專利名稱：高密度脂蛋白中的膽固醇的檢測方法及試劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及檢測樣本中高密度脂蛋白(以下簡稱為HDL)中膽固醇的檢測方法、檢測試劑、檢測試劑盒、新的膽汁酸衍生物以及新的膽汁酸衍生物的制備方法。
背景技術：
機體中的脂蛋白根據其比重的不同，可分為高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(以下簡稱為LDL)、極低密度脂蛋白(以下簡稱為VLDL)、乳糜微粒(以下簡稱為CM)，他們主要由于脫輔基蛋白種類的不同而在機體中的作用大不一樣，脂質組成也各不相同。其中，HDL與消除為了從包括動脈壁的各組織獲取膽固醇而在細胞內積聚的膽固醇的作用有關，是冠狀動脈硬化癥以及其他各種動脈硬化癥的危險預防因子，它在血中的含量水平被認為是判斷動脈硬化疾病發病先兆的有效指標。
以往HDL中膽固醇(以下簡稱為HDL膽固醇)的檢測方法是由超離心法、免疫化學方法、電泳法、沉淀法等進行和級分和膽固醇定量這兩個步驟組成。但是，級分這一步驟，操作繁瑣費時，安全性也無法保證。因此，與這些分離一起進行的檢測方法效率極低，不夠實用。
近年來，人們開發了各種檢測方法以求解決上述問題。比如使HDL以外的脂蛋白凝聚的檢測方法，其中包括用使硫酸葡聚糖等使HDL以外的脂蛋白凝聚的試劑、2價金屬鹽以及經過化學修飾的酶的檢測方法(特開平8-131197公報)，還有使用聚陰離子等與HDL以外的脂蛋白形成絡合物的試劑、不能溶解聚氧乙烯-聚氧丙烯聚合物等脂蛋白的表面活性劑的檢測方法(特開平8-201393號公報)，以及使用硫酸葡聚糖等聚陰離子、2價金屬鹽、特殊的非離子性表面活性劑以及不同于樣品中白蛋白的其他白蛋白的檢測方法(特開平9-285298號公報)等。另外還有，將血清或血漿用含有脂蛋白分離劑(硫酸葡聚糖等聚陰離子和鎂離子的組合物)的溶液進行處理，得到的混合液不經固體和液體分離處理，在有陰離子性表面活性劑(烷基磺酸或膽汁酸或其衍生物)存在的條件下，與膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶反應，測定生成的過氧化氫，以此過程為特征的血清或血漿中HDL膽固醇的檢測方法(特開平8-116996號公報)。
但是，這些使HDL以外的脂蛋白凝聚的HDL膽固醇測定法盡管與以往的標準法有良好的相關性，但會產生一些問題，如反應生成的凝聚物形成的混濁會導致無法準確測定，反應池進行堿清洗時和反應液中的金屬鹽反應生成金屬氫氧化物，它的析出使自動分析裝置超負荷。
另外也有不使HDL以外的脂蛋白凝聚的測定法，如用酰基聚氧乙烯山梨糖醇酐酯將HDL以外的脂蛋白優先轉換成過氧化氫、除去生成的過氧化氫后加入聚氧乙烯烷基醚、然后對HDL膽固醇進行酶測定的方法(特開平9-299號公報)，還有將機體樣本、來源于胰臟的膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和膽酸等膽汁酸在有白蛋白存在的條件下進行接觸、然后測定HDL膽固醇和該酶反應所消耗或生成的化合物，以此過程為特征的HDL膽固醇測定方法(國際公開第97/40376號文件)等。
但是，采用這些不使HDL以外的脂蛋白凝聚的HDL膽固醇測定法，會由于HDL以外脂蛋白中的膽固醇未完全除去、或是發生對HDL以外的脂蛋白中膽固醇的非特異反應而導致測定值不準確的問題。
采用膽汁酸類的HDL膽固醇測定法除了如上述特開平8-116996號公報和國際公開97/40376號文件中記載的方法外，另外還有的方法是將血清或血漿置于含有膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和膽汁酸或膽汁酸衍生物或磺基琥珀酸二辛酯的緩沖液中與該酶反應，將VLDL和LDL中的膽固醇先行反應成為HDL膽固醇，測定生成的過氧化氫，然后在反應液中添加含非離子性聚氧乙烯氧化物基團的表面活性劑，使HDL膽固醇與該酶反應，特異性地單獨定量HDL膽固醇(特開昭62-69999號公報)，有的方法是將血清在特定的pH值和特定的溫度下、在含有來源于胰臟的膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶、膽汁酸類表面活性劑和非離子性表面活性劑的緩沖液中與該酶反應，從而來測定HDL膽固醇(特開昭63-126498號公報)；有的方法是將機體樣本在白蛋白和膽汁酸或其鹽存在的條件下與來源于胰臟的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶接觸，使HDL膽固醇與該酶反應，處理后的機體樣本再與微生物來源的膽固醇酯酶接觸，使LDL膽固醇與該酶(微生物來源的膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶)反應，從而來測定HDL膽固醇和LDL膽固醇(特開平11-9300號公報)；還有的方法是將含有脂蛋白的樣本在膽汁酸衍生物和/或兩性表面活性劑存在的條件下與酶(膽固醇酯酶和膽固醇氧化酶)反應，使其選擇性地與HDL膽固醇反應，再在反應液中加入含有聚氧乙烯鏈的非離子型表面活性劑，使其選擇性地與LDL膽固醇反應，從而來測定HDL膽固醇和/或LDL膽固醇(特開號公報)，等等。但是，這些測定法有時測定時間很長，而且也并不一定能特異性地檢測HDL膽固醇。
在酯的部位具有氧化乙烯基的酯以前已有發表(特開平5-221941號公報)，但還沒有人發現用該酯進行HDL膽固醇測定的方法。
酯化合物的合成方法，一般比較簡便的方法是通過羧酸和醇的縮合反應進行合成，尤其常用的是利用酸催化劑的共沸酯化法。但是，由于化合物具有體積大的取代基或水溶性基團，從而造成收率低的結果(C.K.Ingold著，《有機化學的結構和機理(Structure andMechanism in Organic Chemistry)》(英國)，第2版，Bell 1969年，15章，1128-1178頁)。比如在上述的特開平5-221941號公報中記載的合成方法是用對甲苯磺酸作為酸催化劑、使膽酸和二甘醇一甲醚發生反應得到膽酸酯，但是即使經過72小時的長時間加熱回流，膽汁酸酯的收率還是非常低，只有23％，而且后處理操作還非常繁瑣復雜。
另外，如果用分子內帶有羥基的羧酸則也會不斷進行自我酯化，因此也有的方法是將分子內的羥基保護起來，與醇進行酯化反應。比如，有的方法用熊脫氧膽酸和2-羥基乙氧基葡萄糖苷進行熊脫氧膽酸酯的合成(特開平11-199598號公報)，但此方法因為包含1)熊脫氧膽酸的羥基用TBDMS(叔丁基二甲基甲硅烷)保護的步驟、2)酯化步驟以及3)脫保護基(脫TBDMS基)步驟，所以不能說是一種簡便的合成方法。
發明的公開本發明的目的在于提供簡便準確地檢測樣本中高密度脂蛋白中的膽固醇的方法以及此檢測方法所用的檢測試劑和試劑盒。
本發明涉及以下[1]～[42]。
高密度脂蛋白中膽固醇的檢測方法，其特征在于檢測樣本與膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶，或是與膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固醇脫氫酶，在含有膽汁酸衍生物的水性介質中反應，測定生成的過氧化氫或還原性輔酶。
如[1]記載的方法，其中水性介質還含有白蛋白。
如[1]或[2]記載的方法，其中膽固醇酯水解酶表示經過化學修飾的膽固醇酯水解酶。
如[3]記載的方法，其中化學修飾過的膽固醇酯水解酶表示膽固醇酯水解酶經過選自主要成分為聚乙二醇的基團、主要成分為聚丙二醇的基團、含有聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物的基團、含有水溶性多糖類的基團、磺基丙基、磺基丁基、聚氨酯基以及具有螯合作用的基團中的基團的修飾。
如[3]記載的方法，其中化學修飾過的膽固醇酯水解酶是膽固醇酯水解酶經過以聚乙二醇為主要成分的基團的修飾。
如[1]～[5]任何一項記載的方法，其中膽汁酸衍生物是具有陰離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
如[6]記載的方法，其中具有陰離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物是選自膽酸或其鹽、牛磺膽酸或其鹽、甘氨膽酸或其鹽、石膽酸或其鹽、脫氧膽酸或其鹽、鵝脫氧膽酸或其鹽、熊脫氧膽酸或其鹽、7-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代鵝脫氧膽酸或其鹽、7-氧代脫氧膽酸或其鹽、豬膽酸或其鹽、豬脫氧膽酸或其鹽以及脫氫膽酸或其鹽中的膽汁酸衍生物。
如[1]～[5]任何一項記載的方法，其中膽汁酸衍生物是具有兩性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
如[8]記載的方法，其中具有兩性表面活性作用的膽汁酸衍生物是指用下列通式(I)R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3-(I)[通式中，R1表示3-(3-膽胺丙基)二甲銨基，R2表示氫原子或羥基]表示的化合物。
如[1]～[5]任何一項記載的方法，其中膽汁酸衍生物是具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
如[10]記載的方法，其中具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物是如下列通式(II)所示的化合物 (X表示氫原子或羥基，R3和R4可以相同也可以不同，表示取代或未取代烷基、取代或未取代烷酰基)；或者是如下列通式(III)所示的化合物 {通式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或是如下列通式(IV)所示的取代基 [通式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之間的整數}。
高密度脂蛋白中膽固醇檢測試劑，其特征是含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽汁酸衍生物以及過氧化氫檢測試劑。
高密度脂蛋白中膽固醇檢測試劑，其特征是含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、膽汁酸衍生物以及氧化型輔酶。
如[13]記載的試劑，其中還含有還原型輔酶檢測試劑。
如[12]～[14]中任何一項記載的試劑，其中還含有白蛋白。
如[12]～[15]中任何一項記載的試劑，其中膽固醇酯水解酶是經過化學修飾的膽固醇酯水解酶。
如[16]記載的試劑，其中經過化學修飾的膽固醇酯水解酶是經過選自以聚乙二醇為主要成分的基團、以聚丙二醇為主要成分的基團、含有聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物的基團、含有水溶性多糖類的基團、磺基丙基、磺基丁基、聚氨酯基以及具有螯合作用的基團中的基團修飾的膽固醇酯水解酶。
如[16]記載的試劑，其中經過化學修飾的膽固醇酯水解酶是經過以聚乙二醇為主要成分的基團修飾的膽固醇酯水解酶。
如[12]～[18]中任何一項記載的試劑，其中膽汁酸衍生物是具有陰離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
如[19]記載的試劑，其中具有陰離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物是選自膽酸或其鹽、牛磺膽酸或其鹽、甘氨膽酸或其鹽、石膽酸或其鹽、脫氧膽酸或其鹽、鵝脫氧膽酸或其鹽、熊脫氧膽酸或其鹽、7-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代鵝脫氧膽酸或其鹽、7-氧代脫氧膽酸或其鹽、豬膽酸或其鹽、豬脫氧膽酸或其鹽以及脫氫膽酸或其鹽中的膽汁酸衍生物。
如[12]～[18]中任何一項記載的試劑，其中膽汁酸衍生物是具有兩性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
如[21]記載的試劑，其中具有兩性表面活性作用的膽汁酸衍生物是指如下列通式(I)表示的化合物R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3-(I)[式中，R1表示3-(3-膽胺丙基)二甲銨基，R2表示氫原子或羥基]。
如[12]～[18]中任何一項記載的試劑，其中膽汁酸衍生物是具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
如[23]記載的試劑，其中具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物是如下列通式(II)所示的化合物 (X表示氫原子或羥基，R3和R4可以相同也可以不同，表示取代或未取代烷基、取代或未取代烷酰基)；或者是如下列通式(III)所示的化合物
{式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV)所示的取代基 [式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之間的整數}。
高密度脂蛋白中膽固醇的檢測試劑盒，其特征是包括含有膽固醇酯水解酶的第一試劑以及含有膽固醇氧化酶的第二試劑、第一和第二試劑中的任何之一或二者中含有膽汁酸衍生物和過氧化氫檢測試劑。
高密度脂蛋白中膽固醇的檢測試劑盒，其特征是包括含有膽汁酸衍生物的第一試劑以及含有膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的第二試劑、第一和第二試劑中的任何之一或二者中含有過氧化氫檢測試劑。
高密度脂蛋白中膽固醇的檢測試劑盒，其特征是包括含有過氧化氫檢測試劑的第一試劑以及含有膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的第二試劑、第一和第二試劑中的任何之一或二者中含有膽汁酸衍生物。
高密度脂蛋白中膽固醇的檢測試劑盒，其特征是包括含有膽固醇酯水解酶的第一試劑以及含有膽固醇脫氫酶的第二試劑、第一和第二試劑中的任何之一或二者中含有膽汁酸衍生物以及氧化型輔酶。
高密度脂蛋白中膽固醇的檢測試劑盒，其特征是包括含有膽汁酸衍生物的第一試劑以及含有膽固醇酯水解酶和膽固醇脫氫酶的第二試劑、第一和第二試劑中的任何之一或二者中含有氧化型輔酶。
如[28]或[29]記載的試劑盒，其中第一和第二試劑中的任何之一或二者中還含有還原型輔酶檢測試劑。
如[25]～[30]中任何一項記載的試劑盒，其中第一和第二試劑中的任何之一或二者中還含有白蛋白。
如[25]～[31]中任何一項記載的試劑盒，其中膽固醇酯水解酶是經過化學修飾的膽固醇酯水解酶。
如[32]記載的試劑盒，其中經過化學修飾的膽固醇酯水解酶是指經過選自以聚乙二醇為主要成分的基團、以聚丙二醇為主要成分的基團、含有聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物的基團、含有水溶性多糖類的基團、磺基丙基、磺基丁基、聚氨酯基以及具有螯合作用的基團中的基團修飾的膽固醇酯水解酶。
如[32]記載的試劑盒，其中經過化學修飾的膽固醇酯水解酶是指經過以聚乙二醇為主要成分的基團修飾的膽固醇酯水解酶。
如[25]～[34]中任何一項記載的試劑盒，其中膽汁酸衍生物表示具有陰離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
如[35]記載的試劑，其中具有陰離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物是選自膽酸或其鹽、牛磺膽酸或其鹽、甘氨膽酸或其鹽、石膽酸或其鹽、脫氧膽酸或其鹽、鵝脫氧膽酸或其鹽、熊脫氧膽酸或其鹽、7-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代鵝脫氧膽酸或其鹽、7-氧代脫氧膽酸或其鹽、豬膽酸或其鹽、豬脫氧膽酸或其鹽以及脫氫膽酸或其鹽中的膽汁酸衍生物。
如[25]～[34]中任何一項記載的試劑盒，其中膽汁酸衍生物表示具有兩性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
如[37]記載的試劑盒，其中具有兩性表面活性作用的膽汁酸衍生物是指如下列通式(I)表示的化合物R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3-(I)[式中，R1表示3-(3-膽胺丙基)二甲銨基，R2表示氫原子或羥基]。
如[25]～[34]中任何一項記載的試劑盒，其中膽汁酸衍生物表示具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
如[39]記載的試劑盒，其中具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物是如下列通式(II)所示的化合物 (X表示氫原子或羥基，R3和R4可以相同也可以不同，表示取代或未取代烷基、取代或未取代烷酰基)；或者表示如下列通式(III)所示的化合物 {式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV)所示的取代基 ，n表示3～400之間的整數}。
如下列通式(III)所示的化合物 {式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV)所示的取代基 [式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之間的整數}。
通式(III)所示的化合物的制備方法 {式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或如下列通式(V)所示的取代基 [式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之間的整數}，是使如通式(V)表示的化合物 [式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，]與如通式(VI)表示的化合物 (式中，W’表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基，n表示3～400之間的整數)，或是如通式(VII)表示的化合物，在縮合劑存在下反應
(式中，T表示取代或未取代氨基烷基，n表示3～400之間的整數)。
本發明的HDL膽固醇檢測方法是一種不除去HDL以外的脂蛋白中的膽固醇而測定HDL膽固醇的方法。
本發明的檢測方法中所用的檢測樣本可以舉出如全血、血漿、血清、腦脊髓液、唾液、羊水、尿液、汗液、胰液等等，優選血漿和血清。
本發明中的膽固醇酯水解酶只要是具有水解膽固醇酯的能力的酶即可，并沒有特別的限制，比如除了動物、植物或微生物來源的膽固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶以外，還可以使用基因工程學方法制備而來的膽固醇酯酶、脂蛋白脂肪酶等。
膽固醇酯水解酶可以使用未經修飾的膽固醇酯水解酶，也可以使用經過化學修飾的膽固醇酯水解酶。另外，膽固醇酯水解酶還可以使用市售產品。
市售的膽固醇酯水解酶可以舉出如膽固醇脂酶“Amano”2號(CHE2，天野酶公司生產)、膽固醇脂酶“Amano”3號(CHE 3，天野酶公司生產)、脂蛋白脂肪酶(LPL311，東洋紡績社生產)、脂蛋白脂肪酶“Amano”6號(LPL6，天野酶公司生產)、膽固醇酯酶[COE313(經過化學修飾的膽固醇酯酶)，東洋紡績社生產]等。還有，本發明中還可以將2種以上的膽固醇酯水解酶組合起來使用。
膽固醇酯水解酶的化學修飾中用來修飾該酶的基團(化學修飾基團)可以舉出如以聚乙二醇為主要成分的基團、以聚丙二醇為主要成分的基團、含有聚乙二醇和聚丙二醇共聚物的基團、含有水溶性多糖類的基團、磺丙基、磺丁基、聚氨酯基、具有螯合作用的基團等，優選以聚乙二醇為主要成分的基團。作為水溶性多糖類，可以舉出如葡聚糖、支鏈淀粉、可溶性淀粉等。
對膽固醇酯水解酶進行化學修飾時所用的試劑(化學修飾劑)可以舉出如具有上述化學修飾基團以及能夠與酶的氨基、羧基、巰基等反應的官能團或結構的化合物等。能夠與酶中的氨基反應的官能團或結構，可以舉出如羧基、活性酯基(N-羥基琥珀酰亞胺基等)、酸酐、酰基氯、醛、環氧基、1，3-丙烷磺內酯、1，4-丁烷磺內酯等。能夠與酶中的羧基反應的官能團或結構可以舉出如氨基等。能夠與酶中的巰基發生反應的基團或結構可以舉出如馬來酰亞胺、二硫化物、α-鹵代酯(α-碘代酯等)。
化學修飾劑也可以使用市售的化學修飾劑。市售的化學修飾劑可以舉出如具有以聚乙二醇為主要成分的基團和N-琥珀酰亞胺基的SUNBRIDE VFM-4101、SUNBIRDE MEAC-50HS、SUNBRIDE MEC-50HS(均為日本油脂公司生產)、含有主要成分為聚亞烷基二醇的基團以及酸酐結構的SUNBRIDE AKM系列(如SUNBRIDE AKM-1510等)、SUNBRIDEADM系列、SUNBRIDE ACM系列(均為日本油脂公司生產)、具有以聚乙二醇為主要成分的基團以及環氧化物基的EPOX-3400、M-EPOX-5000(均為Sheawater Polymers公司生產)、含有具有螯合作用的基團以及酸酐結構的二乙三胺-N，N，N’，N”，N”-五乙酸酐(DTPA酸酐，同仁化學公司生產)等。
膽固醇酯水解酶的化學修飾可以通過以下方法進行，但并不僅限于本方法。首先，將膽固醇酯水解酶溶于pH8.0以上的緩沖液(如HEPES緩沖液)中，再在0～55℃條件下加入0.01～500倍摩爾當量的化學修飾劑，攪拌5分鐘～5小時。在實際的酶反應中，不僅可以直接使用此反應液作為經過化學修飾的膽固醇酯水解酶，還可以根據需要用超濾膜等將未反應的化學修飾劑除去后余下部分作為經過化學修飾的膽固醇酯水解酶使用。
本反應的方法中所用的膽固醇酯水解酶的濃度只要是可以用來檢測本發明的HDL膽固醇的范圍即可，并沒有特別的限制，但優選在反應液中的濃度為0.01～200U/mL，特別優選0.02～100U/mL。
本發明中的膽固醇氧化酶，只要是具有使膽固醇氧化并產生過氧化氫的能力的酶即可，沒有特別的限制，比如除了動物、植物、微生物來源的膽固醇氧化酶，也可以使用基因工程學方法制備的膽固醇氧化酶等，還可以使用如膽固醇氧化酶“Amano”1號(CHOD 1，天野酶公司生產)、膽固醇氧化酶(CO-PE，キツコ一マン公司生產)、膽固醇氧化酶(COO321，東洋紡績社生產)等市售產品。而且，本發明中也可以將2種以上的膽固醇氧化酶組合起來使用。
膽固醇氧化酶可以是未經修飾的酶，也可以是經過化學修飾的酶。經過化學修飾的膽固醇氧化酶例如可以用前面所述的化學修飾劑、通過前面所述的化學修飾方法制備得到。
本反應的方法中所用的膽固醇氧化酶的濃度，只要是可以用來檢測到本發明的HDL膽固醇的濃度即可，并沒有特別的限制，但是優選在反應液中的濃度為0.01～200U/mL，尤其優選0.02～100U/mL。
本發明中的膽固醇脫氫酶只要是具有在氧化型輔酶存在下使膽固醇氧化后生成還原型輔酶能力的酶即可，并沒有特別的限制，比如除了動物、植物、微生物來源的膽固醇脫氫酶，也可以使用通過遺傳工程學方法制備而得的膽固醇脫氫酶等。另外也可以使用膽固醇脫氫酶“Amano”5號(CHDH5，天野酶公司生產)等市售產品。而且，本發明中也可以將2種以上的膽固醇脫氫酶組合起來使用。膽固醇脫氫酶可以是未經修飾的酶，也可以是經過化學修飾的酶。經過化學修飾的膽固醇脫氫酶例如可以用前面所述的化學修飾劑、通過前面所述的化學修飾方法制作得到。
本反應的方法中所用的膽固醇脫氫酶的濃度，只要是能夠用來檢測本發明的HDL膽固醇的濃度即可，并沒有特別的限制，但優選在反應液中濃度為0.01～200U/mL，尤其優選0.02～100U/mL。
采用膽固醇脫氫酶的本發明檢測方法中要用到氧化型輔酶。氧化型輔酶可以舉出如NAD、NADP、硫代NAD、硫代NADP等。
本發明中所用的白蛋白，只要是能夠用來檢測本發明的HDL膽固醇即可，并沒有特別的限制，比如可以舉出牛、馬、羊、人來源的白蛋白等，但優選牛血清白蛋白(BSA)。另外也可以使用通過基因工程學方法制備而來的白蛋白。本發明中還可以將來源不同的2種以上白蛋白組合起來使用。本發明的HDL膽固醇檢測時的白蛋白濃度，只要是能夠用來檢測本發明的HDL膽固醇即可，并沒有特別的限制，但優選在反應液中的濃度為0.001～10％，尤為優選0.01～1％。
本發明中的膽汁酸衍生物，只要是能夠檢測本發明的HDL膽固醇的膽汁酸衍生物即可，并沒有特別的限制，比如可以舉出具有陰離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物、具有兩性表面活性作用的膽汁酸衍生物、具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物等。
本發明的膽汁酸衍生物特別優選具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物，由于采用的是膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶以及膽固醇酯水解酶等膽固醇檢測酶，因此具有HDL膽固醇檢測的準確性或再現性、同時膽固醇檢測酶具有保存穩定性。
具有陰離子表面活性作用的膽汁酸衍生物，可以舉出如膽酸或其鹽、牛磺膽酸或其鹽、甘氨膽酸或其鹽、石膽酸或其鹽、脫氧膽酸或其鹽、鵝脫氧膽酸或其鹽、熊脫氧膽酸或其鹽、7-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代鵝脫氧膽酸或其鹽、7-氧代脫氧膽酸或其鹽、豬膽酸或其鹽、豬脫氧膽酸或其鹽以及脫氫膽酸或其鹽。鹽可以舉出銨鹽、鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽等。具有陰離子表面活性作用的膽汁酸衍生物的濃度只要能夠用來檢測本發明的HDL膽固醇的濃度即可，并沒有特別的限制，但優選在反應液中的濃度為0.001～30％，尤其優選0.01～3％。
具有兩性表面活性作用的膽汁酸衍生物可以舉出如下列通式(I)表示的化合物[以下稱為化合物(I)]R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3-(I)[式中，R1表示3-(3-膽胺丙基)二甲銨基，R2表示氫原子或羥基]等。以下，將R2為氫原子的化合物(I)稱為CHAPS，R2為羥基的化合物(I)稱為CHAPSO。具有兩性表面活性作用的膽汁酸衍生物的濃度只要是能夠檢測本發明的HDL膽固醇的濃度即可，并沒有特別的限制，但優選在反應液中的濃度為0.001～30％，尤其優選0.01～3％。
非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物可以舉出如下列通式(II)所表示的化合物[以下稱為化合物(II)]
(X表示氫原子或羥基，R3和R4可以相同也可以不同，表示取代或未取代烷基、取代或未取代烷醇基)等。化合物(II)中烷基、烷酰基中都有的烷基可以舉出直鏈或支鏈狀的碳原子數1～10的烷基等，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等。化合物(II)中取代烷基以及取代烷酰基中的取代基可以舉出如羥基、鹵原子等。鹵原子就是氟、氯、溴、碘等原子。化合物(II)中的R3和R4均為COCH(OH)CH(OH)CH(OH)CH(OH)CH2OH(以下稱為取代基A)的化合物為優選。以下將X、R3和R4分別為氫原子、取代基A和取代基A的化合物稱為脫氧BIGCHAP，分別為羥基、取代基A和取代基A的化合物稱為BIGCHAP。
具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物，可以舉出如下列通式(III)表示的化合物[以下稱為化合物(III)] {式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV)所示的取代基
[式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，m表示0或1][以下稱為取代基(IV)]，N表示3～400之間的整數}。
化合物(III)可以通過如下列通式(V) [式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基]表示的化合物[以下稱為化合物(V)]，與如下列通式(VI) (式中、W’表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基，n表示3～400之間的整數)表示的化合物[以下稱為化合物(VI)]、或如下列通式(VII) (式中，T表示取代或未取代氨基烷基，n表示3～400之間的整數)所表示的化合物[以下稱為化合物(VII)]，在縮合劑存在下在溶劑中反應而制備(合成)得到。本反應還可以根據需要在有堿共存的條件下進行。
X、Y和Z表示氫原子、羥基或氧代基，但優選X、Y、Z中至少有一個為羥基。X’、Y’和Z’表示氫原子、羥基或氧代基，但優選X’、Y’和Z’中至少有一個為羥基。
化合物(III)和化合物(VI)中的烷基、烷酰基所共同的烷基可以為直鏈或支鏈狀的碳原子數1～18的烷基，比如可以舉出甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、己基、異己基、庚基、異庚基、辛基、異辛基、壬基、異壬基、癸基、異癸基、十一烷基、異十一烷基、十二烷基、異十二烷基、十三烷基、異十三烷基、十四烷基、異十四烷基、十五烷基、異十五烷基、十六烷基、異十六烷基、十七烷基、異十七烷基、十八烷基、異十八烷基等，優選甲基、乙基、丙基、壬基、十二烷基等。
化合物(III)和化合物(VI)中的烯基、烯酰基所共同的烯基為直鏈或支鏈狀的碳原子數2～8的烯基，比如可以舉出乙烯基、丙烯基、異丙烯基、芳基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基等。
化合物(III)和化合物(VI)中的炔基、炔酰基所共同的炔基可以為直鏈或支鏈狀的碳原子數2～8的炔基，比如可以舉出乙炔基、丙炔基、炔丙基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基等。
化合物(III)和化合物(VI)中的環烷基可以是碳原子數3～8的環烷基，比如可以舉出環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、環辛基等。
化合物(III)和化合物(VI)中的環烯基可以是碳原子數4～8的環烯基，比如可以舉出環丙烯基、環丁烯基、環戊烯基、環己烯基、環庚烯基、環辛烯基等。
化合物(III)和化合物(VI)中的芳基可以是碳原子數6～15的芳基，比如可以舉出苯基、萘基、蒽基、菲基、聯苯基等。環戊烯基、環己烯基、環庚烯基、環辛烯基等。化合物(III)中取代芳基的取代基可以舉出如烷基等。該烷基可以舉出如前面所述的烷基。
化合物(III)和化合物(VII)中的氨基烷基可以舉出如N-一取代氨基烷基、N，N-二取代氨基烷基等。N，N-二取代氨基烷基中氮原子上的兩個取代基可以相同也可以不同。N-一取代氨基烷基與N，N-二取代氨基烷基中氮原子上的取代基可以舉出如前所述的烷基等。N-一取代氨基烷基具體可以舉出如2-(N-甲基氨基)乙基、2-(N-乙基氨基)乙基、2-(N-丙基氨基)乙基、2-(N-丁基氨基)乙基、3-(N-甲基氨基)丙基、3-(N-乙基氨基)丙基、3-(N-丙基氨基)丙基、3-(N-丁基氨基)丙基、4-(N-甲基氨基)丁基、4-(N-乙基氨基)丁基、4-(N-丙基氨基)丁基、4-(N-丁基氨基)丁基等。N，N-二取代氨基烷基具體可以舉出如2-(N，N-二甲基氨基)乙基、3-(N，N-二甲基氨基)丙基、4-(N，N-二甲基氨基)丁基等。化合物(III)和化合物(VII)中未取代氨基烷基具體可以舉出2-氨基乙基、3-氨基丙基、4-氨基丁基等。
n表示酯的部分中氧乙烯基的平均聚合度。平均聚合度只要是能夠測定本發明的HDL膽固醇的范圍內即可，并沒有特別的限制，但優選3～400，更優選8～300，特別優選15～200。
化合物(V)可以舉出如膽酸、石膽酸、脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸、熊脫氧膽酸、7-氧代石膽酸、12-氧代石膽酸、12-氧代鵝脫氧膽酸、7-氧代脫氧膽酸、豬膽酸、豬脫氧膽酸以及脫氫膽酸等。
在合成W為氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基和取代或未取代氨基烷基中的任何基團的化合物(III)[以下稱為化合物(IIIa)]時，化合物(VI)或化合物(VII)與化合物(V)的當量比優選0.5～1.5，更優選1～1.2。在合成W為如通式(IV)所示的基團的化合物(III)[以下稱為化合物(IIIb)]時，化合物(VI)或化合物(VII)與化合物(V)的當量比優選1.3～4.1，尤為優選1.7～2.2。
合成化合物(III)時的反應溫度優選10～40℃，尤為優選20～35℃。合成化合物(III)時的反應溶劑，只要是不影響化合物(V)和化合物(VI)的縮合反應的溶劑即可，并沒有特別的限制，比如可以舉出有機溶劑等。該有機溶劑可以舉出如甲苯、二甲苯等芳香烴類溶劑、乙酸乙酯等脂肪族酯類溶劑、二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷等鹵代烴類溶劑等等。
化合物(III)合成時所用的縮合劑只要是可以使化合物(V)與化合物(VI)的縮合反應進行的縮合劑即可，并沒有特別的限制，比如可以舉出碳化二亞胺類、吡啶鎓鹽、苯并噻唑鎓鹽、苯并噁唑鎓鹽、異氰酸酯類、羰基試劑等，優選碳化二亞胺類。碳化二亞胺類可以舉出如1，3-二環己基碳化二亞胺、1，3-二(叔丁基)碳化二亞胺、1，3-二異丙基碳化二亞胺、水溶性碳化二亞胺等，但從用水清洗除去方便的角度考慮，特別優選水溶性碳化二亞胺。水溶性碳化二亞胺可以舉出如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺或其鹽等。該鹽可以舉出如鹽酸鹽、甲基碘鹽等。吡啶鎓鹽可以舉出如碘化2-氯甲基吡啶鎓鹽、碘化2-溴甲基吡啶鎓鹽等。苯并噁唑鎓鹽可以舉出如2-氯苯并噁唑鎓氟化硼鹽等。苯并噻唑鎓鹽可以舉出如2-氯苯并噻唑氟化硼鹽等。異氰酸酯類可以舉出如氯磺酰基異氰酸酯等。羰基試劑可以舉出如1，1-羰基二咪唑等。
縮合反應中縮合劑的當量數，如果是合成化合物(IIIa)則優選相對于化合物(V)為1.0～5.0當量，尤其優選1.1～2.5當量；如果是合成化合物(IIIb)則優選相對于化合物(VI)或化合物(VII)為1.0～5.0當量，尤其優選1.1～2.5當量。
合成化合物(III)時根據需要使用的堿可以舉出如吡啶類似物。該吡啶類似物比如可以舉出吡啶、2-甲基吡啶、3-甲基吡啶、4-甲基吡啶、2-乙基吡啶、3-乙基吡啶、4-乙基吡啶、2-丙基吡啶、3-丙基吡啶、4-丙基吡啶、2，6-二甲基吡啶、2，3-二甲基吡啶、2，4-二甲基吡啶、2，5-二甲基吡啶、3，4-二甲基吡啶、3，5-二甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶、2，3，5-二甲基吡啶、2-二甲基氨基吡啶、4-二甲基氨基吡啶、4-吡咯烷基吡啶、4-哌啶基吡啶等，特別優選4-二甲基氨基吡啶、4-吡咯烷基吡啶、4-哌啶基吡啶。吡啶類似物的當量優選相對于化合物(V)為0.01～2.5當量，尤其優選0.7～1.2當量。
化合物(V)與化合物(VI)或化合物(VII)的縮合反應的后處理，可以采取如下的一系列操作，即將水或水和有機溶劑的混合物加入反應溶液中，用有機溶劑將化合物(III)[化合物(IIIa)或化合物(IIIb)]從生成的反應混合物中提取出來，提取液中所含的水用干燥劑除去，然后將該干燥劑過濾，將得到的濾液中的溶劑常壓或減壓條件下蒸去。還有，也可以將含有化合物(III)的提取液用酸清洗，除去該提取液中的堿性物質(縮合劑、來源于縮合劑的物質、堿)。用酸清洗后的溶液再進一步用水或食鹽水清洗優選。加入反應溶液中的有機溶劑與反應所用的有機溶劑可以相同，也可以不同，但優選其與反應所用溶劑相同。另外，加入反應溶液中的有機溶劑與用于提取的有機溶劑可以相同也可以不同。加入反應溶液中的有機溶劑或用于提取的有機溶劑可以舉出如前面所述的有機溶劑，優選其中的二氯甲烷、乙酸乙酯等。
化合物(V)與化合物(VI)或化合物(VII)的縮合反應后處理所得到的含有化合物(III)的反應混合物可以直接用來檢測HDL膽固醇，也可以將其經過適當的分離精制處理進行精制后再來檢測。該分離精制處理的方法可以舉出如硅膠柱色譜法、HPLC、蒸餾、分餾、重結晶等。
具有非離子性表面活性的膽汁酸衍生物的濃度只要是能夠測定本發明的HDL膽固醇的濃度即可，并沒有特別的限制，但優選在反應液中的濃度為0.001～30％，尤其優選0.01～3％。
本發明的HDL膽固醇測定法中所用的水性介質可以舉出如去離子水、蒸餾水、緩沖液等，優選緩沖液。緩沖液中所用的緩沖劑可以舉出如三(羥甲基)氨基甲烷緩沖劑、磷酸緩沖劑、硼酸緩沖劑、Good’s緩沖劑等。Good’s緩沖劑比如有2-嗎啉代乙磺酸(MES)、雙(2-羥乙基)亞胺基三(羥甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-(2-乙酰胺基)亞氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N，N’-二(2-乙磺酸)(PIPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACES)、3-嗎啉代-2-羥基丙磺酸(MOPSO)、N，N’-二(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-嗎啉代丙磺酸(MOPS)、N-[三(羥甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸(TES)、2-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPES)、3-[N，N-二(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸(DIPSO)、N-[三(羥甲基)甲基]-2-羥基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N，N’-二(2-羥基丙磺酸)(POPSO)、3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]-2-羥基丙磺酸(HEPPSO)、3-[4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三(羥甲基)甲基]氨基乙酸(Tricine)、N，N-二(2-羥乙基)氨基乙酸(Bicine)、N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-環己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-環己基-3-氨基-2-羥基丙磺酸(CAPSO)、N-環己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)等。緩沖液的濃度只要是適用于測定的濃度即可，并沒有特別的限制，但優選0.001～2.0mol/L，尤其優選0.005～1.0mol/L。
以下具體說明本發明的HDL膽固醇的檢測方法、檢測試劑以及檢測試劑盒。
(HDL膽固醇的檢測方法)本發明的HDL膽固醇的檢測方法可以舉出如下所述的方法。
檢測方法1(1)檢測樣本與未經修飾的膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶、或是與未經修飾的膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固醇脫氫酶，在含有膽汁酸衍生物的水性介質中反應；(2)測定生成的過氧化氫或還原型輔酶；(3)由(2)得到的測定值與預先做好的標準曲線計算出檢測樣本中HDL膽固醇的濃度，由此即可測定樣本中的HDL膽固醇。
檢測方法2(1)檢測樣本與未經修飾的膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶、或是與未經修飾的膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固醇脫氫酶，在含有膽汁酸衍生物以及白蛋白的水性介質中反應；(2)測定生成的過氧化氫或還原型輔酶；(3)由(2)得到的測定值與預先做好的標準曲線計算出檢測樣本中HDL膽固醇的濃度，由此即可檢測樣本中的HDL膽固醇。
檢測方法3(1)檢測樣本與經過化學修飾的膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶、或是與經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固醇脫氫酶，在含有膽汁酸衍生物的水性介質中反應；(2)測定生成的過氧化氫或還原型輔酶；(3)由(2)得到的測定值與預先做好的標準曲線計算出檢測樣本中HDL膽固醇的濃度，由此即可檢測樣本中的HDL膽固醇。
檢測方法4(1)檢測樣本與經過化學修飾的膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶、或是與經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固醇脫氫酶，在含有膽汁酸衍生物以及白蛋白的水性介質中反應；(2)測定生成的過氧化氫或還原型輔酶；(3)由(2)得到的測定值與預先做好的標準曲線計算出檢測樣本中HDL膽固醇的濃度，由此即可檢測樣本中的HDL膽固醇。
本檢測方法中，第(1)步反應可以在10～50℃進行，優選在20～40℃進行，反應可以進行1～60分鐘，優選2～30分鐘。
生成的過氧化氫的量可以通過如過氧化氫檢測試劑等進行測定。過氧化氫檢測試劑就是用來將生成的過氧化氫轉換成可以檢驗出來的物質的試劑。可以檢驗出來的物質比如可以舉出色素、發光物質等，優選色素。可以檢驗出來的物質為色素時，則過氧化氫檢測試劑含有氧化發色型色原體以及過氧化物酶等過氧化活性物質。氧化發色型色原體可以舉出如后面所述的氧化發色型色原體。可以檢驗出來的物質為發光物質時，則過氧化氫檢測試劑含有化學發光物質。化學發光物質可以舉出如氨基苯二酰肼、異氨基苯二酰肼、光澤精、吖啶鎓酯等。
過氧化氫檢測試劑如果是含有氧化發色型色原體以及過氧化物酶等過氧化活性物質的試劑，則過氧化氫在有過氧化活性物質存在的條件下與氧化發色型色原體反應生成色素，定量分析生成的色素，由此就可以對過氧化氫進行定量。而如果是用含有化學發光物質的過氧化氫檢測試劑，過氧化氫與化學發光物質反應產生光子，定量分析產生的光子，由此即可對過氧化氫進行定量。
氧化發色型色原體可以舉出如無色型色原體、氧化偶合發色型色原體等。無色型色原體就是在有過氧化氫以及過氧化物酶等過氧化活性物質存在時可以自己轉變成色素的物質。具體可以舉出如10-N-羧甲基氨基甲酰基-3，7-雙(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-雙(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲基氨基)二苯胺鈉鹽(DA-64)、4，4’-雙(二甲基氨基)二苯胺、雙[3-雙(4-氯苯基)甲基-4-二甲基氨基苯基]胺(BCMA)等。
氧化偶合發色型色原體就是在有過氧化氫以及過氧化物酶等過氧化活性物質存在時，兩個化合物會發生氧化偶合從而生成色素的物質。兩個化合物的組合可以舉出如偶合劑與苯胺類的組合、偶合劑與苯酚類的組合等。偶合劑可以舉出如4-氨基安替比林(4-AA)、3-甲基-2-苯并噻唑酮肼等。苯胺類可以舉出如N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N，N-二甲基-3-甲基苯胺、N，N-二(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰乙二胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-4-氟-3，5-二甲氧基苯胺(F-DAOS)等。苯酚類可以舉出如苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚、3-羥基-2，4，6-三碘苯甲酸(HTIB)等。
測定過氧化氫時過氧化活性物質的濃度只要是適于測定的濃度即可，并沒有特別的限制，如果過氧化活性物質用的是過氧化物酶，則濃度優選1～100kU/L。氧化發色型色原體的濃度只要是適于測定的濃度即可，沒有特別的限制，但優選0.01～10g/L。
還原型輔酶的測定方法可以舉出如測定生成的還原型輔酶的吸光度的方法、采用還原型輔酶檢測試劑來測定的方法。測定還原型輔酶吸光度的方法中吸光度優選300～500nm，更加優選330～400nm，特別優選340nm左右。還原型輔酶檢測試劑就是將生成的還原型輔酶轉換成可以檢驗出來的物質的試劑。可以檢驗出來的物質可以舉出如色素等。可以檢驗出來的物質為色素時的還原型輔酶檢測試劑可以舉出如含有心肌黃酶、電子導體以及還原發色型色原體的試劑。電子導體可以舉出如1-甲氧基-5-甲基フエナジウム甲基硫酸等。用含有心肌黃酶、電子載體以及還原發色型色原體的試劑作為還原型輔酶檢測試劑時，還原發色型色原體轉換成為色素，通過定量分析此色素，就可以對還原型輔酶進行定量。
還原發色型色原體可以舉出如溴化-3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四氮唑(MTT)、2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5(2，4-二磺苯基)-2H-四氮唑一鈉鹽(WST-1)、2-(4-碘苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四氮唑一鈉鹽等(WST-3)。
(HDL膽固醇檢測試劑)本發明的HDL膽固醇檢測試劑可以舉出如下所述的試劑。
試劑1含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽汁酸衍生物以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
試劑2含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽汁酸衍生物、白蛋白以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
試劑3含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、膽汁酸衍生物以及氧化型輔酶的試劑。
試劑4含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、膽汁酸衍生物、白蛋白以及氧化型輔酶的試劑。
試劑5含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、膽汁酸衍生物、氧化型輔酶以及還原型輔酶檢測試劑的試劑。
試劑6含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、膽汁酸衍生物、白蛋白、氧化型輔酶以及還原型輔酶檢測試劑的試劑。
試劑7含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽汁酸衍生物以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
試劑8含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽汁酸衍生物、白蛋白以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
試劑9含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、膽汁酸衍生物以及氧化型輔酶的試劑。
試劑10含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、膽汁酸衍生物、白蛋白以及氧化型輔酶的試劑。
試劑11含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、膽汁酸衍生物、氧化型輔酶以及還原型輔酶檢測試劑的試劑。
試劑12含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、膽汁酸衍生物、白蛋白、氧化型輔酶以及還原型輔酶檢測試劑的試劑。
本發明的HDL膽固醇檢測試劑可以采用如前所述本發明的HDL膽固醇檢測方法中所舉出的膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽固醇脫氫酶、膽汁酸衍生物、白蛋白、氧化型輔酶、還原型輔酶檢測試劑。
(HDL膽固醇檢測試劑盒)
本發明的HDL膽固醇檢測試劑也可以采用試劑盒的形式進行保存、流通和使用。試劑盒的形式沒有特別的限制，可以是二試劑型、三試劑型等的任何形式，但優選二試劑型。
第一試劑和第二試劑組成的二試劑型HDL膽固醇檢測試劑盒中，膽固醇酯水解酶與膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶可以是分別包含于第一試劑與第二試劑中，也可以是一起包含在第二試劑中；如果是分別包含于第一試劑與第二試劑中，則優選的試劑盒形式為膽固醇酯水解酶含于第一試劑中、而膽固醇氧化酶或者膽固醇脫氫酶含于第二試劑中。膽汁酸衍生物可以是包含在第一試劑、第二試劑的任何一個之中，也可以兩者中都包含。采用膽固醇脫氫酶的檢測方法中所用的氧化型輔酶可以包含在第一試劑、第二試劑的任何一個之中，也可以兩者中都包含。過氧化氫檢測試劑可以包含在第一試劑、第二試劑的任何一個之中，也可以兩者中都包含，但如果該檢測試劑含有氧化偶合型色原體，則優選氧化偶合型色原體的各個化合物分別包含在各個試劑中。還原型輔酶檢測試劑可以包含在第一試劑、第二試劑的任何一個之中，也可以兩者中都包含。還有白蛋白可以包含在第一試劑、第二試劑的任何一個之中，也可以兩者中都包含。
試劑盒具體可以舉出以下的組合形式。
試劑盒1第一試劑含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽汁酸衍生物以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇氧化酶以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
試劑盒2第一試劑含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽汁酸衍生物、白蛋白以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇氧化酶以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
試劑盒3第一試劑含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽汁酸衍生物以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇氧化酶以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
試劑盒4第一試劑含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽汁酸衍生物、白蛋白以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
第二試劑含有膽固醇氧化酶以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
試劑盒5第一試劑含有過氧化氫檢測試劑的試劑。
第二試劑含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽汁酸衍生物以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
試劑盒6第一試劑含有白蛋白以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
第二試劑含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽汁酸衍生物以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
試劑盒7第一試劑含有過氧化氫檢測試劑的試劑。
第二試劑含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽汁酸衍生物以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
試劑盒8第一試劑含有白蛋白以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
第二試劑含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽汁酸衍生物以及過氧化氫檢測試劑的試劑。
試劑盒9第一試劑含有未經修飾的膽固醇酯水解酶以及膽汁酸衍生物的試劑。
第二試劑含有膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶的試劑。
試劑盒10第一試劑含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽汁酸衍生物以及白蛋白的試劑。
第二試劑含有膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶的試劑。
試劑盒11第一試劑含有未經修飾的膽固醇酯水解酶以及膽汁酸衍生物的試劑。
第二試劑含有膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶以及還原型輔酶檢測試劑的試劑。
試劑盒12第一試劑含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽汁酸衍生物以及白蛋白的試劑。
第二試劑含有膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶以及還原型輔酶檢測試劑的試劑。
試劑盒13第一試劑含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶以及膽汁酸衍生物的試劑。
第二試劑含有膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶的試劑。
試劑盒14第一試劑含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽汁酸衍生物以及白蛋白的試劑。
第二試劑含有膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶的試劑。
試劑盒15第一試劑含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶以及膽汁酸衍生物的試劑。
第二試劑含有膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶以及還原型輔酶檢測試劑的試劑。
試劑盒16第一試劑含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽汁酸衍生物以及白蛋白的試劑。
第二試劑含有膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶以及還原型輔酶檢測試劑的試劑。
試劑盒17第一試劑含有膽汁酸衍生物的試劑。
第二試劑含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶的試劑。
試劑盒18第一試劑含有膽汁酸衍生物以及白蛋白的試劑。
第二試劑含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶的試劑。
試劑盒19第一試劑含有膽汁酸衍生物的試劑。
第二試劑含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶以及還原型輔酶檢測試劑的試劑。
試劑盒20第一試劑含有膽汁酸衍生物以及白蛋白的試劑。
第二試劑含有未經修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶以及還原型輔酶檢測試劑的試劑。
試劑盒21第一試劑含有膽汁酸衍生物的試劑。
第二試劑含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶的試劑。
試劑盒22
第一試劑含有膽汁酸衍生物以及白蛋白的試劑。
第二試劑含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶以及氧化型輔酶的試劑。
試劑盒23第一試劑含有膽汁酸衍生物的試劑。
第二試劑含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶以及還原型輔酶檢測試劑的試劑。
試劑盒24第一試劑含有膽汁酸衍生物以及白蛋白的試劑。
第二試劑含有經過化學修飾的膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、氧化型輔酶以及還原型輔酶檢測試劑的試劑。
本發明的HDL膽固醇檢測試劑盒可以采用前面所述的本發明HDL膽固醇檢測方法中所舉出的膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽固醇脫氫酶、膽汁酸衍生物、白蛋白、過氧化氫檢測試劑、氧化型輔酶、還原型輔酶檢測試劑。
本發明的HDL膽固醇檢測試劑以及檢測試劑盒也可以根據需要包含水性介質、穩定劑、防腐劑、妨礙物質消除劑、反應促進劑等。水性介質可以舉出前面所述的水性介質等。穩定劑可以舉出如乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化鈣等。防腐劑可以舉出如疊氮化鈉、抗生素等。妨礙物質消除劑可以舉出如消除抗壞血酸的影響的抗壞血酸氧化酶等。反應促進劑可以舉出如輔脂肪酶、磷脂酶等酶類、硫酸鈉、氯化鈉等鹽類物質。本發明的HDL膽固醇檢測試劑以及檢測試劑盒可以是冷凍干燥品的狀態，也可以是溶解于水性介質中的狀態。采用冷凍干燥狀態的試劑檢測樣本中HDL膽固醇時，先將該試劑溶于水性介質中后再行使用。
本發明的HDL膽固醇檢測試劑以及檢測試劑盒中的膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽固醇脫氫酶的含量優選其溶于水性介質后的濃度達到0.01～800U/mL的含量，尤為優選0.02～400U/mL。本發明的HDL膽固醇檢測試劑以及檢測試劑盒中的膽汁酸衍生物的含量優選其溶于水性介質后的濃度達到0.001～30％的含量，尤為優選0.01～10％。本發明的HDL膽固醇檢測試劑以及檢測試劑盒中的白蛋白的含量優選其溶于水性介質后的濃度達到0.001～10％的含量，尤為優選0.01～5％。
以下用實施例進一步詳細說明，但本發明并不僅限于這些實施例。本發明中使用了以下試劑以及酶。
HEPES(BDH Laboratory公司生產)、EMSE(Daito Chemics公司生產)、牛血清白蛋白(BSA；Oriental公司生產)、4-氨基安替比林(埼京化成公司生產)、過氧化物酶(東洋紡績社生產)、LPL311(膽固醇酯水解酶；東洋紡績社生產)、LPL6(膽固醇酯水解酶；天野酶公司生產)、CHE2(膽固醇酯水解酶；天野酶公司生產)、COE313(經過化學修飾的膽固醇酯水解酶；東洋紡績社生產)、COO321(膽固醇氧化酶；東洋紡績社生產)、膽酸鈉(ACROS公司生產)、牛磺膽酸鈉(東京化成公司生產)、BIGCHAP(同仁化學公司生產)、CHAPS(同仁化學公司生產)、硫酸葡聚糖鈉(分子量50萬；法瑪西亞公司生產)。
另外，本實施例中進行膽汁酸衍生物的鑒定時，是用下列分析儀器取得各種數據的。
核磁共振波譜儀(1H-NMR，13C-NMR)JEOL GSX-400(日本電子公司生產)1H-NMR波譜測定是用四甲硅烷作為內標，標示基于四甲硅烷的化學位移(δ)。13C-NMR波譜測定就是標示當來源于CDCl3的3個峰的中心峰設為77.0PPm時各峰的化學位移(δ)。
紅外吸收光譜(IR)Nicolet NEXUS470(Nicole公司生產)凝膠滲透色譜(GPC)系統TOSOH HLC-8120GPC(東曹公司生產)GPC柱TSKgel Super H-RC(低分子分析用)(東曹公司生產)2根串連。
柱保持溫度40℃展開溶劑四氫呋喃流速0.5mL/分鐘檢測器RI(折射率)標準曲線制作用標準物質聚乙二醇實施發明的最佳方式參考例1 化學修飾LPL311(經過化學修飾的LPL311)的制備在HEPES緩沖液(pH8.5，0.15mol/L)中加入LPL311使其濃度達到33g/L，冷卻至5℃，然后加入SUNBRIDE VFM-4101或SUNBRIDEAKM-1510或SUNBRIDE MEAC-50HS(均為日本油脂公司生產)使其濃度達到330g/L，再反應3小時。得到的修飾酶溶液不經精制分離而直接作為化學修飾LPL311使用。
參考例2 化學修飾CHE2(經過化學修飾的CHE2)的制備在HEPES緩沖液(pH8.5，0.15mol/L)中加入CHE2使其濃度達到50g/L，冷卻至5℃，然后加入SUNBRIDE VFM-4101(日本油脂公司生產)使其濃度達到200g/L，再反應3小時。得到的修飾酶溶液不經精制分離而直接作為化學修飾CHE2使用。
實施例1 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L·第二試劑
HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO3213.0kU/L膽酸鈉6.0g/L實施例2 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/LBSA 2.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO3213.0kU/L膽酸鈉6.0g/L實施例2 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L·第二試劑
HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2U/LCOO321 3.0kU/L牛磺膽酸鈉 7.0g/L實施例4 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/LBSA 2.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO321 3.0kU/L牛磺膽酸鈉 7.0g/L實施例5 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L·第二試劑
HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO321 3.0kU/LBIGCHAP 4.5g/L實施例6 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/LBSA 2.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO321 3.0kU/LBIGCHAP 4.5g/L實施例7 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L·第二試劑
HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO321 3.0kU/LCHAPS 6.0g/L實施例8 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/LBSA 2.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO321 3.0kU/LCHAPS 6.0g/L比較例1 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L·第二試劑
HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO321 3.0kU/L比較例2 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/LBSA 2.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO321 3.0kU/L實施例9 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/LBSA 2.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L
4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO3213.0kU/L膽酸鈉6.0g/L實施例10 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO3213.0kU/L膽酸鈉6.0g/L實施例11 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/LBSA 2.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L
LPL60.05kU/LCOO321 3.0kU/L牛磺膽酸鈉 7.0g/L實施例12 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L·第二試劑HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL60.05kU/LCOO321 3.0kU/L牛磺膽酸鈉 7.0g/L實施例13 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L·第二試劑HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL60.05kU/LCOO321 3.0kU/LBIGCHAP 4.5g/L
實施例14 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/LBSA 2.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO3213.0kU/LBIGCHAP 4.5g/L實施例15 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安提比林0.3g/L過氧化物酶20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO3213.0kU/LCHAPS 6.0g/L實施例16 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/LBSA 2.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO3213.0kU/LCHAPS 6.0g/L比較例3 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/LLPL6 0.05kU/LCOO3213.0kU/L比較例4 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/L
EMSE0.3g/LBSA 2.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/LLPL60.05kU/LCOO321 3.0kU/L實施例17 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L·第二試劑HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾CHE2(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO321 3.0kU/L膽酸鈉 6.0g/L實施例18 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L·第二試劑
HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用MEAC-50HS修飾過的)0.2kU/LCOO321 3.0kU/L膽酸鈉 6.0g/L實施例19 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L·第二試劑HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用AKM-1510修飾過的)0.2kU/LCOO321 3.0kU/L膽酸鈉 6.0g/L實施例20 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L·第二試劑HEPES(pH7.0)10mmol/L
4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/LCOE3131.0kU/LCOO3213.0kU/L膽酸鈉6.0g/L實施例21 HDL膽固醇的測定用實施例1的試劑盒，通過日立7170型自動分析裝置測定了30個血清樣本中的HDL膽固醇。
(1)標準曲線的繪制用生理鹽水(HDL膽固醇濃度0.0mg/DL)以及血清(HDL膽固醇濃度60.0mg/DL)作為標準液，用實施例1的試劑盒作為檢測試劑盒，利用日立7170型自動分析裝置繪制表示HDL膽固醇濃度和“吸光度”之間關系的標準曲線。
此處的“吸光度”是指由以下反應測得兩個吸光度(E1以及E2)、再用E2減去E1得到的值。
反應容器中加入標準液(3μL)和第一試劑(0.24mL)，在37℃下孵育5分鐘，在主波長600nm、副波長700nm下測定反應液的吸光度(E1)，接著在此反應液中加入第二試劑(0.08mL)，再在37℃下孵育5分鐘，在主波長600nm、副波長700nm下測定反應液的吸光度(E2)。
(2)通過人體血清樣本和實施例1的試劑盒的反應計算出該樣本的“吸光度”除了用人體血清樣本代替繪制(1)的標準曲線時所用的標準液以外，其它操作相同，用(1)的“吸光度”計算方法同樣計算出該樣本的“吸光度”。
(3)人體血清樣本中HDL膽固醇濃度的測定用(2)中計算出的“吸光度”以及(1)中繪制的標準曲線來測定各樣本中HDL膽固醇的濃度。
實施例22 HDL膽固醇的測定除了用實施例2的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例23 HDL膽固醇的測定除了用實施例3的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例24 HDL膽固醇的測定除了用實施例4的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例25 HDL膽固醇的測定除了用實施例5的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例26 HDL膽固醇的測定除了用實施例6的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例27 HDL膽固醇的測定除了用實施例7的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例28 HDL膽固醇的測定除了用實施例8的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
比較例5 HDL膽固醇的測定除了用比較例1的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
比較例6 HDL膽固醇的測定除了用比較例2的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例29 HDL膽固醇的測定除了用實施例9的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例30 HDL膽固醇的測定除了用實施例10的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例31 HDL膽固醇的測定除了用實施例11的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例32 HDL膽固醇的測定除了用實施例12的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例33 HDL膽固醇的測定除了用實施例13的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例34 HDL膽固醇的測定除了用實施例14的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例35 HDL膽固醇的測定除了用實施例15的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例36 HDL膽固醇的測定除了用實施例16的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
比較例7 HDL膽固醇的測定除了用比較例3的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
比較例8 HDL膽固醇的測定除了用比較例4的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例37 HDL膽固醇的測定除了用實施例17的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例38 HDL膽固醇的測定除了用實施例18的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例39 HDL膽固醇的測定除了用實施例19的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
實施例40 HDL膽固醇的測定除了用實施例20的試劑盒代替實施例1的試劑盒以外，其它均與實施例21的測定方法相同，由此通過日立7170型自動分析裝置檢測人體血清的30個樣本中的HDL膽固醇。
另外，實施例21～40以及比較例5～8的測定中所用的人體血清樣本用臨床化學(Clinical Chemistry)第45卷10號(1999年)中記載的DCM法(指定性比較法，Designated Comparison Method)來測定該樣本中的HDL膽固醇，對各種檢測方法進行比較。
實施例21～40以及比較例5～8的各個測定方法與通過DCM法進行的測定方法之間的相關系數如表1所示。
表1

由實施例21～28的結果可知，如果是用經過化學修飾的膽固醇酯水解酶，則不管有無白蛋白，即使有膽酸、牛磺膽酸、BIGCHAP、CHAPS中任何一種膽汁酸衍生物存在，它們與DCM法測定均具有良好的相關性，而比較例5以及6的結果顯示，在不存在膽汁酸衍生物的情況下，不管有無白蛋白，它們與DCM法測定都不具有良好的相關性。
另外，通過實施例29和實施例30、實施例31和實施例32、實施例33和實施例34、實施例35和實施例36的比較可知，膽固醇酯水解酶如果用的是未經修飾的酶，則在有膽酸或牛磺膽酸作為膽汁酸衍生物存在的條件下，加入白蛋白時的結果與DCM法測定的相關性要比不加白蛋白時的更好；而在有BIGCHAP或CHAPS作為膽汁酸衍生物存在的條件下，不管有無白蛋白，結果均與DCM法測定之間具有良好的相關性。
另外，比較實施例21和實施例37可知，即使采用除化學修飾LPL311以外的經過化學修飾的膽固醇酯水解酶進行測定，結果與DCM法測定之間也具有良好的相關性。再對實施例21和實施例38、實施例21和實施例39進行比較可知，即使是用除VFM-4101以外的修飾劑作為化學修飾劑配制后得到經過化學修飾的膽固醇酯水解酶，結果與DCM法測定之間也具有良好的相關性。比較實施例21和實施例40可知，即使經過化學修飾的膽固醇酯水解酶是采用市售產品，結果與DCM法測定之間也具有良好的相關性。
實施例41 膽酸酯[化合物(IIIa-1)]的合成在裝配好滴液裝置、攪拌裝置、溫度計、冷凝管以及氮氣導入管的燒瓶之中，加入聚乙二醇甲醚(平均分子量2000，Aldrich公司生產)110g(55mmol)、二甲基氨基吡啶(廣榮化學工業公司生產)6.7g(55mmol)以及二氯甲烷100mL，使其溶解。在此溶解液中加入膽酸(Mikuni化學產業公司生產)20.4g(50mmol)，接著再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的鹽酸鹽(Aibaitsu公司生產)10.5g(55mmol)。在充氮條件下室溫攪拌12小時，再加入二氯乙烷200mL、水300mL進行提取。有機層用0.2mol/L的鹽酸200mL清洗，再用10％食鹽水300mL清洗二次。然后，分離得到的有機層中加入乙酸乙酯500mL，用10％食鹽水300mL清洗三次。有機層用硫酸鎂干燥，濾除干燥劑，濾液用旋轉式蒸發器濃縮。再用真空泵在80℃下減壓干燥2小時，得到白色蠟狀固體的化合物(IIIa-1)115g(收率96％)。

1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)0.69(s，3H)，0.90(s，3H)，0.98(d，J＝6.0Hz，3H)，0.98-2.40(m，27H)，3.38(s，3H)，3.64(bs，179H)，3.97(s，2H)，4.22(m，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)12.5，17.3，22.5，23.2，26.4，27.5，28.3，30.4，30.8，31.1，34.7，35.2，35.3，39.5，39.6，41.5，41.7，46.4，47.0，59.0，63.4，68.2，69.1，70.5，70.9，71.7，71.9，72.9，174.2.IR(KBrDisk，cm-1)2887，1734，1468，1343，1149，1111，1060，963，842.GPC(平均分子量)Mw 2390(Mw/Mn1.05).
實施例42 膽酸酯[化合物(IIIa-2)]的合成燒瓶內加入聚乙二醇甲醚(平均分子量400，日本油脂公司生產unioxM-400)4.8g(12mmol)、二甲基氨基吡啶(廣榮化學工業公司生產)1.46g(12mmol)以及二氯甲烷30mL，使其溶解。在此溶解液中加入膽酸(Mikuni化學產業公司生產)4.08g(10mmol)，接著再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的鹽酸鹽(Aibaitsu公司生產)2.3g(12mmol)。在充氮條件下室溫攪拌12小時，再加入二氯乙烷20mL、水50mL進行提取。有機層用0.2mol/L的鹽酸50mL清洗，再用10％食鹽水50mL清洗二次。然后，分離得到的有機層中加入乙酸乙酯100mL，用10％食鹽水100mL清洗三次。有機層用硫酸鎂干燥，濾除干燥劑，濾液用旋轉式蒸發器濃縮。再用真空泵在80℃下減壓干燥2小時，得到無色油狀物的化合物(IIIa-2)7.8g(收率95％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)0.68(s，3H)，0.89(s，3H)，0.98(d，J＝6.0Hz，3H)，0.98-2.31(m，27H)，3.38(s，3H)，3.45(bs，1H)，3.55(bs，2H)，3.65(bs，32H)，3.85(bs，1H)，3.96(bs，1H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)12.5，17.3，22.5，23.2，26.3，27.5，28.2，30.4，30.9，31.2，34.7，34.8，35.3，39.5，41.5，41.6，46.4，47.0，59.0，63.4，68.4，69.2，70.6，71.8，71.9，73.0，174.3.IR(KBrDisk，cm-1)2931，2868，1734，1451，1375，1299，1251，1110，1111，1045，950，856.GPC(平均分子量)Mw 820(Mw/Mn1.04).
實施例43 膽酸酯[化合物(IIIa-3)]的合成燒瓶內加入聚乙二醇甲醚(平均分子量1000，日本油脂公司生產unioxM-1000)12g(12mmol)、二甲基氨基吡啶(廣榮化學工業公司生產)1.46g(12mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入膽酸(MikUni化學產業公司生產)4.08g(10mmol)，接著再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的鹽酸鹽(Aibaitsu公司生產)2.3g(12mmol)。在充氮條件下室溫攪拌12小時，再加入二氯乙烷30mL、水50mL進行提取。有機層用0.2mol/L的鹽酸50mL清洗，再用10％食鹽水50mL清洗二次。然后，分離得到的有機層中加入乙酸乙酯200mL，用10％食鹽水200mL清洗三次。有機層用硫酸鎂干燥，濾除干燥劑，濾液用旋轉式蒸發器濃縮。再用真空泵在80℃下減壓干燥2小時，得到白色蠟狀固體的化合物(IIIa-3)13.2g(收率95％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)0.68(s，3H)，0.89(s，3H)，0.98(d，J＝6.2Hz，3H)，0.98-2.45(m，27H)，3.38(s，3H)，3.46(bs，1H)，3.55(bs，2H)，3.64(bs，84H)，3.84(bs，1H)，3.96(bs，1H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)12.5，17.3，22.5，23.2，26.4，27.5，28.3，30.4，30.8，31.2，34.8，35.3，39.5，41.5，41.7，46.4，47.0，59.0，63.4，68.3，69.1，70.5，70.9，71.8，71.9，72.9，174.2.IR(KBr Disk，cm-1)2870，1732，1466，1345，1112，950，844.GPC(平均分子量)Mw 1430(Mw/Mn1.04).
實施例44 膽酸酯[化合物(IIIa-4)]的合成燒瓶內加入聚乙二醇甲醚(平均分子量5000，Aldrich公司生產)55g(約11mmol)、二甲基氨基吡啶(廣榮化學工業公司生產)1.46g(12mmol)以及二氯甲烷100mL，使其溶解。在此溶解液中加入膽酸(MikUni化學產業公司生產)4.08g(10mmol)，接著再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的鹽酸鹽(Aibaitsu公司生產)2.3g(12mmol)。在充氮條件下室溫攪拌12小時，再加入二氯乙烷50mL、水50mL進行提取。有機層用0.2mol/L的鹽酸50mL清洗，再用10％食鹽水50mL清洗二次。然后，分離得到的有機層中加入乙酸乙酯300mL，用10％食鹽水300mL清洗三次。有機層用硫酸鎂干燥，濾除干燥劑，濾液用旋轉式蒸發器濃縮。再用真空泵在80℃下減壓干燥2小時，得到白色蠟狀固體的化合物(IIIa-4)48.5g(收率90％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)0.69(s，3H)，0.90(s，3H)，0.98(d，J＝6.2Hz，3H)，0.98-2.43(m，27H)，3.45(s，3H)，3.56(bs，473H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)12.5，17.2，22.5，23.1，26.4，27.4，28.3，30.4，30.8，31.0，34.6，34.7，35.1，35.3，39.5，39.6，41.5，41.6，46.3，46.8，58.9，59.0，61.4，63.3，67.9，69.0，69.6，70.2，70.5，70.7，71.0，71.3，71.5，71.8，72.5，174.0.IR(KBr Disk，cm-1)2888，1734，1468，1343，1281，1112，963，842.GPC(平均分子量)Mw 5370(Mw/Mn1.04).
實施例45 脫氧膽酸酯[化合物(IIIa-5)]的合成燒瓶內加入聚乙二醇甲醚(平均分子量2000，Aldrich公司生產)22g(11mmol)、二甲基氨基吡啶(廣榮化學工業公司生產)1.34g(11mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入脫氧膽酸3.93g(10mmol)，接著再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的鹽酸鹽(Aibaitsu公司生產)2.3g(12mmol)。在充氮條件下室溫攪拌12小時，加入二氯乙烷50mL、水50mL進行提取。有機層用0.2mol/L的鹽酸50mL清洗，再用10％食鹽水50mL清洗二次。然后，分離得到的有機層中加入乙酸乙酯200mL，用10％食鹽水300mL清洗三次。有機層用硫酸鎂干燥，濾除干燥劑，濾液用旋轉式蒸發器濃縮。再用真空泵在80℃下減壓干燥2小時，得到白色蠟狀固體的化合物(IIIa-5)24.2g(收率99％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)0.68(s，3H)，0.91(s，3H)，0.98(d，J＝6.3Hz，3H)，0.98-2.45(m，28H)，3.38(s，3H)，3.47(bs，1H)，3.65(bs，178H)，3.80(bs，1H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)12.7，17.3，23.2，26.1，27.1，27.4，28.7，30.4，30.8，31.1，33.6，34.1，35.1，35.3，36.0，37.0，42.0，46.4，47.2，48.2，59.0，61.6，63.4，69.1，70.3，70.5，70.9，71.2，71.9，72.6，72.9，174.1.IR(KBr Disk，cm-1)2889，1735，1468，1343，1281，1112，963，842.GPC(平均分子量)Mw 2510(Mw/Mn1.08).
實施例46 熊脫氧膽酸酯[化合物(IIIa-6)]的合成燒瓶內加入聚乙二醇甲醚(平均分子量2000，Aldrich公司生產)22g(11mmol)、二甲基氨基吡啶(廣榮化學工業公司生產)1.34g(11mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入熊脫氧膽酸3.93g(10mmol)，接著再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的鹽酸鹽(Aibaitsu公司生產)2.3g(12mmol)。在充氮條件下室溫攪拌12小時，加入二氯乙烷50mL、水50mL進行提取。有機層用0.2mol/L的鹽酸50mL清洗，再用10％食鹽水50mL清洗二次。然后，分離得到的有機層中加入乙酸乙酯200mL，用10％食鹽水300mL清洗三次。有機層用硫酸鎂干燥，濾除干燥劑，濾液用旋轉式蒸發器濃縮。再用真空泵在80℃下減壓干燥2小時，得到白色蠟狀固體的化合物(IIIa-6)23.7g(收率99％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)0.68(s，3H)，0.92(d，J＝6.3Hz，3H)，0.95(s，3H)，0.96-2.45(m，28H)，3.38(s，3H)，3.65(bs，180H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)12.1，18.4，23.4，26.9，28.5，30.3，30.9，31.1，34.0，35.0，35.2，37.1，37.3，39.1，40.1，42.4，43.7，54.9，55.8，59.0，61.6，63.3，69.1，70.3，70.5，70.8，71.0，71.1，71.9，72.5，174.0.IR(KBr Disk，cm-1)2889，1736，1468，1343，1281，1112，963，842.GPC(平均分子量)Mw 2530(Mw/Mn1.08).
實施例47 鵝脫氧膽酸酯[化合物(IIIa-7)]的合成燒瓶內加入聚乙二醇甲醚(平均分子量2000，Aldrich公司生產)22g(11mmol)、二甲基氨基吡啶(廣榮化學工業公司生產)1.34g(11mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入鵝脫氧膽酸3.93g(10mmol)，接著再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的鹽酸鹽(Aibaitsu公司生產)2.3g(12mmol)。在充氮條件下室溫攪拌12小時，加入二氯乙烷50mL、水50mL進行提取。有機層用0.2mol/L的鹽酸50mL清洗，再用10％食鹽水50mL清洗二次。然后，分離得到的有機層中加入乙酸乙酯200mL，用10％食鹽水300mL清洗三次。有機層用硫酸鎂干燥，濾除干燥劑，濾液用旋轉式蒸發器濃縮。再用真空泵在80℃下減壓干燥2小時，得到白色蠟狀固體的化合物(IIIa-7)23.2g(收率97％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)0.66(s，3H)，0.91(s，3H)，0.92(d，J＝6.3Hz，3H)，0.92-2.43(m，28H)，3.38(s，3H)，3.64(bs，180H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)11.8，18.3，22.8，23.6，28.1，30.6，30.9，31.0，32.8，34.7，35.0，35.3，35.4，39.4，39.6，39.8，41.5，42.6，50.4，55.7，59.0，61.6，63.3，68.2，69.1，69.6，70.3，70.5，70.8，71.4，71.7，71.9，72.6，174.1.IR(KBr Disk，cm-1)2889，1736，1468，1343，1281，1111，963，842.GPC(平均分子量)Mw 2560(Mw/Mn1.09).
實施例48 石膽酸酯[化合物(IIIa-8)]的合成燒瓶內加入聚乙二醇甲醚(平均分子量2000，Aldrich公司生產)22g(11mmol)、二甲基氨基吡啶(廣榮化學工業公司生產)1.34g(11mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入石膽酸3.77g(10mmol)，接著再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的鹽酸鹽(Aibaitsu公司生產)2.3g(12mmol)。在充氮條件下室溫攪拌12小時，加入二氯乙烷50mL、水50mL進行提取。有機層用0.2mol/L的鹽酸50mL清洗，再用10％食鹽水50mL清洗二次。然后，分離得到的有機層中加入乙酸乙酯200mL，用10％食鹽水300mL清洗三次。有機層用硫酸鎂干燥，濾除干燥劑，濾液用旋轉式蒸發器濃縮。再用真空泵在80℃下減壓干燥2小時，得到白色蠟狀固體的化合物(IIIa-8)23.3g(收率98％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)0.64(s，3H)，0.91(d，J＝6.3Hz，3H)，0.92(s，3H)，0.92-2.41(m，29H)，3.38(s，3H)，3.64(bs，179H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)12.0，18.3，20.8，23.4，24.2，26.4，27.2，28.1，30.5，30.9，31.1，34.5，35.3，35.4，35.8，36.4，40.1，40.4，42.0，42.7，55.9，56.4，59.0，61.6，63.3，69.1，69.7，70.3，70.5，70.6，70.7，70.8，71.1，71.5，71.9，72.6，174.1.IR(KBr Disk，cm-1)2888，1736，1468，1343，1281，1111，963，842.GPC(平均分子量)Mw 2640(Mw/Mn1.06).
實施例49 兩末端膽酸酯[化合物(IIIb-1)]的合成燒瓶內加入聚乙二醇(第一工業制藥公司生產，PEG2000)10g(5mmol)、二甲基氨基吡啶(廣榮化學工業公司生產)2.68g(22mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入膽酸4.08g(10mmol)，接著再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的鹽酸鹽(Aibaitsu公司生產)4.6g(24mmol)。在充氮條件下室溫攪拌12小時，加入二氯乙烷50mL、水50mL進行提取。有機層用0.2mol/L的鹽酸50mL清洗，再用10％食鹽水50mL清洗二次。然后，分離得到的有機層中加入乙酸乙酯200mL，用10％食鹽水300mL清洗三次。有機層用硫酸鎂干燥，濾除干燥劑，濾液用旋轉式蒸發器濃縮。再用真空泵在80℃下減壓干燥2小時，得到白色蠟狀固體的化合物(IIIb-1)13.2g(收率94％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)0.68(s，6H)，0.90(s，6H)，0.99(d，J＝6.1Hz，6H)，0.92-2.67(m，54H)，3.65(bs，180H)，3.96(bs，2H)，4.22(bs，4H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)12.5，17.3，22.4，23.2，26.3，27.5，28.2，30.3，30.8，31.2，34.7，35.3，39.5，41.5，41.6，46.4，46.5，46.9，61.6，63.4，68.3，69.1，69.7，70.2，70.4，70.5，70.6，70.8，71.3，71.7，72.6，72.9，174.2.IR(KBr Disk，cm-1)2885，1734，1468，1345，1281，1113，964，842.GPC(平均分子量)Mw 2940(Mw/Mn1.05).
實施例50 膽酸酯[化合物(IIIa-9)]的合成燒瓶內加入聚乙二醇(第一工業制藥公司生產，PEG600)12g(20mmol)、二甲基氨基吡啶(廣榮化學工業公司生產)1.5g(12mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入膽酸4.08g(10mmol)，接著再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的鹽酸鹽(Aibaitsu公司生產)2.3g(12mmol)。在充氮條件下室溫攪拌12小時，加入二氯乙烷50mL、水50mL進行提取。有機層用0.2mol/L的鹽酸50mL清洗，再用10％食鹽水50mL清洗二次。然后，分離得到的有機層中加入乙酸乙酯200mL，用10％食鹽水300mL清洗三次。有機層用硫酸鎂干燥，濾除干燥劑，濾液用旋轉式蒸發器濃縮。再用真空泵在80℃下減壓干燥2小時，得到白色蠟狀固體的化合物(IIIa-9)7.7g(收率90％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)0.68(s，3H)，0.90(s，3H)，0.98(d，J＝6.1Hz，3H)，0.92-2.50(m，27H)，3.15(bs，1H)，3.44(bs，1H)，3.66(bs，54H)，3.84(bs，1H)，3.96(bs，1H)，4.23(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)12.5，17.3，22.5，23.2，26.3，27.5，28.2，30.3，30.8，31.2，34.7，34.8，35.3，35.4，39.5，41.5，46.4，47.0，61.5，63.4，68.3，69.1，69.7，70.2，70.5，71.8，72.6，73.0，174.3.IR(KBr Disk，cm-1)3404，2929，2868，1732，1453，1352，1251，1103，951.GPC(平均分子量)Mw 1050(Mw/Mn1.05).
實施例51 膽酰胺[化合物(IIIb-2)]的合成燒瓶內加入聚氧乙烯二胺(平均分子量2000，川研精細化工公司生產PEO胺#2000)10g(5mmol)、4-二甲基氨基吡啶(廣榮化學工業公司生產)2.56g(21mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入膽酸4.08g(10mmol)，接著再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的鹽酸鹽(Aibaitsu公司生產)4.6g(24mmol)。在充氮條件下室溫攪拌12小時，加入二氯乙烷50mL、水50mL進行提取。有機層用0.2mol/L的鹽酸50mL清洗，再用10％食鹽水50mL清洗二次。然后，分離得到的有機層中加入乙酸乙酯200mL，用10％食鹽水300mL清洗三次。有機層用硫酸鎂干燥，濾除干燥劑，濾液用旋轉式蒸發器濃縮。再用真空泵在80℃下減壓干燥2小時，得到白色蠟狀固體的化合物(IIIb-2)12.4g(收率88％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)0.68(s，6H)，0.89(s，6H)，0.99(d，J＝6.1Hz，6H)，1.12-2.28(m，48H)，2.72(bs，6H)，3.31(bs，2H)，3.34(bs，4H)，3.65(m，176H)，3.96(bs，4H)，4.22(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)12.5，17.4，22.5，23.3，26.3，27.6，28.1，29.1，30.3，31.7，33.2，34.8，35.4，37.5，39.4，41.5，46.3，46.5，68.3，69.7，70.1，70.2，70.5，70.8，71.7，73.0，174.1.IR(KBr Disk，cm-1)3442，2912，2871，1648，1456，1352，1251，1107，952.GPC(平均分子量)Mw 2990(Mw/Mn1.07).
實施例52 膽酰胺[化合物(IIIa-10)]的合成燒瓶內加入聚氧乙烯二胺(平均分子量1000，川研精細化工公司生產PEO胺#1000)15g(15mmol)、4-二甲基氨基吡啶(廣榮化學工業公司生產)1.46g(12mmol)以及二氯甲烷50mL，使其溶解。在此溶解液中加入膽酸4.08g(10mmol)，接著再加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺的鹽酸鹽(Aibaitsu公司生產)2.3g(12mmol)。在充氮條件下室溫攪拌12小時，加入二氯乙烷50mL、水50mL進行提取。分離得到的有機層用0.2mol/L的鹽酸50mL清洗，再用10％食鹽水50mL清洗二次。有機層用硫酸鎂干燥，濾除干燥劑，濾液用旋轉式蒸發器濃縮。再用真空泵在80℃下減壓干燥2小時，得到淡黃色粘稠狀液體的化合物(IIIa-10)11.9g(收率86％)。
1H-NMR(CDCl3，δPPm，400MHz)0.68(s，3H)，0.89(s，3H)，0.99(d，J＝7.7Hz，3H)，0.98-2.28(m，24H)，2.89(bs，3H)，3.29(bt，J＝6.0Hz，2H)，3.31(bt，J＝6.0Hz，2H)，3.53(bs，1H)，3.64(bs，84H)，3.83(bs，2H)，3.96(bs，2H)，4.22(s，2H)，7.28(bs，1H)，7.85(bs，2H).13C-NMR(CDCl3，δPPm，100MHz)12.5，17.3，17.4，22.4，23.3，26.3，26.5，27.6，28.1，29.1，30.3，31.7，33.1，34.7，34.8，35.4，37.3，39.2，39.5，41.6，46.3，46.5，68.2，69.3，69.4，69.6，70.0，70.1，70.2，70.3，70.4，，70.8，71.7，73.0，174.1.IR(KBr Neat，cm-1)3372，2867，1648，1464，1350，1298，1251，1110，950.GPC(平均分子量)Mw 1400(Mw/Mn1.06).
實施例53 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L·第二試劑HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO321 5.0kU/L
化合物(IIIa-1) 6.0g/L實施例54 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L化合物(IIIa-2) 0.15g/L·第二試劑HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO321 5.0kU/L實施例55 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/L·第二試劑HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO321 5.0kU/L化合物(IIIa-3) 1.5g/L
實施例56 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO3215.0kU/L化合物(IIIb-2)1.0g/L實施例57 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L化合物(IIIa-5)0.5g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO3215.0kU/L實施例58 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/LBSA 2.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過)0.2kU/LCOO3215.0kU/L化合物(IIIa-1)6.0g/L實施例59 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO3215.0kU/L化合物(IIIa-1)6.0g/L
實施例60 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO321 5.0kU/L化合物(IIIb-2) 1.0g/L實施例61 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/L化合物(IIIa-2) 0.15g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/L
COO321 5.0kU/L實施例62 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO321 5.0kU/L化合物(IIIa-3) 1.5g/L實施例63 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/LBSA 2.0g/L硫酸葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)
0.2kU/LCOO321 5.0kU/L化合物(IIIa-1) 6.0g/L實施例64 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/LBSA 2.0g/L硫酸葡聚糖鈉(分子量50萬)1.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0)10mmol/L4-氨基安替比林 0.3g/L過氧化物酶 20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO321 5.0kU/L化合物(IIIb-2) 1.0g/L實施例65 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5)10mmol/LEMSE0.3g/LBSA 2.0g/L硫酸葡聚糖鈉(分子量50萬)1.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0)10mmol/L
4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO3215.0kU/L化合物(IIIa-3)1.5g/L比較例9 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO3215.0kU/L比較例10 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/LBSA 2.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L
過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO3215.0kU/L比較例11 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/L硫酸葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO3215.0kU/L比較例12 HDL膽固醇檢測試劑盒配制由以下第一試劑以及第二試劑組成的HDL膽固醇檢測試劑盒。
·第一試劑HEPES(pH7.5) 10mmol/LEMSE 0.3g/LBSA 2.0g/L硫酸葡聚糖鈉(分子量50萬) 1.0g/L·第二試劑HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L
過氧化物酶20kU/L化學修飾LPL311(用VFM-4101修飾過的)0.2kU/LCOO3215.0kU/L實施例66 HDL膽固醇的測定用實施例53的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的膽固醇。
實施例67 HDL膽固醇的測定用實施例54的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。
實施例68 HDL膽固醇的測定用實施例55的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。
實施例69 HDL膽固醇的測定用實施例56的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。
實施例70 HDL膽固醇的測定用實施例57的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。
實施例71 HDL膽固醇的測定用實施例58的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。
實施例72 HDL膽固醇的測定用實施例59的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。
實施例73 HDL膽固醇的測定用實施例60的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。
實施例74 HDL膽固醇的測定用實施例61的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。
實施例75 HDL膽固醇的測定用實施例62的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。
實施例76 HDL膽固醇的測定用實施例63的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。
實施例77 HDL膽固醇的測定用實施例64的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。
實施例78 HDL膽固醇的測定用實施例65的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。
比較例13 HDL膽固醇的測定用比較例9的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。
比較例14 HDL膽固醇的測定用比較例10的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。
比較例15 HDL膽固醇的測定用比較例11的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。
比較例16 HDL膽固醇的測定用比較例12的試劑盒代替實施例1的試劑盒，其他操作均與實施例21的檢測方法相同，通過日立7170型自動分析裝置測定人體血清的35個樣本中的HDL膽固醇。另外，對實施例66～78以及比較例13～16的檢測時所用的人體血清的35個樣本，用DCM法測定這些樣本中的HDL膽固醇，比較各種檢測方法。實施例66～78以及比較例13～16的各種測定方法與基于DCM法的測定方法的相關系數如表2所示。
表2

由實施例66～70和比較例13可知，如果膽汁酸衍生物使用的是膽汁酸酯類或膽汁酸胺類，則結果與DCM法的測定具有良好的相關性。由實施例71和比較例14、實施例72～75和比較例15、實施例76～78和比較例16的結果比較可知，即使是在加入BSA或硫酸葡聚糖、或是兩者都加的條件下，如果用膽汁酸酯類或膽汁酸胺類作為膽汁酸衍生物，則結果與DCM法的測定也還是具有良好的相關性。
實驗例1各種膽汁酸衍生物(陰離子性表面活性劑、兩性表面活性劑、非離子性表面活性劑)給膽固醇檢測酶的穩定性帶來的影響配制下列組合1～8形成的試劑作為HDL膽固醇檢測試劑盒的第二試劑，分別在40℃下保存48小時(2天)、120小時(5天)。對剛配制不久的組合1～8形成的各試劑、在40℃下保存2天后的各試劑以及在40℃下保存5天后的各試劑分別測定其中的膽固醇酯水解酶(LPL311)以及膽固醇氧化酶(COO321)的酶活性，求出保存后的各試劑中酶活性相對于剛配制不久的各試劑中酶活性的比率(酶活性殘存率)(％)。
酶活性用以下方法求得。
(1)膽固醇酯水解酶活性測定法檢測試劑0.15mol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.2)TRITON X-100 2g/L苯酚 0.15g/L過氧化物酶 20kU/L膽固醇氧化酶 5kU/L4-氨基安替比林 0.2g/L檢測底物溶液膽固醇亞油酸酯異丙醇溶液(6g/L)操作方法在石英池中加入檢測試劑3mL，分別加入剛配制不久的由組合1～8形成的各試劑0.05mL。在37℃下孵育5分鐘后，反應液中加入檢測底物溶液0.1mL，再在37℃下孵育。分別測定加入檢測底物溶液5分鐘后以及6分鐘后的反應液在500nm下的吸光度，通過這兩個吸光度，計算出組合1～8形成的各試劑在500nm下每一分鐘的吸光度變化量(ΔAbs/min)。另外，用蒸餾水代替組合1～8形成的各試劑，再進行同樣的測定，計算出蒸餾水在500nm下每一分鐘的吸光度變化量(ΔAbs/min)。組合1～8形成的各試劑在500nm下每一分鐘的吸光度變化量(ΔAbs/min)減去蒸餾水在500nm下每一分鐘的吸光度變化量(ΔAbs/min)，計算出的值(ΔAbs/min)作為膽固醇酯水解酶穩定性的指標。
用在40℃下保存2天后的組合1～8形成的各試劑以及在40℃下保存5天后的組合1～8形成的各試劑代替剛配制不久的組合1～8形成的各試劑，通過同樣的一系列的操作進行測定，計算出各試劑的吸光度變化量(ΔAbs/min)。
(2)膽固醇氧化酶活性測定法檢測試劑0.15mol/磷酸鉀緩沖液(pH7.2)Triton X-100 2g/L苯酚 0.15g/L過氧化物酶20kU/L4-氨基安替比林0.2g/L檢測底物溶液膽固醇異丙醇溶液(5g/L)操作方法在石英池中加入檢測試劑3mL，分別加入剛配制不久由組合1～8形成的各試劑用蒸餾水稀釋6倍后的溶液0.05mL，在37℃下孵育5分鐘后，反應液中加入檢測底物溶液0.1mL，再在37℃下孵育。分別測定加入檢測底物溶液5分鐘后以及6分鐘后的反應液在500nm下的吸光度，通過這兩個吸光度，計算出成分1～8組成的各試劑在500nm下每一分鐘的吸光度變化量(ΔAbs/min)。另外，用蒸餾水代替組合1～8形成的各試劑，再進行同樣的測定，計算出蒸餾水在500nm下每一分鐘的吸光度變化量(ΔAbs/min)。組合1～8形成的各試劑在500nm下每一分鐘的吸光度變化量(ΔAbs/min)減去蒸餾水在500nm下每一分鐘的吸光度變化量(ΔAbs/min)，計算出的值(ΔΔAbs/min)作為膽固醇氧化酶穩定性的指標。
用在40℃下保存2天后的組合1～8形成的各試劑以及在40℃下保存5天后的組合1～8形成的各試劑代替剛配制不久的組合1～8形成的各試劑，通過同樣的一系列的操作進行測定，計算出各試劑的吸光度變化量(ΔAbs/min)。
組合1HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L
過氧化物酶20kU/L二水氯化鈣0.1g/L化學修飾LPL311(用VFM4101修飾過的) 0.2kU/L組合2HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L二水氯化鈣0.1g/L化學修飾LPL311(用VFM4101修飾過的) 0.2kU/L膽酸鈉6.0g/L組合3HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L二水氯化鈣0.1g/L化學修飾LPL311(用VFM4101修飾過的) 0.2kU/LCHAPS 6.0g/L組合4HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L二水氯化鈣0.1g/L化學修飾LPL311(用VFM4101修飾過的) 0.2kU/LBIGCHAP 4.5g/L組合5HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L二水氯化鈣0.1g/L
化學修飾LPL311(用VFM4101修飾過的) 0.2kU/L化合物(IIIa-1)6.0g/L組合6HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L二水氯化鈣0.1g/L化學修飾LPL311(用VFM4101修飾過的) 0.2kU/L化合物(IIIa-2)0.45g/L組合7HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L二水氯化鈣0.1g/L化學修飾LPL311(用VFM4101修飾過的) 0.2kU/L化合物(IIIa-3)4.5g/L組合8HEPES(pH7.0) 10mmol/L4-氨基安替比林0.3g/L過氧化物酶20kU/L二水氯化鈣0.1g/L化學修飾LPL311(用VFM4101修飾過的) 0.2kU/L化合物(IIIb-2)1.0g/L檢測結果如表3所示。
表3

由表3可知，與含有陰離子性膽汁酸衍生物(具體來說有膽酸)以及兩性膽汁酸衍生物(具體來說有CHAPS)作為膽汁酸衍生物的試劑相比，含有非離子性膽汁酸衍生物[具體來說有BIGCHAP、化合物(IIIa-1)、化合物(IIIa-2)、化合物(IIIa-3)以及化合物(IIIb-2)]-2)]的試劑中的膽固醇檢測酶(具體來說有LPL311以及COO321)的穩定性更好。一般情況下，酶類在40℃等溫度的高溫下的保存穩定性可以反映出其在4℃或室溫等溫度下的保存穩定性。由此可見，本發明的高密度脂蛋白中膽固醇的檢測方法以及檢測試劑或試劑盒中，用具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物作為其中的膽汁酸衍生物的情況下，即使是經過長期保存的試劑，或是保存的環境溫度有可能達到40℃的試劑，也可以更加準確地測定高密度脂蛋白中的膽固醇。
工業實用性本發明可以提供能夠簡便準確地檢測樣本中高密度脂蛋白中的膽固醇的方法以及此方法所用的試劑，而且提供即使經過長期保存也可以保持酶活性穩定的用于檢測高密度脂蛋白中膽固醇的試劑以及試劑盒。
權利要求
1.高密度脂蛋白中膽固醇的檢測方法，其特征在于檢測樣本與膽固醇酯水解酶及膽固醇氧化酶，或是與膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶及膽固醇脫氫酶，在含有膽汁酸衍生物的水性介質中反應，測定生成的過氧化氫或還原性輔酶。
2.如權利要求1記載的方法，其中水性介質還含有白蛋白。
3.如權利要求1或2記載的方法，其中膽固醇酯水解酶是經過化學修飾的膽固醇酯水解酶。
4.如權利要求3記載的方法，其中經過化學修飾的膽固醇酯水解酶表示膽固醇酯水解酶經過選自以聚乙二醇為主要成分的基團、以聚丙二醇為主要成分的基團、含有聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物的基團、含有水溶性多糖類的基團、磺基丙基、磺基丁基、聚氨酯基以及具有螯合作用的基團中的基團的修飾。
5.如權利要求3記載的方法，其中經過化學修飾的膽固醇酯水解酶表示膽固醇酯水解酶經過以聚乙二醇為主要成分的基團的修飾。
6.如權利要求1～5任何一項記載的方法，其中膽汁酸衍生物表示具有陰離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
7.如權利要求6記載的方法，其中具有陰離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物是指選自膽酸或其鹽、牛磺膽酸或其鹽、甘氨膽酸或其鹽、石膽酸或其鹽、脫氧膽酸或其鹽、鵝脫氧膽酸或其鹽、熊脫氧膽酸或其鹽、7-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代鵝脫氧膽酸或其鹽、7-氧代脫氧膽酸或其鹽、豬膽酸或其鹽、豬脫氧膽酸或其鹽以及脫氫膽酸或其鹽中的膽汁酸衍生物。
8.如權利要求1～5任何一項記載的方法，其中膽汁酸衍生物是具有兩性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
9.如權利要求8記載的方法，其中具有兩性表面活性作用的膽汁酸衍生物是指用下列通式(I)R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3-(I)[式中，R1表示3-(3-膽胺丙基)二甲銨基，R2表示氫原子或羥基]表示的化合物。
10.如權利要求1～5任何一項記載的方法，其中膽汁酸衍生物是具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
11.如權利要求10記載的方法，其中具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物是如下列通式(II)所示的化合物 (X表示氫原子或羥基，R3和R4可以相同也可以不同，表示取代或未取代烷基、取代或未取代烷酰基)；或者表示如下列通式(III)所示的化合物 {式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV)所示的取代基 [式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之間的整數}。
12.高密度脂蛋白中膽固醇的檢測試劑，其特征是含有膽固醇酯水解酶、膽固醇氧化酶、膽汁酸衍生物以及過氧化氫檢測試劑。
13.高密度脂蛋白中膽固醇的檢測試劑，其特征是含有膽固醇酯水解酶、膽固醇脫氫酶、膽汁酸衍生物以及氧化型輔酶。
14.如權利要求13記載的試劑，其中還含有還原型輔酶檢測試劑
15.如權利要求12～14中任何一項記載的試劑，其中還含有白蛋白。
16.如權利要求12～15中任何一項記載的試劑，其中膽固醇酯水解酶是經過化學修飾的膽固醇酯水解酶。
17.如權利要求16記載的試劑，其中經過化學修飾的膽固醇酯水解酶是經過選自以聚乙二醇為主要成分的基團、以聚丙二醇為主要成分的基團、含有聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物的基團、含有水溶性多糖類的基團、磺基丙基、磺基丁基、聚氨酯基以及具有螯合作用的基團中的基團修飾的膽固醇酯水解酶。
18.如權利要求16記載的試劑，其中經過化學修飾的膽固醇酯水解酶是經過以聚乙二醇為主要成分的基團修飾的膽固醇酯水解酶。
19.如權利要求12～18中任何一項記載的試劑，其中膽汁酸衍生物是具有陰離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
20.如權利要求19記載的試劑，其中具有陰離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物是膽酸或其鹽、牛磺膽酸或其鹽、甘氨膽酸或其鹽、石膽酸或其鹽、脫氧膽酸或其鹽、鵝脫氧膽酸或其鹽、熊脫氧膽酸或其鹽、7-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代鵝脫氧膽酸或其鹽、7-氧代脫氧膽酸或其鹽、豬膽酸或其鹽、豬脫氧膽酸或其鹽以及脫氫膽酸或其鹽中的任何膽汁酸衍生物。
22.如權利要求21記載的試劑，其中具有兩性表面活性作用的膽汁酸衍生物是指如下列通式(I)表示的化合物R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3-(I)[式中，R1表示3-(3-膽胺丙基)二甲銨基，R2表示氫原子或羥基]。
23.如權利要求12～18中任何一項記載的試劑，其中膽汁酸衍生物是具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
24.如權利要求23記載的試劑，其中具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物是如下列通式(II)所示的化合物 (X表示氫原子或羥基，R3和R4可以相同也可以不同，表示取代或未取代烷基、取代或未取代烷酰基)；或者表示如下列通式(III)所示的化合物 {式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV) [式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，m表示0或1]所示的取代基，n表示3～400之間的整數}。
25.高密度脂蛋白中膽固醇的檢測試劑盒，其特征是包括含有膽固醇酯水解酶的第一試劑以及含有膽固醇氧化酶的第二試劑，第一和第二試劑中的任何之一或二者中含有膽汁酸衍生物和過氧化氫檢測試劑。
26.高密度脂蛋白中膽固醇的檢測試劑盒，其特征是包括含有膽汁酸衍生物的第一試劑以及含有膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的第二試劑，第一和第二試劑中的任何之一或二者中含有過氧化氫檢測試劑。
27.高密度脂蛋白中膽固醇的檢測試劑盒，其特征是包括含有過氧化氫檢測試劑的第一試劑以及含有膽固醇酯水解酶和膽固醇氧化酶的第二試劑，第一和第二試劑中的任何之一或二者中含有膽汁酸衍生物。
28.高密度脂蛋白中膽固醇的檢測試劑盒，其特征是包括含有膽固醇酯水解酶的第一試劑以及含有膽固醇脫氫酶的第二試劑，第一和第二試劑中的任何之一或二者中含有膽汁酸衍生物以及氧化型輔酶。
29.高密度脂蛋白中膽固醇的檢測試劑盒，其特征是包括含有膽汁酸衍生物的第一試劑以及含有膽固醇酯水解酶和膽固醇脫氫酶的第二試劑，第一和第二試劑中的任何之一或二者中含有氧化型輔酶。
30.如權利要求28或29記載的試劑盒，其中第一和第二試劑中的任何之一或二者中還含有還原型輔酶檢測試劑。
31.如權利要求25～30中任何一項記載的試劑盒，其中第一和第二試劑中的任何之一或二者中還含有白蛋白。
32.如權利要求25～31中任何一項記載的試劑盒，其中膽固醇酯水解酶是經過化學修飾的膽固醇酯水解酶。
33.如權利要求32記載的試劑盒，其中經過化學修飾的膽固醇酯水解酶是指經過選自以聚乙二醇為主要成分的基團、以聚丙二醇為主要成分的基團、含有聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物的基團、含有水溶性多糖類的基團、磺基丙基、磺基丁基、聚氨酯基以及具有螯合作用的基團中的基團修飾的膽固醇酯水解酶。
34.如權利要求32記載的試劑盒，其中經過化學修飾的膽固醇酯水解酶是指經過以聚乙二醇為主要成分的基團修飾的膽固醇酯水解酶。
35.如權利要求25～34中任何一項記載的試劑盒，其中膽汁酸衍生物是具有陰離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
36.如權利要求35記載的試劑，其中具有陰離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物表示膽酸或其鹽、牛磺膽酸或其鹽、甘氨膽酸或其鹽、石膽酸或其鹽、脫氧膽酸或其鹽、鵝脫氧膽酸或其鹽、熊脫氧膽酸或其鹽、7-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代石膽酸或其鹽、12-氧代鵝脫氧膽酸或其鹽、7-氧代脫氧膽酸或其鹽、豬膽酸或其鹽、豬脫氧膽酸或其鹽以及脫氫膽酸或其鹽中的膽汁酸衍生物。
37.如權利要求25～34中任何一項記載的試劑盒，其中膽汁酸衍生物是具有兩性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
38.如權利要求37記載的試劑盒，其中具有兩性表面活性作用的膽汁酸衍生物是指如下列通式(I)表示的化合物R1-CH2-CH(R2)-CH2-SO3-(I)[式中，R1表示3-(3-膽胺丙基)二甲銨基，R2表示氫原子或羥基]。
39.如權利要求25～34中任何一項記載的試劑盒，其中膽汁酸衍生物是具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物。
40.如權利要求39記載的試劑盒，其中具有非離子性表面活性作用的膽汁酸衍生物是如下列通式(II)所示的化合物 (X表示氫原子或羥基，R3和R4可以相同也可以不同，表示取代或未取代烷基、取代或未取代烷酰基)；或者表示如下列通式(III)所示的化合物 {式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV)所示的取代基 [式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之間的整數}。
41.如下列通式(III)所示的化合物 {式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或表示如下列通式(IV)所示的取代基 [式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之間的整數}。
42.通式(III)所示的化合物的制備方法 {式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，Q表示氧原子或NH，W表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基、取代或未取代氨基烷基，或如下列通式(IV)所示的取代基 [式中，X’、Y’和Z’可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，m表示0或1]，n表示3～400之間的整數}，是使如通式(V)表示的化合物 [式中，X、Y和Z可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或氧代(＝O)基，]與如通式(VI)表示的化合物 (式中，W’表示氫原子、烷基、烯基、炔基、環烷基、環烯基、烷酰基、烯酰基、炔酰基、取代或未取代芳基，n表示3～400之間的整數)，或是如通式(VII)表示的化合物，在縮合劑存在下反應 (式中，T表示取代或未取代氨基烷基，n表示3～400之間的整數)。
全文摘要
高密度脂蛋白中膽固醇的檢測方法以及此方法所用的試劑，其特征在于檢測樣本與膽固醇酯水解酶以及膽固醇氧化酶，或與膽固醇酯水解酶、氧化型輔酶以及膽固醇脫氫酶，在含有膽汁酸衍生物的水性介質中反應，然后測定生成的過氧化氫或還原型輔酶。
文檔編號C07J1/00GK1694964SQ20038010077
公開日2005年11月9日 申請日期2003年10月16日 優先權日2002年10月16日
發明者片山有基, 藤中真由美, 森山聰, 村田繁 申請人:協和梅迪克斯株式會社