通過蛻皮素受體復合物調節外源性基因表達的手性二酰基肼配體的制作方法
【專利說明】通過蛻皮素受體復合物調節外源性基因表達的手性二酰基 肼配體
[0001] 本申請是申請日為2008年5月29日，申請號為200880100879.X，發明名稱為"通 過蛻皮素受體復合物調節外源性基因表達的手性二酰基肼配體"的申請的分案申請。 發明領域
[0002] 本發明涉及生物技術、基因工程和藥物化學領域。在一個實施方案中，本發明涉及 基因表達的領域。在另一個實施方案中，本發明涉及天然和突變的核受體的二酰基肼配體 和手性二酰基肼配體以及它們在基于核受體的可誘導的基因表達系統中的用途，以及使用 這些配體和可誘導的基因表達系統在宿主細胞中調芐基因表達的方法。
[0003] 背景
[0004] 本文引用了各種出版物，其公開內容通過引用被全文并入。然而，本文任何參考文 獻的引用不應被解釋為承認該參考文獻對于本申請是可以作為"現有技術"的。
[0005] 在基因工程領域，基因表達的精確控制是研宄、操作和控制發育和其他生理過程 的有價值的工具。基因表達是復雜的生物過程，其包括許多特異性蛋白-蛋白相互作用。為 了觸發基因表達以便其產生蛋白合成第一階段中必要的RNA，必須將轉錄激活子接近控制 基因轉錄的啟動子。通常地，轉錄激活子自身與具有至少一個DNA結合結構域的蛋白締合， 所述DNA結合結構域結合存在于基因啟動子區域的DNA結合位點。因此，為了使基因表達 發生，包括DNA結合結構域和位于所述DNA結合結構域適當距離處的反式激活結構域的蛋 白必須被置于基因的啟動子區域中正確的位置。
[0006] 傳統的轉基因方法利用細胞類型特異性的啟動子來驅使設計的轉基因的表達。先 將含有所述轉基因的DNA構建體整合進宿主基因組。當被轉錄激活子觸發時，轉基因的表 達在所給細胞類型中發生。
[0007] 調控外源性基因在細胞中的表達的另一種方法是通過可誘導的啟動子。使用這種 可誘導的啟動子的例子包括PRl-a啟動子、原核的抑制子-操縱子系統、免疫抑制性抑免蛋 白系統和更高級的真核轉錄激活系統例如類固醇激素受體系統，并描述如下。
[0008] 來自煙草的PRl-a啟動子在病原體攻擊之后全身獲得性抵抗應答中被誘導。 PRl-a的用途可被限制，因為它經常對內源性物質和外部的因子例如病原體、UV-B輻射 和污染物產生應答。基于由熱激、干擾素和重金屬所誘導的啟動子的基因調控系統已 被描述（Wurn等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA55:5414-5418(1986);Arnheiter等，Cell 62:51-61(1990);Filmus等，NucleicAcidsResearch20:27550-27560 (1992))。然而，這 些系統由于它們對非靶基因的表達的作用而具有局限性。這些系統還是有漏洞的。
[0009] 原核的抑制子_操縱子系統使用細菌抑制子蛋白和它們所結合的獨特的操縱子 DNA序列。來自大腸桿菌的四環素（"Tet"）和乳糖（"Lac"）抑制子-操縱子系統二者都 已被用在植物和動物中以控制基因表達。在Tet系統中，四環素結合至TetR抑制子蛋白， 導致構象變化，其將抑制子蛋白從操縱子釋放出來，并因此允許轉錄發生。在Lac系統中， 乳糖操縱子響應于乳糖或合成的類似物例如異丙基-b_D-硫代半乳糖苷的存在而被激活。 不幸地，這種系統的使用受到配體即四環素和乳糖的不穩定化學性質、它們的毒性、它們的 天然存在或者誘導或抑制所需要的相對高水平的限制。由于相似原因，這種系統在動物中 的使用受到限制。
[0010] 免疫抑制分子例如FK506、雷帕霉素和環孢菌素A可結合至抑免蛋白FKBP12、親環 蛋白等。使用此信息，已經設計了總體戰略以簡單地通過將FK506置于兩種蛋白中的每種 上或者通過將FK506置于一種上并將環孢菌素A置于另外一種上，而將任何兩種蛋白結合 在一起。然后可使用FK506(FK1012)的合成同二聚體或由FK506-環孢菌素（FKCsA)融合所 得的化合物來誘導這些分子的二聚化（Spencer等，Science262:1019-24(1993);Belshaw 等，ProcNatlAcadSciUSA93:4604-7 (1996))。融合至FKBP12 的Gal4DNA結合結構域 和融合至親環蛋白和FKCsA化合物的VP16激活子結構域被用來顯示異二聚化和報道基因 在含有Gal4結合位點的啟動子的控制下的激活。不幸地，該系統包括可具有不需要的副作 用的免疫抑制劑，并因此限制它用于各種哺乳動物基因開關應用。
[0011] 還使用了更高級的真核轉錄激活系統例如類固醇激素受體系統。類固醇激素受體 是核受體超家族的成員，并在脊椎動物和無脊椎動物細胞中被發現。不幸地，為了調控基因 表達而激活所述受體的類固醇化合物特別地在植物和動物中的使用由于它們參與這些生 物體中許多其他天然生物途徑而受到限制。為了克服這種困難，使用昆蟲蛻皮素受體（EcR) 開發了一種替代系統。
[0012] 昆蟲的生長、蛻皮和發育受到蛻皮素類固醇激素（蛻皮激素）和保幼激素調控 (Dhadialla等，Annu.Rev.Entomol. 43:545-569 (1998))。蛻皮素在昆蟲體內的分子革巴至少 由蛻皮素受體（EcR)和超氣門蛋白（USP)組成。EcR是特征為簽名DNA和配體結合域和激活 結構域的核類固醇受體超家族的成員（Koelle等，Cell，67:59-77 (1991))。EcR受體對若干 類固醇化合物例如松留酮A和米樂留酮（muristeroneM進行應答。最近，描述了具有蛻皮 類固醇激動劑活性的非類固醇化合物，其包括由Rohm和Haas公司銷往全世界的商業上可 得的殺蟲劑蟲酰肼（tebufenozide)和甲氧蟲酰肼（methoxyfenozide)(參見W0 96/27673 和US5, 530, 028)。兩種類似物在其他生物體內都具有出色的安全性概況。
[0013] 昆蟲蛻皮素受體（EcR)與超氣門蛋白（USP)即哺乳動物的類視黃醇X受體（RXR) 的昆蟲同系物發生異二聚化作用，并結合蛻皮類固醇和蛻皮素受體應答元件，并激活對蛻 皮素應答的基因的轉錄。EcR/USP/配體復合物在昆蟲的發育和繁殖中起重要作用。EcR有 五個組件式結構域，A/B(反式激活）、C(DNA結合，異二聚化）、D(鉸鏈，異二聚化）、E(配體 結合，異二聚化和反式激活）和F(反式激活）結構域。當與其他蛋白融合時，這些結構域 中的一些例如A/B、C和E保持它們的功能。
[0014] 緊密地調控的可誘導的基因表達系統或"基因開關"對于各種應用是有用的，其中 所述應用例如基因療法、細胞中蛋白的大規模生產、基于細胞的高通量篩選測定、功能性基 因組學和轉基因植物和動物性狀的調控。
[0015] 第一種型式的基于EcR的基因開關使用了黑腹果幡（Drosophilamelanogaster)EcR(DmEcR)和小家鼠（Musmusculus)RXR(MmRXR)，并且顯示了這些受體在類固醇松 甾酮A存在下反式激活哺乳動物細胞系和轉基因小鼠中的報道基因（Christopherson 等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89:6314-6318(1992);No等，Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 93:3346-3351 (1996))。隨后，Suhr等，Proc.Natl.Acad.Sci. 95:7999-8004 (1998) 顯示非類固醇蛻皮素激動劑蟲酰肼通過家蠶（Bombyxmori)EcR(BmEcR)在不存在外源性異 二聚體配偶體的情況下誘導了哺乳動物細胞中報道基因的高水平的反式激活。
[0016]W0 97/38117和W0 99/58155公開了調節外源性基因表達的方法，其中包括外源 性基因和蛻皮素應答元件的DNA構建體被包括蛻皮素受體的第二DNA構建體所激活，其中 所述蛻皮素受體因此在配體的存在下，或者可選地在能夠作為沉默配偶體起作用的受體 的存在下，結合至蛻皮素應答元件以誘導基因表達。所選的蛻皮素受體是從黑腹果蠅分離 的。通常，為了提供最佳的激活，這種系統需要沉默配偶體的存在，優選地為類視黃醇X受 體（RXR)。在哺乳動物細胞中，昆蟲蛻皮素受體（EcR)與類視黃醇X受體（RXR)異二聚化， 并以配體依賴的方式來調控靶基因的表達。W0 99/02683公開，分離自家蠶的蛻皮素受體在 哺乳動物系統中是有功能的，而不需要外源性二聚體配偶體。
[0017]US6, 265, 173B1公開，受體的類固醇/甲狀腺超家族的各成員可與黑腹果蠅超 氣門受體（USP)或至少包括USP二聚化結構域的其片段相結合以用于基因表達系統。US 5, 880, 333公開了用在植物中的黑腹果蠅EcR和超氣門（USP)異二聚體系統，在其中反式激 活結構域和DNA結合結構域被置于兩種不同的雜交蛋白上。不幸地，這些基于USP的系統 在動物細胞中是組成性的，并因此對于調控報道基因表達是無效的。
[0018] 在這些情況的每種中，反式激活結構域和DNA結合結構域（或者作為W0 99/02683 中天然的EcR或者作為W0 97/38117中修飾的EcR)被并入單個分子中，而且另一個異二聚 體配偶體USP或RXR以它們的天然狀態被使用。
[0019] 近來，據顯示，基于蛻皮素受體的可誘導基因表達系統導致了在不存在配體的情 況下大大減少的背景活性和在有配體存在的情況下顯著增加的背景活性，在其中所述基因 表達系統中通過將它們置于兩種不同蛋白上而將反式激活和DNA結合結構域互相分離（參 見TO01/70816A1，以其整體通過引用并入本文）。與在申請W0 97/38117和W0 99/02683 中公開的兩種系統相比，該雙雜交系統是顯著地改進的可誘導的基因表達調節系統。所述 雙雜交系統利用一對相互作用蛋白的能力來將轉錄激活結構域帶到相對于DNA結合結構 域更有利的位置，以致于當DNA結合結構域結合至基因上的DNA結合位點時，反式激活結構 域更有效地激活啟動子（參加，例如，US5, 283, 173)。簡單說，所述雙雜交基因表達系統包 括兩個基因表達盒；編碼DNA結合結構域的第一個融合至核受體多肽，而且編碼反式激活 結構域的第二個融合至不同的核受體多肽。在配體存在下，第一多肽與第二多肽的相互作 用有效地將DNA結合結構域束縛在反式激活結構域上。由于DNA結合和反式激活結構域位 于兩個不同分子上，在不存在配體的情況下背景活性大大減少。
[0020] 當與類固醇配體例如松甾酮A( "PonA"）或米樂甾酮（"MurA"）相比時，雙雜交 系統還提供對非類固醇配體例如二酰基肼增強的敏感性。那就是，當與類固醇比較時，非類 固醇配體在較低濃度下提供更高活性。另外，因為基于EcR基因開關的反式激活通常是細 胞系依賴性的，所以較容易為每種應用定制基因開關系統以獲得最大的反式激活能力。此 外，雙雜交系統避免一些由于RXR過表達的副作用，而所述過表達通常發生在將未被修飾 的RXR用作異二聚體受體的配偶體之時。在一個雙雜交系統中，EcR或RXR的天然DNA結 合和反式激活結構域被消除，因此這些雜交分子具有更少的與存在于細胞中的其他類固醇 受體相互作用的機會，并導致減少的副作用。另外的基因開關系統包括描述在下面的那些， 其中每一種都通過引用被并入：US7, 091，038、TO2004078924、EP1266015、US20010044151、 US2002011086UUS2002011952UUS20040033600,US2004019786UUS20040235097,US2006002