一種連續制備蘿卜硫素的方法
【專利說明】
一、技術領域
[0001]本發明屬于天然活性物質分離純化技術領域，具體涉及蘿卜硫素的制備方法。
二、【背景技術】
[0002]流行病學及藥理學等的研宄表明，十字花科蔬菜含有阻止或減緩癌癥發展的活性成分，例如西蘭花，是十字花科蕓苔屬甘藍種中以綠色花球為產品的一個變種，其種子中含有豐富的硫代葡萄糖苷。硫代葡萄糖苷在硫代葡萄糖苷酶或酸的催化下，生成蘿卜硫素等異硫氰酸鹽。蘿卜硫素是迄今為止蔬菜中發現的最強抗癌成分之一，它可誘導機體產生Phase II型解毒酶-谷胱甘肽轉移酶和醌還原酶，該酶能解除親電子致癌物質的毒性作用，干擾其對DNA的結合及破壞，同時抑制Phase I酶的產生，從而影響癌的形成。所以，從十字花科蔬菜中分離純化蘿卜硫素具有重要的科學價值和廣闊的市場前景。
[0003]目前制備蘿卜硫素的方法有:1.申請號為201210414994.2、名稱為“一種高純度蘿卜硫素的提取純化方法”的發明專利，該專利公開的方法是以干燥西蘭花種子粉加水水解，獲得固液混合物；再向該混合物中加入無水乙醇，進行超聲浸提、抽濾或雙層紗布過濾，獲得濾液；接著對濾液進行真空濃縮，蒸發乙醇并獲得濃縮液；濃縮液進行大孔樹脂柱層析及用乙醇水溶液進行梯度洗脫，獲得含蘿卜硫素洗脫液并繼續進行氧化鋁柱層析、濃縮，獲得蘿卜硫素浸膏粗品；最后將獲得的粗品加水溶解后用極性溶劑萃取，收集有機層冰并真空濃縮獲得油狀浸膏，即高純蘿卜硫素。該方法存在的主要問題是:①未對種子進行脫月旨，由于油脂的阻擋，西蘭花種子中的硫代葡萄糖苷和硫代葡萄糖苷酶難以有效接觸，導致蘿卜硫素的生成率低；②未對水解液進行pH、溫度條件的控制，硫代葡萄糖苷酶對硫代葡萄糖苷的水解處于非優化環境，致使大量雜質生成，分離純化困難且成本高；③用乙酸乙酯萃取的選擇度低，不僅可萃取蘿卜硫素，還可萃取其類似物，且在較高溫度下真空濃縮，蘿卜硫素不穩定，易重排生成多種異構體，產品純度低；④無水乙醇回收率低，生產成本高，缺乏競爭力。2.申請號為201310408729.8、名稱為“一種從西蘭花中提取蘿卜硫素的方法”的發明專利，其公開的方法為:將新鮮西蘭花的食用部分花枝脫水后烘至恒重并粉碎，獲得西蘭花干粉；將新收獲的芥籽粉碎提取，再真空抽濾除雜，得到粗酶液；向所述西蘭花干粉中加入所述粗酶液，攪拌均勻，經酶解、超聲波振蕩提取并過篩及真空抽濾除渣、真空濃縮后獲得蘿卜硫素粗提水溶液；向蘿卜硫素粗提水溶液中加入乙酸乙酯萃取、收集乙酸乙酯相并真空濃縮成膏狀蘿卜硫素粗提物；將膏狀蘿卜硫素粗提物經冷凍干燥至恒重，即得純度為1%?15%的蘿卜硫素粗品。該方法存在的主要問題有:①新鮮西蘭花食用部分含水量高達90%左右，進行干燥耗能極高且在高溫環境下蘿卜硫素快速分解；②新鮮芥籽受季節控制，難以常年生產且粗酶液中雜質和雜酶均多，水解生成的雜質多，蘿卜硫素生成率低；③因為蘿卜硫素在水溶液中的穩定時間僅約90分鐘，而水解時間長達8小時，在此期間蘿卜硫素大量重排或異構化，導致蘿卜硫素生成率極低。由此可知，上述己公開發明專利存在著蘿卜硫素生成率極低、生產時間長、能耗高、產品純度低、成本高等共同缺陷，有必要進一步研發新方法，提升蘿卜硫素生成率和純度、降低生產成本。三、

【發明內容】

[0004]本發明的目的是針對現有制備蘿卜硫素的方法的不足之處，提供一種以蘿卜種子為原料，制備高純度蘿卜硫素的方法。該方法通過原料脫脂、對水解PH值、酶解溫度、酶解時間的調節及外加蘿卜硫苷等方式，實現蘿卜硫素的連續、規模化和高純度制備。該方法具有充分利用資源，蘿卜硫素生成率高、可操作性強、可自動化連續化生產、產品純度高達98%以上，綠色無污染等特點。
[0005]本發明的原理是:蘿卜細胞既含有蘿卜硫苷，又含有硫代葡萄糖苷酶，蘿卜種子中蘿卜硫苷在特定條件下可被硫代葡萄糖苷酶水解，生成蘿卜硫素；蘿卜種子油脂含量高達30%以上，由于油脂不溶于水，而蘿卜硫苷和硫代葡萄糖苷酶均為水溶性物質，兩類物質互不相溶。因此，大量油脂存在會干擾蘿卜硫苷和硫代葡萄糖苷酶的有效接觸，進而影響硫代葡萄糖苷酶對蘿卜硫苷的水解，故必須進行脫脂處理；完整蘿卜籽不利于溶劑進出，影響脫脂效率，所以使用中藥破碎機刀片旋轉進行破碎處理，制備成蘿卜籽粉；蘿卜籽油脂易溶于正己烷，以正己烷為溶劑，在適當條件下對其粉末進行浸取，即可獲得脫脂蘿卜籽粉；在適當條件下，純水以一定流速通過以脫脂蘿卜籽粉裝配出的蘿卜硫苷連續水解柱時，脫脂蘿卜籽粉中的蘿卜硫苷溶于其中，形成蘿卜硫苷水溶液；由于自身含有的蘿卜硫苷量少，硫代葡萄糖苷酶將其水解完后尚存活力，因而，可繼續水解外加的蘿卜硫苷。當外加蘿卜硫苷水溶液中的蘿卜硫苷擴散至硫代葡萄糖苷酶附近，也被該酶水解成蘿卜硫素，從而實現對蘿卜硫苷的連續化水解；非極性大孔吸附樹脂在水溶液中可選擇性吸附蘿卜硫素等化合物，以蘿卜硫苷連續水解柱的出液口串聯大孔吸附樹脂柱的進液口，組成蘿卜硫苷連續水解-分離耦合系統；水解生成的蘿卜硫素從蘿卜硫苷連續水解柱流出便進入大孔吸附樹脂柱進行吸附分離，極大縮短了蘿卜硫素在水中的停留時間，因而顯著降低了蘿卜硫素的重排和異構化反應，增加了蘿卜硫素生成率；蘿卜硫素結構獨特，與大孔吸附樹脂形成特殊的相互作用，用特殊洗脫劑洗脫，就實現了對該化合物的有效分離；制備型高效液相色譜法是一種使用高壓、大流量液體輸送系統在高分辨率、大內徑、高載量分離柱上進行樣品高純度分離的液相色譜制備方法，由于制備型液相色譜的塔板數極高，分離效率高，可將其它雜質一一分離，制備出高純度的蘿卜硫素；冷凍干燥是在較低的溫度條件及環境下把含有大量水分的蘿卜硫素，預先進行降溫凍結成固體，然后在真空的條件下使水蒸汽直接從固體中升華出來，當98%以上的水分被脫除即獲得能長期保存的高純度蘿卜硫素。
[0006]本發明的目的是這樣實現的:一種連續制備蘿卜硫素的方法，以蘿卜籽為原料，經歷制備脫脂蘿卜籽粉、裝配蘿卜硫苷連續水解柱、裝配蘿卜硫苷連續水解分離系統、制備蘿卜硫苷液、制備富集蘿卜硫素大孔吸附樹脂柱、制備蘿卜硫素初級濃縮液及制備高純度蘿卜硫素步驟，制備出純度高達98%以上的蘿卜硫素。其具體的工藝步驟如下:
[0007]1.制備脫脂蘿卜籽粉
[0008]取風干后含水量低于8%的蘿卜籽，先用中藥粉碎機粉碎，再按照蘿卜籽粉質量(kg):正己烷體積(L)之比為1: 4?8的比例，先將蘿卜籽粉置于罐式浸出器中，泵入正己烷，控制溫度為20?40°C，進行第一次攪拌脫脂30?60min。第一次攪拌脫脂完成后，放出溶解有蘿卜籽油脂的正己烷，再泵入正己烷進行第二次攪拌脫脂，第二次攪拌脫脂泵入的正己烷體積及脫脂溫度和時間均與第一次攪拌脫脂相同。第二次攪拌脫脂完成后，放出溶解有蘿卜籽油脂的正己烷。第二次攪拌脫脂后的脫脂蘿卜籽渣，在攪拌下通入表壓為0.1?0.4MPa、流速為5?15m/s的壓縮空氣，壓出脫脂蘿卜籽粉渣中殘余的正己烷，直至無正己烷滴出時止。分別收集第一次、第二次攪拌脫脂放出、壓縮空氣壓出的溶解有蘿卜籽油脂的正己烷及含正己烷的壓縮空氣，對收集的含正己烷的壓縮空氣，送入冷凝器中進行冷凝處理，回收正己烷；對于第一次、第二次攪拌脫脂放出及壓縮空氣壓出的溶解有蘿卜籽油脂的正己烷進行合并，再送至脫溶劑釜進行脫正己烷處理，回收正己烷并獲得粗制蘿卜籽油；對獲得的粗制蘿卜籽油，進行精煉處理，制備出精煉食用蘿卜籽油；對于收集的脫脂蘿卜籽粉，用于制備蘿卜硫苷連續水解柱或制備蘿卜硫苷液。
[0009]2.裝配蘿卜硫苷連續水解柱
[0010]第I步完成后，將第I步制備的脫脂蘿卜籽粉用20?60目的不銹鋼篩網進行篩分，分別收集過篩物和未過篩物。對于收集的未過篩物，將其裝填于內徑為100?200_、高度為600?1200_的自制不銹鋼夾層水解柱中，直至裝填高度達到500?1000_時，再連接好轉換接頭，裝配出蘿卜硫苷連續水解柱，用于連續水解蘿卜硫苷；對于收集的過篩物，即為脫脂蘿卜籽細粉，用于制備蘿卜硫苷液。
[0011 ] 3.裝配蘿卜硫苷連續水解分離系統
[0012]第2步完成后，先按照HPD-700或HPD-600大孔吸附樹脂體積(L):脫脂蘿卜籽粉質量(kg)為1: 20?30的比例，將新購HPD-700或HPD-600大孔吸附樹脂裝入內徑為50?100mm、高度為500?600mm的不銹鋼層析柱，直至裝填高度達到500?600mm時，連接好轉換接頭，就裝配出大孔吸附樹脂層析柱；接著按照使用說明書的要求，先向大孔吸附樹脂層析柱中泵入乙醇，直至泵入的乙醇完全浸沒大孔吸附樹脂時止，接著浸泡4?6h，再泵出乙醇，洗滌至流出液中無紫外吸收，然后用純水洗滌至無乙醇味時止。分別收集浸泡、洗滌大孔吸附樹脂后的乙醇和用乙醇及純水洗滌后的大孔吸附樹脂層析柱。對收集的浸泡、洗滌大孔吸附樹脂后的乙醇，進行蒸餾回收；對收集的先后用乙醇、純水洗滌后的大孔吸附樹脂層析柱，即為活化大孔吸附樹脂層析柱。將收集的活化大孔吸附樹脂層析柱的進液口與第2步裝配出的蘿卜硫苷連續水解柱出液口用管道連接，就裝配出蘿卜硫苷連續水解分離系統，用于連續水解蘿卜硫苷，分離蘿卜硫素。
[0013]4.制備蘿卜硫苷液
[0014]第3步完成后，將第2步收集的脫脂蘿卜籽細粉置于熱風烘箱中，在85?100°C的溫度下處理I?2h，進行硫代葡萄糖苷酶失活處理，失活處理完成后，按照硫代葡萄糖苷酶失活后的脫脂蘿卜籽細粉質量(kg):甲醇體積(L)為1: 10?20的比例，把硫代葡萄糖苷酶失活后的脫脂蘿