酵母的構建，包括以下步驟：
[0026] (l)pdc6 Δ缺陷型菌株的構建
[0027] 釀酒酵母roce基因序列設計引物如下：
[0028] 上游引物HX0556 (序列如SEQ ID NO. 1所示）：
[0029] AGTATAAATAAAAAACCCACGTAATATAGCAAAAACATATTGCCAACAAACGGATCCCCGGGTTAATT AA
[0030] 下游引物HX0557(序列如SEQ ID NO. 2所示）：
[0031] TAAGTTTATTTATTTGCAACAATAATTCGTTTGAGTACACTACTAATGGCGAATTCGAGCTCGTTTAA AC
[0032] 利用上游引物和下游引物擴增得到roC6基因，將來源于質粒pFA6a-HIS3MX6的 His片段插入roce基因片段內部，獲得含釀酒酵母roce基因上下游序列的敲除片段，通過 醋酸鋰/PEG的轉化方法將PCR擴增得到的His片段導入到釀酒酵母W303-1A單倍體細胞 中，并進行篩選；將轉化菌株涂布到SD-His缺陷型平板上，待長出菌落后，挑取一定數目的 菌落提取基因組，并進行PCR驗證，并以野生型菌株的基因組進行對比，獲得pdc6 Λ缺陷型 菌株。
[0033] (2) pdc6 Δ pdc5 Δ雙缺陷菌株的構建
[0034] 根據釀酒酵母H)C5基因序列設計引物如下：
[0035] 上游引物HX0552 (序列如SEQ ID NO. 3所示）：
[0036] CATAATCAATCTCAAAGAGAACAACACAATACAATAACAAGAAGAACAAATGTACTGAGAGTGCACCA TA
[0037] 下游引物HX0553(序列如SEQ ID NO. 4所示）：
[0038] AAAGTAAAAAAATACACAAACGTTGAATCATGAGTTTTATGTTAATTAGCATTTCACACCGCATATCG AC
[0039] 利用上游引物和下游引物擴增得到H)C5基因，將來源于質粒PRS305的Leu片段 插入rocs基因片段內部，獲得含釀酒酵母rocs基因上下游序列的敲除片段，通過