一種抗蛇毒血清的制取工藝的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物醫藥領域，特別是涉及一種抗蛇毒血清的制取工藝。
【背景技術】
[0002]抗蛇毒血清含有特異性抗體，具有中和相應蛇毒的作用，用于蛇咬傷者的治療，世界上每年有500萬人被毒蛇咬傷，有5萬人因為沒有及時注射蛇毒血清死于非命。提取微量蛇毒，少量液體蛇毒(不足以致命的量)注入某動物體內(如馬，牛等)，一段時期之后，動物體內將會產生大量的抗蛇毒血清，然后將抗蛇毒血清從動物血液中提取出來，經過加工以后就是抗蛇毒血清了，但這種方法獲得的抗蛇毒血清數量有限，而且純度較低，而采用細胞培養的方法，專門培養能夠產生抗蛇毒血清的B細胞，不但能夠獲得大量抗蛇毒血清，而且血清的純度高，治療效果明顯，被毒蛇咬傷后，及時注射抗蛇毒血清，能夠特異性進行解毒，從而達到治療效果，申請號為CN202020279274.0公開了一種中國陸生常見蝰科蛇毒多價抗血清的制備方法及用法，涉及多價抗血清的制備及用法。本發明選擇達到一定效價水平的幾種蝰科毒蛇的特異性單價抗蛇毒血清F(ab) ’ 2，裝量成20ml/瓶注射劑，經小鼠中和法檢測該血清能有效中和我國常見五種蝰科毒蛇的平均一次排毒量，包括尖吻蝮蛇毒80-220mg、或蝰蛇毒30-55mg或烙鐵頭蛇毒55_75mg或竹葉青蛇毒20_35mg或蝮蛇毒
20-35mg，可直接應用于蛇傷重危患者，不需鑒定咬傷蛇種類，降低蝰科毒蛇傷致殘率和死亡率，但是蛇毒本身較為稀有，直接采用蛇毒制得的抗蛇毒血清，血清量少，成本高，不能批量化生產，而且該抗蛇毒血清沒有明顯的標記基因一一熒光蛋白基因，不便于醫學診斷的進行。

【發明內容】

[0003]為克服現有技術上的不足，本發明目的是提供一種抗蛇毒血清的制取工藝。
[0004]為實現本發明的目的，本發明的技術方案如下:
[0005]一種抗蛇毒血清的制取工藝，其工藝步驟如下:
[0006](I)動物的選擇與免疫:選用BALA/C純種小白鼠，初次免疫蛇毒2?50 μ g加佐劑脾內注射0.8?2ml ；3周后，第二次免疫劑量同上，加佐劑腹腔內注射，其劑量不宜超過0.5ml ；3周后，第三次免疫劑量同一，不加佐劑腹腔內注射，5?7天后采血測其效價；2?3周，加強免疫，蛇毒量50?500 μ g為宜，靜脈內注射；3天后，取細胞融合；
[0007](2)制備免疫細胞:最后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死，無菌取脾臟，培養液洗一次，脾臟研碎，過細胞篩，離心，細胞用培養液洗3次，制得脾淋巴細胞懸液，備用；
[0008](3)基因重組:運用DNA重組技術，將熒光蛋白基因重組到免疫細胞分泌抗蛇毒血清的基因序列中，得到重組細胞，純化培養，取20-8重組細胞懸液備用；
[0009](4)制備骨髓細胞:從BALA/C純種小白鼠體內提取骨髓細胞，體外培養，取對數生長骨髓細胞離心，用無血清培養液洗3次，計數，取得20-7細胞備用；
[0010](5)細胞融合:將骨髓細胞與重組細胞按2:20的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗2次，離心之后棄上清液，使細胞沉淀略松動，90s內加入37°C預溫的2ml 45%乙二醇溶液，邊加邊輕微搖動，37°C水浴作用90s，而后加37°C預溫的不完全培養液以終止PEG作用，離心之后棄上清液，得到雜交細胞；
[0011](6)選擇培養:將制取的雜交細胞用含20%小牛血清HAT選擇培養液培養，雜交細胞布滿孔底2/20面積時，開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的目標細胞；
[0012](7)后期培養:將上述目標細胞，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加200 μ I，將培養板置37°C、5% C02培養箱中培養；
[0013]在一個優選實例中，所述步驟(I)中，所述佐劑為福氏完全佐劑。
[0014]在一個優選實例中，所述步驟(5)中，所述融合過程加入飼養細胞。
[0015]在一個優選實例中，所述步驟(7)中，所述96孔板數量為4塊。
[0016]有益效果:本發明通過動物的選擇與免疫、制備免疫細胞、基因重組、制備骨髓細胞、細胞融合、選擇培養和后期培養七大步驟完成抗蛇毒血清的制取工藝，具有的熒光蛋白基因，醫學用于診斷時，過程中有熒光出現，則反應為陽性，便于診斷的進行，本發明的細胞生長繁殖快，制取周期短，雜交融合率高，適于推廣應用，選用BALA/C純種小白鼠，易于飼養，同種細胞具有很高的雜交融合率，抗體細胞產生過程中，加入的佐劑，使抗蛇毒血清產生容易，縮短了制取時間，同時在細胞融合過程中加入的飼養細胞使細胞生產繁殖更快，大大縮短了抗蛇毒血清的制取周期，熒光蛋白基因提取技術成熟，DNA重組技術完善，因此本發明的抗蛇毒血清生產適于推廣應用。
【具體實施方式】
[0017]為使本發明實現的技術手段、創作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面結合【具體實施方式】，進一步闡述本發明。
[0018]本實施例的一種抗蛇毒血清的制取工藝，其工藝步驟如下:
[0019](I)動物的選擇與免疫:選用BALA/C純種小白鼠，初次免疫蛇毒35 μ g加佐劑脾內注射1.4ml ;3周后，第二次免疫劑量同上，加佐劑腹腔內注射，其劑量不宜超過0.5ml ；3周后，第三次免疫劑量同一，不加佐劑腹腔內注射，5天后采血測其效價；2周，加強免疫，蛇毒量350 y g為宜，靜脈內注射；3天后，取細胞融合；
[0020](2)制備免疫細胞:最后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死，無菌取脾臟，培養液洗一次，脾臟研碎，過細胞篩，離心，細胞用培養液洗3次，制得脾淋巴細胞懸液，備用；
[0021](3)基因重組:運用DNA重組技術，將熒光蛋白基因重組到免疫細胞分泌抗體的基因序列中，得到重組細胞，純化培養，取14重組細胞懸液備用；
[0022](4)制備骨髓細胞:從BALA/C純種小白鼠體內提取骨髓細胞，體外培養，取對數生長骨髓細胞離心，用無血清培養液洗3次，計數，取得14細胞備用；
[0023](5)細胞融合:將骨髓細胞與重組細胞按2:20的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗2次，離心之后棄上清液，使細胞沉淀略松動，90s內加入37°C預溫的2ml 45%乙二醇溶液，邊加邊輕微搖動，37°C水浴作用90s，而后加37°C預溫的不完全培養液以終止PEG作用，離心之后棄上清液，得到雜交細胞；
[0024](6)選擇培養:將制取的雜交細胞用含20%小牛血清HAT選擇培養液培養，雜交細胞布滿孔底2/20面積時，開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的目標細胞；
[0025](7)后期培養:將上述目標細胞，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加200 μ I，將培養板置37°C、5% C02培養箱中培養；
[0026]在一個優選實例中，所述步驟(I)中，所述佐劑為福氏完全佐劑。
[0027]在一個優選實例中，所述步驟(5)中，所述融合過程加入飼養細胞。
[0028]在一個優選實例中，所述步驟(7)中，所述96孔板數量為4塊。
[0029]實施例2:其余與所述實施例1相同，不同之處在于，步驟(2)中添加的佐劑為福氏不完全佐劑，本實施例中，成本較低，但是作用效果相對較低。
[0030]實施例3:其余與所述實施例1相同，不同之處在于，步驟(5)將骨髓細胞與重組細胞數量比例該為2: 5，本實施例中，重組細胞用量少，制取成本降低，且時間縮短，但融合效率變低。
[0031]經實際應用中可知，通過動物的選擇與免疫、制備免疫細胞、基因重組、制備骨髓細胞、細胞融合、選擇培養和后期培養七大步驟完成抗蛇毒血清的制取工藝，具有的熒光蛋白基因，醫學用于診斷時，過程中有熒光出現，則反應為陽性，便于診斷的進行，本發明的細胞生長繁殖快，制取周期短，雜交融合率高，適于推廣應用，選用BALA/C純種小白鼠，易于飼養，同種細胞具有很高的雜交融合率，抗體細胞產生過程中，加入的佐劑，使抗蛇毒血清產生容易，縮短了制取時間，同時在細胞融合過程中加入的飼養細胞使細胞生產繁殖更快，大大縮短了抗蛇毒血清的制取周期，熒光蛋白基因提取技術成熟，DNA重組技術完善，因此本發明的抗蛇毒血清生產適于推廣應用。
[0032]以上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發明說明書內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的技術領域，均同理包括在本發明的專利保護范圍內。
【主權項】
1.一種抗蛇毒血清的制取工藝，其特征在于，其工藝步驟如下: (1)動物的選擇與免疫:選用BALA/C純種小白鼠，初次免疫蛇毒2?50μ g加佐劑脾內注射0.8?2ml ;3周后，第二次免疫劑量同上，加佐劑腹腔內注射，其劑量不宜超過0.5ml ；3周后，第三次免疫劑量同一，不加佐劑腹腔內注射，5?7天后采血測其效價；2?3周，加強免疫，蛇毒量50?500 μ g為宜，靜脈內注射；3天后，取細胞融合； (2)制備免疫細胞:最后一次加強免疫3天后小鼠拉頸處死，無菌取脾臟，培養液洗一次，脾臟研碎，過細胞篩，離心，細胞用培養液洗3次，制得脾淋巴細胞懸液，備用； (3)基因重組:運用DNA重組技術，將熒光蛋白基因重組到免疫細胞分泌抗蛇毒血清的基因序列中，得到重組細胞，純化培養，取20-8重組細胞懸液備用； (4)制備骨髓細胞:從BALA/C純種小白鼠體內提取骨髓細胞，體外培養，取對數生長骨髓細胞離心，用無血清培養液洗3次，計數，取得20-7細胞備用； (5)細胞融合:將骨髓細胞與重組細胞按2:20的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗2次，離心之后棄上清液，使細胞沉淀略松動，90s內加入37°C預溫的2ml 45%乙二醇溶液，邊加邊輕微搖動，37°C水浴作用90s，而后加37°C預溫的不完全培養液以終止PEG作用，離心之后棄上清液，得到雜交細胞； (6)選擇培養:將制取的雜交細胞用含20%小牛血清HAT選擇培養液培養，雜交細胞布滿孔底2/20面積時，開始檢測抗蛇毒血清，篩選出所需要的目標細胞； (7)后期培養:將上述目標細胞，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加200μ 1，將培養板置37°C、5% C02培養箱中培養。
2.根據權利要求1所述的抗蛇毒血清的制取工藝，其特征在于，所述步驟(I)中，所述佐劑為福氏完全佐劑。
3.根據權利要求1所述的抗蛇毒血清的制取工藝，其特征在于，所述步驟(5)中，所述融合過程加入飼養細胞。
4.根據權利要求1所述的抗蛇毒血清的制取工藝，其特征在于，所述步驟(7)中，所述96孔板數量為4塊。
【專利摘要】本發明公開了一種抗蛇毒血清的制取工藝，其工藝步驟為：(1)動物的選擇與免疫；(2)制備免疫細胞；(3)基因重組：運用DNA重組技術，將熒光蛋白基因重組到免疫細胞分泌抗體的基因序列中，得到重組細胞，純化培養，取20-8重組細胞懸液備用；(4)制備骨髓細胞；(5)細胞融合；(6)選擇培養；(7)后期培養，本發明的抗蛇毒血清中具有明顯的標記基因——熒光蛋白基因，醫學用于診斷時，過程中有熒光出現，則反應為陽性，便于診斷的進行，本發明的細胞生長繁殖快，制取周期短，雜交融合率高，適于推廣應用。
【IPC分類】C07K16-18, C12N15-06
【公開號】CN104558170
【申請號】CN201410808069
【發明人】崔強軍, 張政, 劉新亮, 余煉
【申請人】廣西大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月22日