一種溫度控制啟動表達纖維素外切酶的黑曲霉基因工程菌的構建的制作方法
【專利說明】一種溫度控制啟動表達纖維素外切酶的黑曲霉基因工程菌的構建
[0001]
技術領域
[0002]本發明發明屬于酶工程領域，具體涉及一種溫度控制啟動表達纖維素外切酶的黑曲霉基因工程菌及其構建方法。
【背景技術】
[0003]纖維素是地球上最豐富的可再生資源，地球上每年因光合作用產生的纖維素達到100億噸左右，利用纖維素生產生物能源是緩解能源危機、實現人類可持續發展的關鍵。
[0004]纖維素利用的關鍵是把纖維素降解為可發酵性的糖類-葡萄糖。纖維素的降解需要外切酶、內切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中，外切酶降解纖維素的晶體結構，是纖維素酶降解纖維素的限速步驟，內切酶降解長片段的纖維素成為二聚體，是纖維素降解的關鍵步驟。用纖維素酶降解纖維素具有綠色、條件溫和、轉化率高的特點，但是纖維素較高的生產成本成為纖維素酶降解纖維素的瓶頸。
[0005]獲得高產纖維素酶的菌株，降低纖維素酶的生產成本成為纖維素酶工業化利用的必由之路。纖維素酶的生產菌株主要有黑曲霉。黑曲霉由于其較高的安全性，被認為是生產纖維素酶最有應用前景的菌株之一。黑曲霉生產的纖維素酶由纖維素內切酶、葡糖苷酶和外切酶組成。其中外切酶破壞纖維素晶體結構，把晶體纖維素降解為可溶性的纖維素片段，該過程是纖維素降解的限速步驟。纖維素的高效降解需要大量的纖維素外切酶。然而，黑曲霉生產的纖維素酶中，葡糖苷酶的活性比外切酶的活性和內切酶的活性高的多。由于黑曲霉產生的纖維素外切酶活性的不足，致使黑曲霉產生的纖維素酶對天然纖維素的降解效率非常低。因此增加纖維素外切酶的活性，成為提高黑曲霉纖維素酶降解效率的重要措施。
[0006]現有的增加黑曲霉纖維素酶的方法有和高外切酶活性的纖維素酶混合或黑曲霉菌株與里氏木霉混菌發酵。與高外切酶活性纖維素酶的混合，本身就增加了混合這一道工藝，增加了降解成本。而且高外切酶活性的纖維素酶成本也較高。混菌發酵由于里氏木霉產生毒素，大大限制了纖維素酶的使用范圍。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種溫度控制啟動表達纖維素外切酶的黑曲霉基因工程菌。本發明的目的還在于提供該菌株的構建方法。
[0008]本發明的目的通過下述技術方案實現:
一種溫度控制啟動表達纖維素外切酶的黑曲霉基因工程菌，為在熱激蛋白基因的位置整合有纖維素外切酶基因的黑曲霉菌株。所述的纖維素外切酶基因優選來源于里氏木霉。
[0009]上述溫度控制啟動表達纖維素外切酶的黑曲霉基因工程菌的構建方法包括如下步驟:
(I)合成黑曲霉熱激蛋白基因的前段序列-纖維素外切酶基因序列-黑曲霉熱激蛋白基因的后段序列的同源重組片段，該同源重組片段兩端含有限制性內切酶酶切位點；將該重組片段連接到pWMl質粒上得到同源重組質粒。
[0010](2)用同源重組質粒轉化農桿菌。
[0011](3)通過農桿菌介導轉化得到目的菌株。
[0012]優選的，步驟(I)為:合成核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示的同源重組片段，用Sall酶切；將？麗1質粒也用SaR酶切；將酶切后的重組片段和質粒通過DNA連接酶連接，并轉化DH5ci得到同源重組質粒。
[0013]一種構建纖維素酶高產黑曲霉菌株的方法為通過同源重組和基因工程技術將纖維素外切酶基因整合到黑曲霉熱激蛋白基因的位置。
[0014]本發明利用黑曲霉的熱激蛋白基因的前段序列和后段序列把里氏木霉的纖維素外切酶基因整合到熱激蛋白基因的位置，從而實現了纖維素外切酶的熱激表達，使黑曲霉的纖維素酶的酶系組成更合理，提高纖維素酶的催化能力。本發明構建的菌株在熱激活后，發酵產生的纖維素酶的活性從出發菌株的5.6U/g增加到6.90U/g，構建的菌株沒有熱激的酶活是6.10 U/g。
[0015]本發明通過構溫度控制啟動表達纖維素外切酶的菌株，在纖維素酶降解纖維素的過程中，黑曲霉產生的外切酶活性逐漸降低，大大降低了纖維素酶的降解效率，通過升高溫度，單獨激活纖維素外切酶的表達，從而優化纖維素酶的酶系組成，提高纖維素酶的降解效率。本發明的黑曲霉能夠內表達纖維素外切酶活性的蛋白，為纖維素酶的高產菌株，該菌株不產生毒素，安全性好，而且酶活性比例更適合降解纖維素，更適合工業化應用。
【具體實施方式】
[0016]以下實施例用于進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制，在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換均屬于本發明的范圍。若為特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0017]實施例1
A、同源重組質粒的構建
(I)材料:黑曲霉fliger)、大腸桿菌(萬.coliΛΗ5 α、農桿菌ΕΗΑ105和質粒P麗I均為商業化產品。其中，黑曲霉從ATCC購買，菌株編號ATCC10582 ;農桿菌ΕΗΑ105和質粒pMWl從B1vector公司購買。
[0018](2)同源重組片段的合成及酶切
人工合成由黑曲霉熱激蛋白基因的前段同源片段(起始密碼子ATG被修改為非起始密碼子以確保從纖維素外切酶基因的起始密碼子表達，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示)、里氏木霉纖維素外切酶基因片段(核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示)、黑曲霉熱激蛋白基因的后段同源片段(核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示)組成的同源重組片段(核苷酸序列如SEQID N0.1所示)，該同源重組片段兩端含有Sal\酶切位點。
[0019]往10yL該同源重組片段中加入fe7I酶液2μ L (TakaRa購買)，30°C酶切16h，酶切后65°C水浴1min。
[0020](3) P麗I質粒的提取及酶切
含有pWMl質粒的大腸桿菌E.coli DH5 α于37°C振蕩培養12h。取1.5mL菌體于EP管，以4000rpm離心3min,棄上清液。加0.1mL溶液I (1%葡萄糖，50mM EDTA pH8.0, 25mMTris-HCl pH8.0)充分混合。加入0.2 mL溶液11(0.2mM NaOH, 1% SDS)，輕輕翻轉混勻，置于冰浴5min。加入0.15mL預冷溶液III(5mol/L KAc,pH4.8),輕輕翻轉混勻，冰浴5min。以1000rpm離心20min，取上清液于另一新EP管。加入等體積的異戊醇，混勻后靜置lOmin。再以1000rpm離心20min,棄上清。用70%乙醇0.5mL洗漆一次,抽干所有液體。待沉淀干燥后，溶于0.05mL TE緩沖液中。
[0021]提取的pWMl質粒50 μ L加入SaR酶液2 μ L (TakaRa購買)，30°C酶切16h，酶切后 65°C水浴 1min。
[0022](4)連接
酶切的同源重組片段ΙΟΟμ L和酶切的pWMl質粒20μ L用5μ L Τ4 DNA IigaseCTakaRa購買)16°C連接24h。
[0023]B、大腸桿菌感受態細胞的制備
(I)將E.co7i DH5a置于LB培養基上，在37°C下過夜培養。
[0024](2)高溫滅菌大的離心瓶(250_500mL)以備第二天搖瓶用。
[0025](3)準備幾瓶滅菌水(總量約1.5升)，保存于冷凍室中以備第二天重懸浮細胞用。
[0026](4)轉移0.2-lmL過夜培養物至裝有20mL LB(或其他營養豐富的培養基)的10mL搖瓶。
[0027](5) 37°C下劇烈振蕩培養6小時。
[0028](6)監控培養液0D_值(培養I小時后每半小時測定一次)。
[0029](7)當OD6tltl值達到0.5-1.0時，從搖床中取出搖瓶，置于冰上冷卻15分鐘。
[0030](8)細胞在4°C 5000g下離心15分鐘，棄上清液。
[0031](9)用滅菌的冰水重懸浮細胞。先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞于少量體積中(幾毫升)，然后加水稀釋至離心管的2/3體積。