一種具有抑制透明質酸酶活性的交聯透明質酸鈉凝膠的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種抑制透明質酸酶活性的交聯透明質酸鈉凝膠的制備方法，本發明 首先將透明質酸酶抑制物通過共價鍵結合在透明質酸鈉凝膠分子上，然后進行二次交聯形 成凝膠，該凝膠可用于軟組織填充、人工玻璃體、關節腔潤滑液補充、藥物緩釋載體等，屬于 醫療領域。
[0002] 技術背景
[0003] 透明質酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰-氨基葡萄糖雙糖重復單元組成的線性高分 多糖，廣泛分布于哺乳動物的結締組織、玻璃體、胎盤等器官和組織中。透明質酸具有良好 的生物相容性和無免疫原性，廣泛應用于醫療、美容、化妝品等領域。但由于人體內含有特 異性的透明質酸酶，天然透明質酸鈉凝膠在體內會被迅速降解、代謝。交聯透明質酸鈉是透 明質酸鈉通過化學交聯修飾得到的高分子凝膠，彌補了透明質酸鈉存留時間短的弊端，而 傳統的交聯透明質酸鈉凝膠多為顆粒狀或粘度過大，推擠力較大，很難通過小口徑注射器 針頭等，限制了其進一步的拓展應用。
[0004] 現如今市場上出現的透明質酸鈉凝膠產品多采用二乙烯基砜（DVS)、1，4-丁二醇 雙縮水甘油醚（BDDE)等作為交聯劑，為了追求更長的體內降解時間，往往增加交聯劑的加 入量，提高產品的交聯度，但上述交聯劑多具有毒性或致癌性，殘留交聯劑進入體內，會造 成很大的風險，同時在現有的制備工藝在透析過程中，由于交聯后的透明質酸鈉凝膠為三 維網狀立體結構，交聯劑包埋其中，很難去除干凈；因此，為了提高產品的生物安全性，需減 少交聯劑的加入量，但這樣同時會影響產品的交聯度，并最終影響產品的體內殘留時間。
[0005] 針對上述一個看似矛盾的難題，目前還沒有出現相關的專利來闡述上述問題，本 發明就針對這對矛盾體，從另外一個角度來解決該問題。體內植入交聯透明質酸鈉凝膠后 的殘留時間本質上是體內透明質酸酶的降解作用，傳統的專利中提高體內殘留時間主要是 通過提高交聯度來延長殘留時間，而本專利另辟蹊徑，將透明質酸酶抑制物共價結合到透 明質酸鈉凝膠分子上，通過抑制體內透明質酸酶的活性來達到延長體內的殘留時間。
[0006] 本發明采用BDDE或DVS作為交聯劑，首先在酸性條件下利用透明質酸鈉分子中被 活化的羧基，將含有羧基的酶抑制物共價交聯至透明質酸鈉凝膠分子上，然后再加入天然 透明質酸鈉凝膠，調整至堿性利用堿性條件下羥基被活化的特點，將含有酶抑制劑的透明 質酸鈉分子進行交聯，再通過酒精沉淀，得到含有酶抑制劑的交聯透明質酸鈉干粉，PBS復 溶得到含有透明質酸酶抑制劑的交聯透明質酸鈉凝膠。
[0007] 該方法制備的交聯透明質酸鈉凝膠中含有透明質酸酶抑制劑，可以有效降抑制透 明質酸酶的活性，進而延長體內的殘留時間。以往的交聯透明質酸凝膠的制備方法(如專利 CN101036808,專利CN1950039等）得到的凝膠均為不溶于水的固體凝膠，需要通過制備為 具有一定直徑的微粒后才能使用，本發明專利提供的方法各個步驟都在均一的水相環境下 進行，通過酒精沉淀可以最大限度地去除未反應的交聯劑，提高產品的生物安全性。
[0008]
【發明內容】
[0009]發明優點 1.本發明中引入了透明質酸鈉酶抑制劑，植入體內后可以有效抑制透明質酸酶的活 性。
[0010] 2.本發明通過酒精沉淀和透析相結合的方法去除未反應的交聯劑。
[0011] 3.本發明分別在酸性和堿性條件下進行二次交聯反應，提高了交聯劑的利用率降 低了體內長期植入后的風險，提高了體內使用的生物安全性。
[0012] 為實現以上目的，本發明提供的技術方案為： 第一步：透明質酸鈉溶液的配置 第二步：酸性交聯反應 第三步：堿性交聯反應 第四步：酒精沉淀 第五步：沉淀干粉的復溶 第六步：透析。
【附圖說明】
[0013] 圖1不同聚谷氨酸含量的交聯透明質酸鈉凝膠對透明質酸酶活性的影響。
[0014]
【具體實施方式】
[0015] 現結合實施例，對本發明作了詳細描述： 實施例一 稱取分子量為120萬道爾頓的透明質酸鈉干粉10g，分子量為100萬的Y_聚谷氨酸 干粉5g，采用100ml含有0. 5gl，4- 丁二醇二縮水甘油醚的0. 5% (w/w)的鹽酸溶液將其溶 齊U，然后室溫25°C反應24小時，得到酸性交聯凝膠。然后在酸性交聯凝膠中加入100ml濃 度為1%的氫氧化鈉溶液，溶解均勻后，放入5°C恒溫恒濕反應柜中反應7天后，得到堿性交 聯凝膠。采用0. 5%氫氧化鈉將二次交聯凝膠稀釋到1000ml，然后采用95%的乙醇沉淀，洗 滌2遍。然后采用磷酸鹽緩沖溶液將得到的干粉溶解到400ml，溶解均勻后裝透析袋透析3 天，得到樣品1。
[0016] 實施例二 稱取分子量為120萬道爾頓的透明質酸鈉干粉12g，分子量為100萬的Y_聚谷氨酸 干粉5g，采用100ml含有0. 5gl，4- 丁二醇二縮水甘油醚的0. 5% (w/w)的鹽酸溶液將其溶 齊U，然后室溫25°C反應48小時，得到酸性交聯凝膠。然后在酸性交聯凝膠中加入100ml濃 度為1%的氫氧化鉀溶液，溶解均勻后，放入5°C恒溫恒濕反應柜中反應7天后，得到堿性交 聯凝膠。采用0. 5%氫氧化鉀將二次交聯凝膠稀釋到1000ml，然后采用95%的乙醇沉淀，洗 滌2遍。然后采用磷酸鹽緩沖溶液將得到的干粉溶解到400ml，溶解均勻后裝透析袋透析5 天，得到樣品2。
[0017] 實施例三 稱取分子量為120萬道爾頓的透明質酸鈉干粉12g，分子量為100萬的Y_聚谷氨酸 干粉5g，采用100ml含有0. 5gl，4- 丁二醇二縮水甘油醚的0. 5% (w/w)的鹽酸溶液將其溶 齊U，然后室溫25°C反應48小時，得到酸性交聯凝膠。然后在酸性交聯凝膠中加入100ml濃 度為1%的氫氧化鉀溶液，溶解均勻后，放入5°C恒溫恒濕反應柜中反應5天后，得到堿性交 聯凝膠。采用0. 5%氫氧化鉀將二次交聯凝膠稀釋到1000ml，然后采用95%的乙醇沉淀，洗 滌2遍。然后采用磷酸鹽緩沖溶液將得到的干粉溶解到400ml，溶解均勻后裝透析袋透析5 天，得到樣品3。
[0018] 實施例四 稱取分子量為120萬道爾頓的透明質酸鈉干粉10g，分子量為100萬的Y-聚谷氨酸 干粉5g，采用100ml含有0. 5gl，4- 丁二醇二縮水甘油醚的0. 5% (w/w)的鹽酸溶液將其溶 齊U，然后室溫25°C反應24小時，得到酸性交聯凝膠。然后在酸性交聯凝膠中加入100ml濃 度為1%的氫氧化鈉溶液，溶解均勻后，放入5°C恒溫恒濕反應柜中反應5天后，得到堿性交 聯凝膠。采用0. 5%氫氧化鈉將二次交聯凝膠稀釋到1000ml，然后采用95%的乙醇沉淀，洗 滌2遍。然后采用磷酸鹽緩沖溶液將得到的干粉溶解到400ml，溶解均勻后裝透析袋透析3 天，得到樣品4。
[0019] 對比實施例一 稱取分子量為120萬道爾頓的透明質酸鈉干粉6. 4g，采用100ml蒸餾水溶解后，加入濃 度為25%的碳酸鈉溶液25ml低溫堿化過夜。然后加入二乙烯基砜0. 35g，攪拌均勻后放入 40°C恒溫恒濕反應柜中反應4小時，切成小塊透析6天后，粉碎得到對比樣品1。
[0020] 對比實施例二 稱取分子量為120萬道爾頓的透明質酸鈉干粉10g，采用0. 3g1，4_丁二醇二縮水甘油 醚的50ml濃度為1. 5%的氫氧化鈉溶液溶解均勻，放入5°C恒溫恒濕反應柜中反應7天，切 成小塊透析至500ml，然后粉碎，得到交聯透明質酸鈉凝膠微粒，為對比樣品2。
[0021] 實施例五 分別稱取樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、對比樣品1和對比樣品2各0. 32g，分別加入含 透明質酸酶濃度為50U/ml的磷酸鹽緩沖液8. 0ml，在37°C酶降24h，然后檢測酶解液中糖醛 酸含量，計算得到4個樣品的24h降解率，分別為：
【主權項】
1. 一種抑制透明質酸酶活性的交聯透明質酸鈉凝膠的制備方法，其特征在于控制透明 質酸鈉分子不同的活化基團以及不同的交聯時間，在交聯透明質酸鈉分子中引入透明質酸 酶抑制劑；首先酸性條件下將透明質酸酶抑制劑引入透明質酸鈉分子，然后再在堿性條件 下將引入透明質酸酶抑制劑的透明質酸鈉分子進行交聯反應，最后通過酒精沉淀得到含有 透明質酸酶抑制劑的交聯透明質酸鈉干粉，隨后用磷酸緩沖液（PBS)重新溶解得到交聯透 明質酸鈉凝膠。
2. 權利要求1中所述的透明質酸酶抑制劑是指Y-聚谷氨酸、肝素鈉等含有羧基的透 明質酸酶抑制物。
3. 權利要求1中所述的交聯劑是指1，4_ 丁二醇雙縮水甘油醚（BDDE)和二乙烯基砜 (DVS)0
4. 權利要求1所述的透明質酸鈉分子不同的活化基團是指在酸性和堿性條件下透明 質酸鈉分子中的羧基和羥基分別被活化。
5. 權利要求1中的酸性條件是指用酸性溶液如鹽酸、醋酸和磷酸等調節pH值為3-5。
6. 權利要求1中的堿性條件是指用堿性溶液如氫氧化鈉、碳酸鈉或氫氧化鉀等調節pH 為 9-13。
7. 權利要求1中所述的不同的交聯時間是指交聯透明質酸鈉反應中在酸性環境和堿 性環境下的時間，酸性環境下的反應時間為1-2天，堿性條件下的反應時間為5-7天。
【專利摘要】本發明涉及一種具有抑制透明質酸酶活性的交聯透明質酸鈉凝膠的制備方法。該方法利用不同酸堿條件下，透明質酸鈉分子中不同的基團被活化，進而控制不同的酸堿條件在透明質酸鈉分子中引入透明質酸酶抑制劑，最終得到具有抑制透明質酸酶活性的交聯透明質酸鈉凝膠。該專利制備出的交聯透明質酸鈉凝膠相比傳統工藝制備的凝膠具有粘度低、體內殘留時間長等優點，同時能夠的抑制透明質酸酶活性，最高抑制率可達65%。該專利制備的交聯透明質酸鈉凝膠的低粘度保證了臨床的使用的方便性，抑制透明質酸酶活顯著提高了體內的殘留時間，在注射美容、人工玻璃體以及退變形關節炎補充治療方面具有良好的應用前景。
【IPC分類】A61L27-20, C08J3-24, C08L89-00, C08K5-1515, C08L77-04, C08J3-075
【公開號】CN104761735
【申請號】CN201410007396
【發明人】魏長征, 朱彬, 李莉莉, 奚宏偉
【申請人】上海其勝生物制劑有限公司
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2014年1月8日