含抗菌肽Cbf-14的消毒劑及其制備和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及消毒劑研究及其應用技術領域，尤其是提供了一種含有抗菌肽Cbf-14 的消毒劑處方研制及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 消毒劑主要用于殺滅傳播媒介中的病原微生物，使其達到無害化要求，將病原微 生物消滅于人體之外，切斷傳染病的傳播途徑，達到控制傳染病的目的。目前常用的消毒劑 一般都是化學消毒劑，有刺激性氣味，腐蝕性強，對呼吸道有刺激，對家具、電器、金屬物品 等有損害，還對環境有一定的污染。如果為了減少刺激，降低化學消毒的成分的含量，但是 其對細菌及真菌的殺滅能力會大幅度降低，不能達到消毒劑的國家標準。因此迫切的需要 研發出一種安全、低毒、高效、廣譜的新型消毒劑。
[0003] 隨著對消毒劑的不斷研究，研發出了一系列不同總類的消毒劑，為了針對不同適 應癥其制劑種類不斷增多。對于主要針對皮膚、黏膜的消毒劑，液體消毒劑相對于其他劑型 的消毒劑更加有優勢，因為液體消毒劑對于皮膚的保護作用更強，它能夠使得皮膚粗糙度 降低，保持皮膚的水分不丟失，并且對于皮膚的刺激性較低。對劑型的進一步研究發現，噴 霧劑能夠將藥物噴至腔道黏膜、皮膚上，且攜帶較為方便且應用范圍更加廣泛等優點，使其 成為了本發明消毒劑的劑型首選。
[0004] 在我們的前期研究中發現抗菌肽（Antimicrobial peptides，AMPs)具有廣譜抗菌 的作用，他對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌都有一定的殺菌作用，并且其是人體免疫體系 的一部分，其與吞噬細胞、上皮細胞、干擾素、溶酶體、補體等一樣是防御病原微生物入侵的 非特異性屏障。抗菌肽Cbf-14是在金環蛇Cathelicidin抗菌肽BF-30的基礎上通過生物 信息學的優化得到了含有14個氨基酸序列的多肽，其氨基酸序列為RLLRKFFRKLKKSV，其帶 有7個正電荷，分子量為1819. 33,等電點為12. 31。根據研究發現其對細菌有著很好的殺 菌活性，其對耐藥細菌也有著很好的殺菌作用。公開于中國專利CN103435686A中。

【發明內容】

[0005] 本發明公開了一種含有抗菌肽Cbf-14的消毒劑，消毒劑中加入了兩性離子表面 活性劑，使得消毒劑能夠在更短的時間內達到國標要求的消毒效果，在消毒劑中添加了抗 菌肽保護劑，使消毒劑中的抗菌肽Cbf-14在較長時間內維持在較高濃度，較好的延長了 產品的有效期。
[0006] 本發明還公開了一種含有抗菌肽Cbf-14的消毒噴霧劑的制備方法。
[0007] 優選的本發明的消毒劑，含有下列各比例的組分：
[0008]
[0009] 余量為水。所述百分比為體積百分比。
[0010] 其中聚乙二醇-400為多肽保護劑。丙三醇為多肽保護劑和保濕劑。異構醇聚氧 乙烯醚為兩性離子表面活性劑。
[0011] 本發明的消毒劑主要用于手術后創面的消毒處理及手術傷口的護理，外傷創面的 皮膚消毒處理，燒傷、燙傷、灼燒、擦傷的皮膚消毒護理，手術器械的消毒處理，一般性的皮 膚黏膜消毒護理。
[0012] 本發明的消毒制劑優選針對的菌種為革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌，革蘭陰性菌銅 綠假單胞菌和真菌白色念珠菌等菌株。
[0013] 本發明的消毒劑其劑型優選為噴霧劑。
[0014] 本發明的消毒劑可用如下方法制備：稱取抗菌多肽Cbf-14,加無菌水一定量攪拌 至溶解，再依次添加PEG400、異構醇聚氧乙烯醚、丙三醇，最后補加無菌水至定容，過濾除 菌，即得。
[0015] 下面是本發明消毒劑處方篩選、活性實驗及結果。
[0016] -、消毒劑處方篩選試驗：
[0017] (1)PEG400 的配比篩選：
[0018] 在抗菌肽Cbf-14最終濃度為300 y g/mL的情況下調整PEG400的比例，使PEG400 的比例為5 %，10 %，20 %，30 %，40 %。在此條件中，分別測定其對于革蘭陽性菌金黃色葡萄 球菌，革蘭陰性菌銅綠假單胞菌，真菌白色念珠菌的殺菌效力。
[0019] 結果見圖1。從圖1我們可以看出PEG400的比例對于消毒劑的殺菌效果并無太大 影響，且從圖中我們發現多肽短時間內對白色念珠菌的殺菌效力不能達到國家消毒劑的標 準（即對真菌的殺滅對數值大于4. 00)，因此我們要提高消毒劑對于真菌的殺菌能力并且 對于PEG400的比例也需進一步研究。
[0020] (2)異構醇聚氧乙烯醚的配比篩選：
[0021] 在一系列試驗之后我們發現兩性離子表面活性劑能夠很好的使細菌和真菌的細 胞表面張力降低，能夠輔助抗菌肽對于細菌及真菌更好的殺傷。
[0022] 在抗菌肽Cbf-14最終濃度為300 y g/mL的情況下調整異構醇聚氧乙烯醚的比例， 使異構醇聚氧乙烯醚（AE05-80N)的比例為0. 5%，1%，2%，3%，4%，5%，在此條件中，分 別測定其對于金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，白色念珠菌的殺菌效力。
[0023] 結果見圖2。從圖2中我們可以看出在異構醇聚氧乙烯醚的配比為1%的時即能 有很好的殺菌活性，因此配方中的異構醇聚氧乙烯醚的配比優選1%為下限。
[0024] (3)單純的異構醇聚氧乙烯醚對于細菌和真菌的殺菌能力
[0025] 在不添加任何抗菌肽Cbf-14的前提下測定不同配比的異構醇聚氧乙烯醚對于細 菌和真菌的殺菌作用。
[0026] 結果見圖3。從圖3中我們可以發現不同比例的異構醇聚氧乙烯醚（AE05-80N)對 于金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，白色念珠菌這些菌株在5min內并沒有殺菌能力，但是 在添加了抗菌肽Cbf-14的條件下消毒劑就能夠快速導致細菌與真菌的死亡，這證明在添 加了兩性離子表面活性劑能夠使得細菌與真菌細胞表面張力下降，從而輔助抗菌肽Cbf-14 對于細菌和真菌的殺傷能力。
[0027] (4)消毒噴霧劑的多肽保護劑及皮膚保濕劑配比最終確定：
[0028] 在本發明的開發過程中我們發現低配比的多元醇對于多肽有更好的保護作用，在 丙三醇含量為2~10 %范圍內添加PEG400不同的濃度后，發現PEG400含量為5~20 %時 最適合。表1是在添加了5%丙三醇的基礎上添加30%?￡6400、20%?￡6400、15%?￡6400、 10% PEG400和5% PEG400五種配比，將其放置于54°C的培養箱中孵育14天之后觀察其中 抗菌肽Cbf-14的含量的變化，選擇對抗菌肽有更好保護作用的配比。
[0029] 表1為經過54°C孵育14天不同配比溶液中抗菌肽Cbf-14含量測定
[0030]
[0031] 由表1中我們可以發現抗菌肽Cbf-14的保留時間在9. Smin左右，與Cbf-14標樣 的峰面積相比5% PEG400與5%丙三醇組成的配比的峰面積在54°C經過14天之后仍無太 大變化，其中Cbf-14含量下降只有6. 4%，而30% PEG400溶液其含量下降了 60. 3%。 [0032] (5)抗菌肽Cbf-14濃度的篩選
[0033] 在確定最優配比之后。我們調整抗菌肽Cbf-14的濃度，以降低生產成本，更好的 服務于廣大消費市場。在溶劑條件一定的情況下調整抗菌肽Cbf-14的質量濃度，使其最終 藥物濃度分別為100、150、200、300、400、500 yg/mL，測定其對于金黃色葡萄球菌，銅綠假 單胞菌，白色念珠菌的殺菌效力。
[0034] 結果見圖4。從圖4中我們可以看出雖然在150 y g/mL消毒劑對于金黃色葡萄球 菌，銅綠假單胞菌都還有不錯的殺菌活性但是對于真菌白色念珠菌的殺傷作用不能滿足國 家對于消毒劑的標準，所以其優選的最低有效濃度為200 y g/mL。
[0035] 二、過濾沖洗法去除消毒劑殘留的試驗：
[0036] (1)試驗菌與菌液制備：
[0037] 細菌：金黃色葡萄球菌ATCC 6538、銅綠假單胞菌ATCC 15552 ;真菌：白色念珠菌 ATCC 10231
[0038] 將試驗用細菌從甘油管中接種至營養瓊脂斜面，37°C培養24h，在挑取少量菌落 于2mL的營養肉湯培養基中，37°C培養8h，即得菌懸液；將真菌接種至改良馬丁瓊脂斜面， 30°C培養48h，挑取少量菌落于2mL改良馬丁培養基中，30°C培養8h，即得菌懸液。
[0039] (2)消毒劑制備：
[0040] 稱取抗菌肽Cbf-14 200mg于潔凈干燥燒杯中，加無菌水300mL，攪拌至溶解，再逐 一添加50mL PEG400, IOmL異構醇聚氧乙稀醚，50mL丙三醇，最后補加無菌水至1L，攪拌均 勾，0. 22 y m濾膜過濾除菌。
[0041] (3)過濾沖洗法去除消毒劑殘留實驗：
[0042] 第1組。吸取0.5mL試驗菌懸液于試管內，加入0.5mL有機干擾物質，混勾后，置 20°〇±1°(：水浴中51^11后，再吸加4.0 1^消毒劑（應先置201€±1°(：中水浴）于試管內， 混勾，作用5min。吸取該最終樣液0. 5mL，加于含4. OmL稀釋液試管中，混勾。吸取最終樣 液LOmL接種于平皿內，做活菌培養計數。第2組。吸取0.5mL試驗菌懸液于試管內，加入 0. 5mL有機干擾物質，混勻后，置20°C ± I °C水浴中5min后，再吸加4. OmL消毒劑于試管中， 混勻。作用5min，對其進行去除消毒劑處理，并取最終樣液1.0 mL接種于平皿內，做活菌培 養計數（如為濾膜法，可先進行10倍系列稀釋，再經過濾沖洗法處理，然后直接將濾膜有菌 面朝上貼于平板表面）。第3組。吸取試驗菌懸液l.OmL，置含4.0mL稀釋液的試管中，不 加消毒劑，亦不作任何去除處理，進行活菌培養計數，作為陽性對照值。
[0043] (4)評價標準
[0044] 第1組無試驗菌，或僅有極少數生長；第2組有遠較第1組為多，但較第3組為少 的試驗菌生長；第3組測定的結果，微生物數量應在I X IO7~5 X 10 7CFlVmL之間；連續3次 試驗取得合格評價。
[0045] (5)實驗結果見表2。
[0046] 表2即為膜過濾沖洗法去除殘留消毒劑的結果
[0047]
[0048] 由表2可以看出用物理方式（即膜過濾沖洗）能夠有效的去除其中的消毒劑殘 留，這使得消毒劑的藥效評價更加的準確。
[0049] 三、消毒噴霧劑對于細菌及真菌的殺菌作用
[0050] (1)試驗菌與菌液制備：
[0051] 細菌：金黃色葡萄球菌ATCC 6538、銅綠假單胞菌ATCC 15552 ;真菌：白色念珠菌 ATCC10231
[0052] 將試驗用細菌從丙三醇管中接種至營養瓊脂斜面，37°C培養24h，在挑取少量菌落 于2mL的營養肉湯培養基中，37°C培養8h，即得菌懸液；將真菌接種至改良馬丁瓊脂斜面， 30°C培養48h，挑取少量菌落于2mL改良馬丁培養基中，30°C培養8h，即得菌懸液。
[0053] (2)消毒噴霧劑對于細菌及真菌的殺滅試驗
[0054] 試驗組：取消毒試驗用無菌試管，先加入0. 5mL試驗用菌懸液，再加入0. 5mL有 機干擾物質，混勻，置20 °C ± TC水浴中5min后，用無菌吸管吸取消毒液5. OmL注入其中， 迅速混勻并立即計時；待試驗菌與消毒劑相互作用5min，分別吸取1.0 mL試驗菌與消毒劑 混合液