高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及樣本中的高密度脂蛋白中的膽固醇的測定方法、測定試劑及測定用試 劑盒。
【背景技術】
[0002] 生物體中的脂蛋白根據其比重被分類為高密度脂蛋白（以下簡記為HDL)、低密度 脂蛋白（以下簡記為LDL)、超低密度脂蛋白（以下簡記為VLDL)、乳糜微粒（以下簡記為 CM)，各脂蛋白主要由于載脂蛋白的種類的不同而使其在生物體中的作用大不相同，脂質組 成也各種各樣。其中，已知HDL從包括動脈壁在內的各組織中接收膽固醇，因此與蓄積在 細胞內的膽固醇的除去作用相關，是以冠狀動脈硬化為代表的各種動脈硬化的危險預防因 子，其血中水平成為用于預知動脈硬化疾病的發病的有用指針。
[0003] 以往的HDL中的膽固醇（以下簡記為HDL膽固醇）的測定由利用超速離心法、免 疫化學方法、電泳法、沉淀法的分級操作和膽固醇定量這兩個階段構成。但是，分級操作的 操作繁雜，需要長時間，并且在安全性方面也存在問題。因此，伴有這些分離操作的測定方 法效率極低，是不適合實用的方法。
[0004] 近年來，為了解決上述問題，報道了各種測定方法。已知例如：使血清或血漿在含 有膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶以及膽汁酸鹽或膽汁酸衍生物或磺基琥珀酸二辛酯的緩沖液 中與該酶反應來特異性地對HDL膽固醇進行分別定量的方法（參考專利文獻1);通過使血 清在特定的PH和特定的溫度下在含有胰腺來源的膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、膽汁酸族的 表面活性劑和非離子型表面活性劑的緩沖液中與該酶反應來測定HDL膽固醇的方法（參考 專利文獻2)。專利文獻2記載的測定方法中，首先進行LDL膽固醇與該酶的反應，接著能夠 進行HDL膽固醇的測定。但是，這些測定中，需要長時間進行測定，另外，不一定是對HDL膽 固醇具有特異性的測定方法。
[0005] 作為使HDL以外的脂蛋白凝集來測定HDL膽固醇的方法，已知例如：使用硫酸葡 聚糖等使HDL以外的脂蛋白凝集的試劑、二價的金屬鹽和經過化學修飾的酶的方法（參考 專利文獻3);使用聚陰離子等與HDL以外的脂蛋白形成復合物的試劑和聚氧乙烯-聚氧丙 烯縮合物等不溶解脂蛋白的表面活性劑的測定方法（參考專利文獻4);使用硫酸葡聚糖等 聚陰離子、二價的金屬鹽、特定的非離子型表面活性劑和與來自試樣的白蛋白不同的白蛋 白的測定方法（參考專利文獻5);-種測定血清或血漿中的HDL膽固醇的方法，其特征在 于，將血清或血漿用含有脂蛋白分級劑（硫酸葡聚糖等聚陰離子與鎂離子等二價陽離子的 組合）的溶液進行處理，使所得到的混合液在不進行固體和液體的分離處理的情況下在陰 離子型表面活性劑（烷基磺酸或膽汁酸或其衍生物）的存在下與膽固醇酯酶和膽固醇氧化 酶反應，測定生成的過氧化氫（參考專利文獻6);等。
[0006] 作為不使HDL以外的脂蛋白凝集而使HDL膽固醇凝集的方法，已知例如：使生物試 樣與胰腺來源的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶在膽汁酸或其鹽和白蛋白的存在下反應，測定 由該酶反應消耗或生成的化合物，由此測定生物試樣中的HDL膽固醇的方法（參考專利文 獻7);在對HDL級分具有反應選擇性的HLB值為16以上的非離子型表面活性劑的存在下， 使樣本與優先作用于HDL級分的脂蛋白脂肪酶和/或膽固醇酯酶以及膽固醇氧化酶反應， 測定樣本中的HDL膽固醇的方法（參考專利文獻8);等。另外，還已知如下方法：利用酰基 聚氧乙烯失水山梨醇酯將HDL以外的脂蛋白中的膽固醇優先轉化為過氧化氫，將生成的過 氧化氫除去后，添加聚氧乙烯烷基酯，由此利用酶法測定HDL膽固醇（參考專利文獻9)。
[0007] 另外，還已知：一種樣本中的HDL膽固醇的測定方法，其特征在于，使樣本與i)膽 固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶、或ii)膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶在含 有非離子型表面活性劑、聚陰離子和白蛋白的水性介質中反應，測定生成的過氧化氫或還 原型輔酶（參考專利文獻10);-種HDL膽固醇的測定方法，其特征在于，使樣本與i)膽固 醇酯水解酶和膽固醇氧化酶、或ii)膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶和膽固醇脫氫酶在含有 特定結構的季銨鹽或胺類和聚陰離子的水性介質中反應，測定生成的過氧化氫或還原型輔 酶（參考專利文獻11)。
[0008] 在通過光學方法進行樣本中的特定物質的測定的情況下，在來自于肝病、膽管疾 病的患者的樣本中，出現磷脂和游離型膽固醇增加的異常脂蛋白（LpX)，LpX對測定體系產 生光學影響，無法得到正常的測定值，從而成為問題。為了避免該光學影響，通常已知使反 應液中的鹽類為高濃度來消除由不溶于水的蛋白引起的渾濁的方法。但是，對于HDL膽固 醇的測定而言，可能會由于存在高濃度的鹽類而導致對HDL膽固醇的特異性降低，進而導 致所含有的酶失活。
[0009] 現有技術文獻
[0010] 專利文獻
[0011] 專利文獻1 :日本特開昭62-69999號公報
[0012] 專利文獻2 :日本特開昭63-126498號公報
[0013] 專利文獻3 :日本特開平8-131197號公報
[0014] 專利文獻4 :日本特開平8-201393號公報
[0015] 專利文獻5 :日本特開平9-285298號公報
[0016] 專利文獻6 :日本特開平8-116996號公報
[0017] 專利文獻7 :國際公開第97/40376號小冊子
[0018] 專利文獻8 :國際公開第00/52480號小冊子
[0019] 專利文獻9 :日本特開平9-299號公報
[0020] 專利文獻10 :國際公開第2004/035816號小冊子
[0021] 專利文獻11 :國際公開第2006/118199號小冊子
【發明內容】
[0022] 發明所要解決的問題
[0023] 本發明的目的在于提供能夠簡便且準確地進行測定的HDL膽固醇的測定方法、測 定用試劑及測定用試劑盒。
[0024] 用于解決問題的手段
[0025] 本發明的發明人為了解決上述問題進行了深入研究，結果發現了如下見解：在具 有吡啶鍵:鹽或季銨鹽的結構的特定的含氮物質和聚陰離子的共存下，膽固醇酯水解酶和 膽固醇氧化酶或膽固醇脫氫酶特異性地作用于HDL膽固醇，從而完成了本發明。
[0026] gp，本