一種制備乙醇發酵的固定化種子的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及一種制備乙醇發酵的固定化種子的方法。
【背景技術】
[0002] 乙醇又稱酒精，是重要的基本化工原料，它既可用于生產香料、染料、涂料、醫藥、 合成橡膠、洗滌劑、農藥等行業的中間體，又是重要的有機溶劑，廣泛用于醫藥、衛生用品、 涂料、化妝品等各個領域。此外，乙醇還可用作汽車燃料，在一些國家作為汽車燃料的摻和 劑，而在巴西己使用100%的乙醇作燃料。
[0003] 發酵法是生產乙醇的經典方法，1930年以前，世界上所有工業乙醇均由發酵法生 產。發酵法通常采用淀粉、纖維素、農產品、林產品、農副產品及野生植物為原料，經水解 (即糖化）和發酵，使多糖、二糖轉化為單糖，并進一步轉化為乙醇。盡管隨著石油化工的迅 速發展，用合成法生產乙醇的量越來越大，但由于合成乙醇中帶有異構高碳醇等對人體有 不良作用的雜質，不宜制作飲料、食品、醫藥及香料等，因此化學合成法不可能完全取代發 酵法。世界各國發酵法乙醇仍然保持一定的生產規模，如美國當前發酵法乙醇的生產能力 達每年4. 8Mt。由于各國資源不同，發酵法乙醇所用原料亦各有特點，如瑞典、挪威、芬蘭等 國森林資源豐富，造紙工業發達，采用亞硫酸鹽紙漿廢液作原料的發酵法乙醇比例很大，巴 西和古巴盛產蔗糖，則全部采用甘蔗糖蜜作原料來生產乙醇。
[0004] 目前我國90%以上的乙醇是用發酵法生產。其中，約90%的發酵法生產裝置采 用淀粉質作原料，以淀粉為原料生產乙醇多采用間歇發酵工藝，而用糖蜜生產乙醇多采用 連續式發酵工藝。無論是間歇式發酵工藝，還是連續式發酵工藝，都需要在糖化醪中添加 釀酒酵母種子以進行發酵，因此釀酒酵母種子的活力對發酵的效率具有顯著的影響。例如， CN104099377A提供了一種提高酒精生產效率的方法，該方法以ACE2單基因缺失的釀酒酵 母菌株和/或SWI5單基因缺失的釀酒酵母菌株發酵生產酒精，具體地是將發酵菌株先制 備生成種子菌液，然后加入培養基中進行發酵，從發酵產物中獲得乙醇。但在實際生產過程 中，生成的種子菌液不耐儲存，儲存4-12小時后再進行發酵，就會使得發酵效率下降，發酵 周期延長。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種制備乙醇發酵的固定化種子的方法，該方法能夠增強乙 醇發酵的種子在儲藏以后的活性，從而提高乙醇發酵的發酵效率并提高成熟醪中的酒精 度。
[0006] 為了實現上述目的，本發明提供了一種制備乙醇發酵的固定化種子的方法，其 中，該方法包括如下步驟：（1)將含有釀酒酵母活菌體的懸濁液與海藻酸鈉水溶液混合， 得到第一混合液，其中，混合的條件使得所述第一混合液中海藻酸鈉的濃度為1. 5-2. 5重 量％ ;(2)將所述第一混合液滴加到處于攪拌中的3-7重量％的氯化鈣溶液中，得到含有 球狀顆粒的物料，攪拌的條件使得所述球狀顆粒的直徑為3-10毫米；（3)將所述含有球狀 顆粒的物料進行超聲波處理，超聲波處理的條件包括：強度為10-100W/平方英寸，頻率為 10-50kHz，時間為5-120分鐘。
[0007] 通過上述技術方案，本發明的制備方法獲得的乙醇發酵的固定化種子在儲藏 20-40天后還能保持較高的發酵活性。
[0008] 本發明的其他特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【附圖說明】
[0009] 附圖是用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發明，但并不構成對本發明的限制。在附圖中：
[0010] 圖1是測試實施例1中測定實施例1-5和對比例1-2的發酵液中的酵母活菌體數 隨時間變化的關系。
【具體實施方式】
[0011] 以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0012] 在本發明中，在未作相反說明的情況下，使用的氣體和液體的體積均為1個標準 大氣壓和20 °C下的數值。
[0013] 本發明提供了一種制備乙醇發酵的固定化種子的方法，其中，該方法包括如下步 驟：（1)將含有釀酒酵母活菌體的懸濁液與海藻酸鈉水溶液混合，得到第一混合液，其中， 混合的條件使得所述第一混合液中海藻酸鈉的濃度為1. 5-2. 5重量％ ; (2)將所述第一混 合液滴加到處于攪拌中的3-7重量％的氯化鈣溶液中，得到含有球狀顆粒的物料，攪拌的 條件使得所述球狀顆粒的直徑為3-10毫米；（3)將所述含有球狀顆粒的物料進行超聲波處 理，超聲波處理的條件包括：強度為10-100W/平方英寸，頻率為10-50kHz，時間為5-4120 分鐘。
[0014] 其中，為了進一步提高制備得到的固定化種子的發酵活性，優選情況下，所述超聲 波處理的條件包括：強度為40-60W/平方英寸，頻率為30-40kHz，時間為10-60分鐘。
[0015] 其中，超聲波處理可以連續進行，也可以間歇式的進行，為了降低超聲波的熱效 應，優選情況下，超聲波處理的條件還包括：超聲波處理的時間分2-6個階段，相鄰的兩個 階段之間保持靜置5-120分鐘。
[0016] 其中，所述含有釀酒酵母活菌體的懸濁液中釀酒酵母活菌體的濃度可以為發酵種 子液中常規的菌體濃度，例如，所述含有釀酒酵母活菌體的懸濁液中釀酒酵母活菌體的濃 度為10 n-1013個細胞/升，優選地，所述含有釀酒酵母活菌體的懸濁液中釀酒酵母活菌體的 濃度為1〇 12_ (5 X 1012)個細胞/升。
[0017] 其中，所述含有釀酒酵母活菌體的懸濁液的懸浮介質可以為使用海藻酸鈉制備固 定化顆粒中常規使用的懸浮介質，例如蒸餾水或生理鹽水，所述含有釀酒酵母活菌體的懸 池液的懸浮介質為蒸餾水。
[0018] 其中，所述海藻酸鈉水溶液中海藻酸鈉的濃度可以為使用海藻酸鈉制備固定化顆 粒中常規使用的濃度，例如，所述海藻酸鈉水溶液中海藻酸鈉的濃度可以為3-5重量％，優 選為3. 5-4. 5重量％。
[0019] 其中，步驟（2)中，攪拌的速率可以為使用海藻酸鈉制備固定化顆粒中常規使用 的轉速，例如可以為50-500轉/分鐘，優選100-200轉/分鐘。
[0020] 其中，步驟⑵中，滴加所述第一混合液的滴加速率可以為5-80滴/分鐘，優選為 20-50滴/分鐘。
[0021] 其中，步驟（2)中，優選地，將所述第一混合液滴加到處于攪拌中的4-6重量％的 氯化鈣溶液中。
[0022] 其中，為了進一步提高制備得到的固定化種子的發酵活性，優選情況下，混合的條 件使得所述第一混合液中海藻酸鈉的濃度為1-4重量％。
[0023] 其中，優選地，所述超聲波處理在外貼超聲振子設備中進行。
[0024] 其中，含有釀酒酵母活菌體的懸濁液可以通過將釀酒酵母接種到種子培養基中培 養至菌體濃度為10 1(l-1012CFU/mL，然后收獲活菌體并用懸浮介質懸浮為懸浮液。其中，種 子培養基可以為各種常規使用的活化釀酒酵母所用的培養基，例如可以為含有100_200g/ L 的葡萄糖、3-8g/L 的 KH2P04、l-3g/L 的（NH4)2S04、3-8g/L 的酵母浸粉、l-3g/L 的 MgSOjP 0. 1-0. 3g/L 的 CaCl2的培養基。
[0025] 其中，含有球狀顆粒的物料可以是將球狀顆粒分離后再加入3-7重量％的氯化鈣 溶液的物料，也可以步驟（2)攪拌結束后直接獲得的物料。含有球狀顆粒的物料中，球狀顆 粒浸沒于液體中。
[0026] 以下，通過實施例進一步詳細說明本發明。
[0027] 實施例1
[0028] 將釀酒酵母（購自安琪酵母股份有限公司）接種于種子培養基（含有150g/L的葡 萄糖、5g/L 的 KH2P04、2g/L 的（NH4)2S04、5g/L 的酵母浸粉、2g/L 的 MgSO# 0. 2g/L 的 CaCl 2 的培養基）中，在30°C和200轉/分下培養30小時，得到菌體濃度為10nCFU/mL的培養液， 將該培養液離心去除培養基得到活菌體，將活菌體用蒸餾水懸浮為活菌體濃度2. 5X 1012 個細胞/升的懸浮液，將該懸浮液與4重量％的海藻酸鈉溶液混合均勻，使得混合后得到的 第一混合液中的海藻酸鈉的濃度為2重量％。
[0029] 將上述得到的第一混合液以40滴/分鐘的速度滴入到以200轉/分鐘的攪拌速 率攪拌中的5重量％的氯化鈣溶液中，得到直徑為5毫米左右的球狀顆粒。撈出上述球狀 顆粒，浸沒于5重量％的氯化鈣溶液中，得到含有球狀顆粒的物料。
[0030] 將所述含有球狀顆粒的物料放置在外貼超聲振子設備（購自蘇州富怡達超聲波 有限公司，升降式單槽超聲波清洗機）中，在強度為50W/平方英寸，頻率為35kHz，時間為 80分鐘的條件下進行超聲波處理，其中，超聲波處理的時間分4個階段，每個階段20分鐘， 相鄰的兩個階段之間保持靜置100分鐘的靜置間隔。超聲處理結束后，撈出球狀顆粒，即得 到乙醇發酵的固定化種子。
[0031] 實施例2
[0032] 將釀酒酵母（購自安琪酵母股份有限公司）接種于種子培養基（含有150g/L的葡 萄糖、5g/L 的 KH2P04、2g/L 的（NH4)2S04、5g/L 的酵母浸粉、2g/L 的 MgSO# 0. 2g/L 的 CaCl 2 的培養基）中，在30°C和200轉/分下培養30小時，得到菌體濃度為10nCFU/mL的培養液， 將該培養液離心去除培養基得到活菌體，將活菌體用蒸餾水懸浮為活菌體濃度1〇 12個細胞 /升的懸浮液，將該懸浮液與3. 5重量％的海藻酸鈉溶液混合均勻，使得混合后得到的第一 混合液中的海藻酸鈉的濃度為1. 9重量％。
[0033] 將上述得到的第一混合液以40滴/分鐘的速度滴入到以400轉/分鐘的攪拌速 率攪拌中的4重量％的氯化鈣溶液中，得到直徑為5毫米左右的球狀顆粒。撈出上述球狀 顆粒，浸沒于4重量％的氯化鈣溶液中，得到含有球狀顆粒的物料。
[0034] 將所述含有球狀顆粒的物料放置在外貼超聲振子設備（購自蘇州富怡達超聲波 有限公司，升降式單槽超聲波清洗機）中，在強度為40W/平