一種多樣本多片段dna甲基化高通量測序方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及高通量基因組甲基化DNA檢測領域，尤其涉及一種多樣本多片段DNA 甲基化高通量測序方法。
【背景技術】
[0002] DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳調控因子。在哺乳動物細胞中，DNA甲基化通常 發生在CpG二核苷酸的胞嘧啶上，形成5甲基胞嘧啶。DNA甲基化的改變，尤其是抑癌基因 啟動子區的高甲基化在多種腫瘤的形成和發展過程當中起著重要的作用，同時DNA低甲基 化也與癌基因的過表達和染色體的不穩定相關。
[0003] 當前，研宄DNA甲基化的方法有基因組整體甲基化檢測的甲基化DNA免疫共沉 淀芯片（microarray analysis following methylated DNA immunoprecipitation, MeMe DIP-chip)、甲基化 DNA 免疫共沉淀測序（sequencing analysis following methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP-seq)、簡化的表觀亞硫酸氫鹽測序技術（reduced representation bisulfite sequencing, RRBS)、重亞硫酸鹽全基因組測序（bisulfite genomic sequencing)和特異基因位點甲基化檢測的傳統的重亞硫酸鹽克隆測序、焦磷酸 測序。其中，單個基因位點DNA甲基化檢測的金標準是重亞硫酸鹽克隆測序，其利用重亞硫 酸鹽將基因組DNA中的未甲基化的胞嘧啶（C)修飾為尿嘧啶（U)，甲基化的胞嘧啶（C)保持 不變，在PCR擴增中，尿嘧啶（U)變成胸腺嘧啶（T)，然后將PCR產物連接到特定載體上，轉 化到感受態細菌中，挑取10個以上單克隆菌株進行一代測序，根據參考序列中胞嘧啶位置 C/T的頻率來判斷該位點的甲基化程度。
[0004] 最近有文獻報道了一種新的定量檢測特異片段DNA甲基化的方法，這種方法結合 了重亞硫酸鹽轉化、特異性片段擴增、依賴轉座酶的建庫方式和第二代測序，稱為重亞硫酸 鹽擴增子測序（BiSulfite Amplicon Sequencing，BSAS)。這種方法可以對特異基因組區域 內的甲基化胞嘧啶進行精準的絕對定量。但是該文章中使用的是依賴轉座酶的建庫方式， 使用Illumina公司的Nextera XT建庫試劑盒，使用雙向標簽序列Index，每個測序芯片上 可以最多同時檢測96個樣本。
[0005] 重亞硫酸鹽克隆測序方法是一種可靠性和精確度很高的方法，能明確目的片段中 每一個CpG位點的甲基化狀態，但是不足之處是至少要測序10個以上克隆才能獲得可靠數 據，過程較為繁瑣，耗時耗資過多。
[0006] BSAS的缺點是對于PCR產物使用轉座酶酶切以后，就不能檢測PCR產物兩端被酶 切掉序列的甲基化狀態；每個樣本需要構建一個文庫。而且，還有文獻報道擴增子測序中會 出現等位基因間PCR重組的現象。

【發明內容】

[0007] 針對上述重亞硫酸鹽擴增子測序中存在的問題，本發明提供了一種針對多樣本多 片段的DNA甲基化高通量檢測方法，該方法能夠在一個文庫中同時分析多個樣本、多個目 標片段的DNA甲基化狀態，片段長度可以達到500bp左右，并且PCR重組發生率低，該方法 還具有起始樣本量少、針對性強、成本低、充分利用測序通量等優點。
[0008] 本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：
[0009] -種多樣本多片段DNA甲基化高通量測序方法，其特征在于包括以下步驟：步驟 一：提取基因組DNA，對基因組DNA進行重亞硫酸鹽處理，然后對處理好的基因組DNA進行 PCR擴增，其中針對不同基因片段使用不同的PCR引物，相同的基因片段使用標簽序列區分 不同的樣本；
[0010] 步驟二：將步驟一中不同的PCR產物進行混合，使用混合好的PCR產物進行測序文 庫制備；
[0011] 步驟三：對測序文庫進行QPCR質檢定量；
[0012] 步驟四：上機測序，對不同樣本特異性片段甲基化狀況進行高精度分析。
[0013] 為優化上述技術方案，具體措施還包括：
[0014] 上述樣品基因組DNA可以來源于任意物種，包括但不限于動物、植物、昆蟲的基因 組 DNA。
[0015] 上述步驟1中PCR引物針對不同基因、不同的擴增區域設計，片段長度可以達到 500bp左右（最長片段長度大于500bp);同時在上下游PCR引物的5'端分別加上3個堿基 以上的標簽序列，含不同標簽序列的上下游引物分別組合用以區分不同的樣本。
[0016] 上述步驟一中進行PCR擴增所使用的聚合酶包括針對重亞硫酸鹽轉換后的DNA的 熱啟動taq酶、常規的r-taq酶或其它聚合酶擴增，優選的是針對重亞硫酸鹽轉換后的DNA 的熱啟動taq酶；還包括對擴增產物進行1. 5%的瓊脂糖膠電泳純化的步驟。
[0017] 還包括將純化回收的產物定量，然后將不同樣本的產物按照相同的摩爾數混合， 得到混合的PCR產物的步驟。
[0018] 上述對步驟二的文庫制備利用如下步驟進行：
[0019] 步驟1，對混合后的PCR產物進行定量，優選熒光定量的方法，取50ng進行文庫制 備；
[0020] 步驟2,將混合的PCR產物進行3'末端修復和3'末端添加堿基A ;優選通過T4聚 核苷酸激酶、Klenow片段聚合酶、Klenow片段（3' -5' exo_)聚合酶、dNTP、dATP的作用同 時進行3'末端修復和3'末端添加堿基A ;
[0021] 步驟3,，將3'末端添加堿基A的產物連接測序接頭，獲得測序接頭連接產物；3' 末端添加上堿基A的產物，通過優選的T4DNA連接酶的作用，與測序通用的接頭進行連接， 得到接頭連接效率高的連接產物；
[0022] 步驟4,將測序接頭連接產物進行PCR擴增，其中PCR循環數為6輪，獲得測序文 庫；
[0023] 還包括對文庫制備中各步驟的產物進行純化回收的步驟，純化方法包括但不限于 磁珠純化、純化柱純化、2 %瓊脂糖膠電泳純化，優選磁珠純化。
[0024] 本發明還提供了根據上述的方法建立的測序文庫。
[0025] 本發明還提供了根據上述的方法檢測多個樣本、多個目標片段的DNA甲基化狀 ??τ O
[0026] 針對重亞硫酸鹽擴增子測序中存在的問題，本發明提供了一種針對多樣本多片段 的DNA甲基化高通量檢測方法，該方法能夠在一個文庫中同時分析多個樣本、多個目標片 段的DNA甲基化狀態，片段長度可以達到500bp左右，并且PCR重組發生率低，該方法還具 有起始樣本量少、針對性強、成本低、充分利用測序通量等優點。
【附圖說明】
[0027] 圖1顯示了實施例中所有樣本在CDH13片段內每個胞嘧啶位點甲基化的水平。
[0028] 圖2顯示了實施例中所有樣本在SEPT9片段內每個胞嘧啶位點甲基化的水平。
【具體實施方式】
[0029] 本發明的主要技術流程：提取基因組DNA，然后對基因組DNA進行重亞硫酸鹽處 理，然后對處理好的基因組DNA進行PCR擴增，其中針對不同基因片段使用不同的PCR引 物，相同的基因片段使用標簽（barcode)序列區分不同的樣本，然后將不同的PCR產物進行 混合，混合好的PCR產物進行測序文庫的制備，然后對文庫進行QPCR質檢定量，然后上機測 序，最后進行不同樣本特異性片段甲基化狀況的高精度分析。
[0030] 根據本發明的實施例，其中樣品基因組DNA可以來源于任意物種，包括但不限于 動物、植物、昆蟲的基因組DNA。
[0031] 根據本發明的實施例，將抽提的基因組DNA進行重亞硫酸鹽處理，如利用EZ DNA Methylation-Gold KitTM(ZYMO)使非甲基化胞喃啶轉化為尿喃啶。
[0032] 根據本發明的實施例，其中PCR引物首先針對不同基因、不同的擴增區域設計，片 段長度最長可達500bp左右；其次在上下游PCR引物的5'端分別加上3個堿基以上的標簽 (barcode)序列，含不同barcode的上下游引物分別組合用來區分不同的樣本。
[0033] 根據本發明的實施例，將區分樣本的引物組合設計好以后，以重亞硫酸酸鹽轉化 后的DNA為模板進行PCR擴增，其中所使用的聚合酶包括針對重亞硫酸鹽轉換后的DNA的 熱啟動taq酶、常規的r-taq或其它聚合酶擴增，優選的是針對重亞硫酸鹽轉換后的DNA的 熱啟動taq酶；對擴增產物進行1. 5%的瓊脂糖膠電泳純化。
[0034] 根據本發明的實施例，將純化回收的產物使用NanoD