一株拮抗地黃黃曲霉病原菌的菌株及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物和生物防治技術領域，具體涉及一株拮抗地黃黃曲霉病原菌的菌株及其應用。
【背景技術】
[0002]隨著農業機械化與育種技術的不斷發展，大規模單一化品種種植模式十分普遍，然而單一化連續種植也帶來了很多的負面影響，如造成農作物品種單一、土壤品質下降、病蟲害發生猖獗等一系列問題，我們稱之為連作障礙問題。同樣，在中草藥栽培過程中，連作障礙問題也十分突出。據統計，約70%的塊根類藥用植物都存在不同程度的連作障礙問題，如地黃、人參、太子參、三七、當歸等均存在嚴重的連作障礙問題，這嚴重制約了我國現代大中藥產業鏈的可持續發展。跑歲、Rehmannia glutinosa L.)作為我國最具特色的大宗道地藥材之一，用量列中藥之首，在中藥復方領域有著極廣泛的應用。但是，地黃連作導致藥用部位塊根無法正常膨大，塊根易腐爛，常發生大面積的枯萎病、根腐病等癥狀，從而造成絕收。地黃連作不僅造成產量、品質急劇下降以及土傳病害嚴重，更為嚴重的是，農戶在連作障礙機理尚不清楚的情況下，往往試圖通過濫施肥料、濫用農藥來提高產量，可是效果不佳，還導致環境污染、農殘超標等問題。因此，構建一種合理有效的消減策略對于解決包括地黃在內的藥用植物的連作障礙問題具有十分重要的意義。
[0003]近年來，越來越多的研宄學者認為植物連作障礙的發生與連作下根際土壤微生態結構惡化密切相關，導致病原菌大量上升，而有益菌下降，生物多樣性下降。申請人經過研宄證實，藥用植物地黃連作確實導致根際土壤中黃曲霉等病原菌的數量顯著上升，采用微生物可培養法也從地黃病變根部分離到黃曲霉致病菌株(如圖2所示)，致病性強。利用有益拮抗菌對植物病害進行生物防治被認為是一種高效、科學、安全、生態的措施，得到了國內外農業科技工作者的重視。所以，本發明選用分離到的這株致病性強的黃曲霉病原菌為靶標，從地黃連作土壤中大量篩選拮抗菌株，采用平板對峙培養的方法篩選到一株拮抗效果十分明顯的菌株，經鑒定為油菜假單胞菌，命名為brassicacearum LK_33。

【發明內容】

[0004]本發明公布了一株拮抗地黃黃曲霉病原菌的菌株及其應用，用于生物防治地黃的再植病害，為克服地黃連作障礙問題提供新的生防菌株。
[0005]本發明的技術方案如下:
本發明所提供的措抗細菌為油菜假單胞菌iPsGudomorms bras si cacearum LK-33)，該菌株已于2015年6月9日保藏于北京市朝陽區北辰西路I號院的中國科學院微生物研宄所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC 10968。
[0006]本發明所述的油菜假單胞菌brassicacearum LK-33)對地黃黃曲霉病原菌具有很強的拮抗作用。
[0007]本發明所述的有益拮抗菌具有以下幾個優點: (I)本發明所述的措抗菌一油菜假單胞菌brassicacearum LK-33)是通過大量的篩選工作篩選到的，是從2926株土壤細菌中篩選得到的，對地黃黃曲霉病原菌具有很強的拮抗效果。
[0008](2)本發明所述的措抗菌一油菜假單胞菌(/kewt/offlmas bras si cacearum LK-33)具有群體效應(quorum sensing)系統，與其抗生素的合成相關。
[0009](3)本發明所述的措抗菌一油菜假單胞菌(/kewt/offlmas bras si cacearum LK-33)來源于連作地黃根際土壤中，并非源自其他生境，根際定殖效果較好并且安全可靠，對地黃及其他常見作物(如小麥、玉米、水稻、大豆、花生等)均無致病侵染能力。
【附圖說明】
[0010]圖1為正茬、重茬地黃田間生長狀況比較。
[0011]圖2為地黃病變根部分離到的黃曲霉病原菌的菌落形態.A:表示菌落正面；B:表示菌落反面。
[0012]圖3為油菜假單胞菌iPsGudomorms bras si cacearum LK-33)措抗菌的菌落形態.左邊為PDA平板上正面菌落形態，右邊為PDA平板上背面菌落形態。
[0013]圖4為油菜假單胞菌bras si cacearum LK-33)措抗菌的革蘭氏染色及顯微觀察。
[0014]圖5為油菜假單胞菌brassicacearum LK-33)與地黃黃曲霉病原菌的對峙培養照片.平板中心接種黃曲霉病原真菌，平板上方、左側均接種分離篩選到的油菜假單胞菌LK-33。
[0015]圖6為油菜假單胞菌bras si cacearum LK-33)措抗菌的群體效應檢測.LK-33表示篩到的拮抗菌株；CV026表示紫色桿菌工程菌，出現藍色菌落表示待檢測的LK-33具有群體效應現象。
【具體實施方式】
[0016]以下結合具體實施例對本發明的技術方案進行詳細的描述。以下實施例僅僅用于說明和解釋本發明，而不構成對本發明技術方案的限制。
[0017]實施例1措抗菌油菜假單胞菌LK-33)的分離篩選
本發明所述的措抗菌油菜假單胞菌brassicacearum LK-33)從連作地黃根際土壤中篩選得到。
[0018]1.1假單胞菌選擇性培養基配制
假單胞菌選擇性培養基(pseudomonas selective isolat1n agar, PSIA)配方如下:20 g大豆-酪蛋白消化物瓊脂培養基(soybean casein digest agar，SO)) (BD, USA)，加入到495.5 mL雙蒸水中攪拌加熱，充分溶解后，再加入I mL 0.1% (wt/vol)結晶紫儲備液，高溫高壓滅菌后冷卻至50° C左右時，往培養基中再添加3.5 mL 5% (wt/vol)呋喃咀啶儲備液，混勻后迅速倒板。
[0019]1.2根際土壤中假單胞菌分離篩選
取5 g過篩的地黃連作土壤，加入到45 mL無菌水中，得KT1稀釋液，取該稀釋液5 mL至另一瓶45 mL的無菌水中，充分振蕩，得10_2稀釋液，再次稀釋得10 _3稀釋液，三個稀釋度的土壤溶液各吸取60 y L進行涂板，每個稀釋度均涂3個平板，置于32° C恒溫培養箱中避光培養30 ho挑選單菌落清晰可辨且生長均勻的平板，采用平行劃線的方法進行單菌落純化，確認為單一細菌菌落后保存備用。
[0020]1.3地黃黃曲霉病原菌的拮抗菌篩選
配制馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA，馬鈴薯200 g/L;葡萄糖30 g/L;瓊脂15 g/L)，高溫高壓滅菌后迅速倒板，冷卻凝固即制得平板，在培養皿底部過圓心畫十字架，在距離圓心2.5cm處接種經活化培養的假單胞菌，置于28° C恒溫培養箱中避光培養48 h后，在培養皿的中心位置接種黃曲霉病原菌，置于28° C恒溫培養箱中避光對峙培養數天，實時觀察抑菌圈的形成及大小。對峙培養5天后，通過觀察抑菌圈大小篩選出一株對地黃黃曲霉病原菌拮抗效果顯著的假單胞菌。將該拮抗菌進行純化培養后，用于鑒定及拮抗效果評價。
[0021]實施例2措抗菌油菜假單胞菌LK-33)的鑒定
2.1本發明所述的拮抗菌(保藏編號為:CGMCC 10968)經顯微觀察可以看到該菌為桿菌，在PDA培養基上培養時菌落扁平、表面濕潤光滑，但邊緣有明顯褶皺，粗糙不規則。菌落微黃色(如圖3所示)。革蘭氏染色陰性(如圖4所示)。
[0022]2.2 16s-23s rRNA 基因區間 PCR 鑒定
將篩選出的強拮抗菌株(保藏編號為:CGMCC 10968)轉接至LB液體培養基進行擴大培養，提取基因組 DNA，經引物 1405f (5，-TGYACACACCGCCCGT-3’)和 456r (5，-CCTTTCCCTCACGGTACTG -3’)PCR擴增16s-23s rRNA基因區間，產物純化后進行測序，測序序列采用BLAST工具與NCBI數據庫進行比對分析。經鑒定該措抗菌為油菜假單胞菌，命名為Pseudomonasbrassicacearum LK-330
[0023]實施例3拮抗菌LK-33的抑菌效果檢測
配制PDA培養基，經121° C高溫高壓滅菌后迅速倒板，冷卻凝固后制得PDA平板，在培養皿底部過圓心畫十字架，在距離圓心2.5 cm處接種經活化培養的假單胞菌LK-33，置于28° C恒溫培養箱中避光培養48 h后，在培養皿的中心位置接種病原真菌，置于28° C恒溫培養箱中避光對峙培養數天，實時觀察抑菌圈的形成。培養5天發現，油菜假單胞菌(Pseudomonas brass!cacearum LK-33)能夠高效措抗地黃黃曲霉病原菌，抑制其菌絲生長，抑菌圈寬度可達0.5 cm，菌絲抑制率達66% (如圖5所示)。
[0024]實施例4拮抗菌LK-33的群體效應檢測
紫色桿菌(Chromobacterler v1laceuird^N工程菌是 C.v1laceum ATCC31532 的min1-Tn5突變體，其基因被破壞，該基因是其群體效應信號分子AHLs合成酶表達基因，因此CV026自身不能產生AHLs，也就不產生紫色桿菌素。但當其周圍存在信號分子AHLs時，CV026群體效應系統被激活，誘導紫色桿菌素基因的表達，菌落指示藍色。利用這一特性可用CV026工程菌進行待測菌的群體效應檢測。具體做法如下:將篩選到的拮抗菌LK-33進行LB平板劃線活化，之后將其與報告菌株CV026平行劃線(二者間距2 mm左右)，32°C培養過夜，觀察報告菌株CV026是否顯紫色及其顯色程度，從而判斷拮抗菌是否具有產生信號分子AHLs的能力，即判斷是否具有群體效應現象。結果顯示:篩選到的措抗菌Pseudomonasbras si cacearum LK-33具有明顯的群體效應現象(如圖6所示)。
[0025]綜上可見，本發明篩選出的一株拮抗菌(保藏號為:CGMCC 10968)對地黃黃曲霉病原菌具有很強的拮抗作用，并且具有群體效應系統，這與其抗生素的合成相關，該菌株可用于生物防治地黃連作造成的土傳病害問題，具有廣闊的應用前景。
[0026]以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。
【主權項】
1.一株用于拮抗地黃黃曲霉病原菌的拮抗細菌，其特征在于:所述的拮抗菌株為油菜假單胞菌Pseudomonas brassicacearum LK-33，已于2015年6月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏編號為CGMCC 10968。
2.—種如權利要求1 一株用于拮抗地黃黃曲霉病原菌的拮抗細菌在防治藥用植物地黃土傳病害和再植病害上的應用。
【專利摘要】本發明提供了一株拮抗地黃黃曲霉病原菌的高效拮抗菌，該菌經鑒定為油菜假單胞菌，命名為Pseudomonas brassicacearum LK-33，保藏號為CGMCC 10968。本發明公開的油菜假單胞菌LK-33是采用平板對峙培養方法從連作地黃根際土壤中篩選得到，對分離至地黃病變部位的黃曲霉病原菌具有很強的拮抗作用，同時發現該拮抗菌具有群體效應（quorum sensing）系統。本發明公布的油菜假單胞菌LK-33可有效防治連作地黃的土傳病害如黃曲霉病原菌，可為生物防治藥用植物的再植病害提供新的生防菌株，具有廣闊的應用前景。CGMCC 09
【IPC分類】C12N1-20, C12R1-38, A01P3-00, A01N63-00
【公開號】CN104862261
【申請號】CN201510317635
【發明人】吳林坤, 林文雄, 王娟英, 吳紅淼, 陳軍, 林生
【申請人】福建農林大學
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年6月11日