專利名稱：膠原及其制備方法
技術領域：
本發明涉及從動物組織中獲得的純的和非變性的膠原及其制備方法。膠原形成結締組織并且是高級脊椎動物中的最豐富的蛋白。在天然中它以具有恒定周期性的三鏈螺旋的形式存在。
至少有五種典型的膠原是天然產生的。其中Ⅰ型膠原是最豐富的，它是皮膚、骨骼和腱的主要組成。
腱中存在的Ⅰ型膠原具有α1(Ⅰ)α2(Ⅰ)鏈結構，其中α1鏈和α2鏈兩者是同系的。α1和α2兩鏈通過靜電力和氫橋結合，該氫橋與存在的羥脯氨酸結合，而賦予該分子特征強度和韌性。當這些鍵被保持在提取產物中時，它們的存在阻礙了溶液的形成，而只在極少的情況下，它可以作為在水中蛋白膨脹的結果而于酸性環境中形成凝膠。
目前，發現了膠原在醫藥學方面有許多應用它可用作外科臨床，燒傷治療的治療劑、用作載體和外科修復術的材料(縫線、紗布等)，用作植入材料以及在藥物及化妝品領域中用作制備軟膏和油膏的原料。
因此，重要的是要盡可能地將膠原處理為非變性的、非變應性的和沒有不良雜質或污染物的形式。
迄今已知的用于制備膠原的工業化方法并不令人滿意，因為這些方法不能制備具有上述所要求特征的化合物。這問題與從腱中提取的膠原特別相關。實際上這種膠原是“酸不溶的”種類，并且在稀乙酸或鹽酸中用常規的無機鹽提取溶液技術是不易于提取的。因為這些技術要求有蛋白水解酶(木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶)存在的情況下進行。使用這些酶不改變α1和α2鏈的多肽結構，但引起它們的展開。
此外，提取的產物通常是交聯的，以便提高和改進其力學特性、降低其免疫原性和增強其抗有機的再吸收能力。
通常這種交聯法是通過物理方法(光、U.V.、γ-射線、X-射線、α或β粒子、質子、電子)或者通過化學方法(甲醛、戊二醛、乙縮醛、丙酮醛、乙二醛、醌、氨基二醛、氫醌、二甲基丙酮、二甲砜)而完成。
用上述方法獲得的產物是一種喪失了典型天然膠原結構的產物。
通常由腱或皮膚中進行提取時遇到的上述方法的另一個問題是為了除去在提取方法中所用的鹽而需要純化的長耗時的滲析工藝。
由于在本發明方法中沒有使用蛋白水解酶或成網劑，而且比已知方法更為經濟，因此本發明方法能夠解決已知技術的缺點并且能夠獲得高純度的非變性產物。
本發明方法可用于從牛或豬皮或者從牛腱、作為飲食和皮革工業的副產品而易于獲得的原料中提取膠原。
在腱中提取的情況中，得到的“酸可溶”類的膠原是凝膠形式，該膠原可被凍干以制備在外科臨床中常用的那種海綿狀片。
本發明方法包括下列步驟(a)用稀有機酸從生物組織中提取;
(b)通過加入無機鹽沉淀膠原;
(c)用稀有機酸進行可能的膠凝化;
(d)通過具有適當特性的膜切向過濾;
(e)將最終溶液或凝膠進行可能的凍干。
步驟(a)中優選地是在不高于25℃、按生物組織/酸重量比為0.1～0.01的條件下，用濃度為0.5～2M的乙酸水溶液進行。
在步驟(b)中優選的是鈉鹽，而在步驟(c)中，當原料為腱、生產不溶于酸的I型膠原時，則一般可使用相同的稀乙酸進行。
在步驟(d)中，首先進行等體積洗滌，然后濃縮。洗滌實際上是通過分子膜的切向過濾，該膜能夠去除分子量低于膜分子分離能力的全部化合物，而不取決于它們的性質。同時，溶液或凝膠中所存在的高分子量的膠原保持在液相中并通過蠕動泵循環。
因此，通過不斷地更新鹽酸的操作，起始溶液或凝膠中的所存在的全部雜質可在短時間內去除。
通過切向過濾裝置再循環凝膠而進行凝膠濃縮。
由于在切向過濾的每個通道都有一些液體排出，因而溶液或凝膠變得更濃。當線性壓力計指出的操作反壓高于40p.s.i.時，工藝可以結束。通常在這些條件下形成的凝膠的濃度在1.5～2%。在溶液情況下(由皮膚起始而獲得，它提供一種可酸溶的膠原)，通過測定粘度、羥脯氨酸滴定度等相應的所要求的濃度可以指出操作的結束。


圖1和圖2是上述操作的流程圖。
圖3是不同濃度膠原的脫鹽情況。
圖4是不同濃度膠原的濃度曲線圖。
圖1表示了在恒定體積步驟中的洗滌操作，其中1為稀乙酸儲槽，2為樣品，3相當于過濾膜，而4、5和6分別為蠕動泵、洗滌水出口和樣品再循環。
實際上，儲槽1可以用循環的乙酸本身替代。
圖2表示溶液或凝膠的膠原濃縮的操作示意圖，其中有關的數字的含義與圖1相同。
所用的過濾膜的上排阻限優選的為10，000至100，000。
在步驟(a)、(b)和(c)所產生的膠原溶液或凝膠必須被稀釋至0.005～0.5%的濃度，而在洗滌中使用的稀乙酸的濃度為0.01至1M，優選的約0.5M。
如果需要用具有藥物學活性的物質處理膠原，那么這些物質可在恒定體積脫鹽后和濃縮步驟之前直接溶解或分散在儲槽中。
適當的物質實例是抗生素、維生素、激素和類固醇。對于婦科學領域中的應用，硫酸鋅是特別優選的，例如皰疹形式的局部治療(片、小丸、霜、吸附劑等)。
必須溶解或分散的物質量，是按溶液或凝膠濃縮后的相和原料的可能的轉變相的倍增因數而計算。
按已知方法進行可能的凍干。
按照本發明方法獲得的膠原保持其典型的三螺旋構型，是純的、不要求交聯處理并且是非變應性的。
由于這些特性，本發明的膠原在治療外科創傷和燒傷方面更具活性，由于化合物的非變性結構而有天然治療作用。
通過下述實施例將會更好地理解本發明。
實施例1
從80mg Achille牛腱上剔除肉和脂肪并用絞碎器絞碎。將絞碎的腱用水(三次)、1～10% NaCl水溶液(三次)洗滌，然后用水洗滌，直到洗滌水幾乎澄清;每次洗滌都通過傾析液體而進行。
按有機物/酸的0.1至0.001的比例將材料懸浮于濃度為0.1～5M的稀乙酸中。在不高于25℃的溫度，輕微地攪拌該材料24～72小時。
用No.50金屬篩過濾該材料，收集液體和固體。向溶液中添加250～1000g NaCl，膠原以乳白色γ-纖維產物形式沉淀。將該產物過濾在No.40金屬篩上，用蒸溜水洗滌并儲存。將固體部分按上述再懸浮于稀乙酸中并進行提取。重復該方法直到膠原不再發生明顯的分離(約3～4次)。
將這樣得到的全部膠原懸浮于5升0.5M乙酸中并攪拌直到產生完全膠凝化(約24小時)。加入500g NaCl以沉淀膠原，將該膠原過濾在No.40金屬篩上，收集固體。通過用5份蒸餾水(每份1升)傾析洗滌該固體，然后再懸浮于0.5升0.5M乙酸中并攪拌直到產生完全膠凝化(約24小時)，接著用相同的乙酸稀釋后獲得0.75kg膠原凝膠1%(在羥脯氨酸×7.46中的滴定度)。
將凝膠轉移到滲析膜28/32″上，并用0.5M乙酸滲析，連續地更新以達到從凝膠中去除NaCl。
通過表面修正機滾筒(surfacer roller)將原膠分配到方盤中，以恰當地分配非常粘的料塊。
在約-40℃預冷凍該物質8～10小時，并置于高真空(0.05mm殘余壓力)16小時。然后以恒定的速度(約2℃/小時)提高溫度直到達到30℃。
將產物在40℃加熱2小時，然后將凍干層冷卻并通過半人工剪切方式分割。
這樣得到的產物具有以下物化參數，這些參數是特征性的和恒定的。
化學參數(a)羥脯氨酸含量，通過分光光度法測定，高于13%并且在任何情況下不低于12%;
(b)總氮含量，通過克耶達定氮法測定，高于17.5%而不低于16.2%;
(c)殘留濕度低于20%。
物理參數(a)單位重量的浸漬時間不低于15分鐘;
(b)單位重量水的吸收系數不低于25g;
(c)抗剪切不低于2000g/cm2;
(d)起皺溫度90℃～120℃;
(e)用胃蛋白酶在10N HCl(比例1/1 W/W)中的消化時間不低于20分鐘。
實施例2在冷凍干燥以前將在前例中獲得的凝膠分成三部分，并用0.5M乙酸將它們的濃度分別稀釋成0.1、0.2和0.3%(重量)。
按圖1和2的操作步驟，用0.5M乙酸和排阻限為30，000的膜進行脫鹽。
在圖3中列出了濃度為0.1、0.2和0.3%的1升膠原凝膠的工藝曲線，其中所示為隨時間函數的鹽含量(以百分數表示)的變化。當過濾的鹽達到100%，樣品是100%純。
有關含有NaCl的濃度為0.1～0.2、0.3%的膠原的所述工藝，按與圖3所示相同的方式，該方法可用于凝膠或膠原溶液中含有任何鹽的雜質;曲線圖根據不同情況明顯地有所變化。
圖4所示為不同濃度(0.1、0.2和0.3)的膠原凝膠的濃度曲線圖。
在這種情況下，該方法的總的原則也可用于具有不同濃度的膠原凝膠或溶液。當膠原濃度(羥脯氨酸滴定度×7.46)達到所希望的值時方法就結束。
用0.5M乙酸進行過濾膜再生。在圖4中所示的曲線圖案取決于初始樣品，這一點值得考慮。
權利要求
1.由腱或皮膚起始制備非變性膠原的方法，該方法包括下列步驟(a)用稀有機酸從生物組織中提取，(b)通過加入無機鹽沉淀膠原，(c)用稀有機酸進行可能的膠凝化，(d)通過適當的過濾膜而進行切向過濾，(e)最終溶液或凝膠的可能的凍干。
2.按照權利要求1的方法，其中原料為牛腱。
3.按照權利要求1或2的方法，其中使用濃度為0.5～2M乙酸水溶液，組織/酸的(重量)比為0.1～0.01。
4.按照上述權利要求之一的方法，其中使用濃度為0.005～0.5%的膠原溶液或凝膠和0.01～1M、優選約0.5M的乙酸洗滌液，使用排阻限為10，000至100，000的過濾膜而連續進行切向過濾。
5.通過按權利要求1～4的方法獲得的有三螺旋的非變性膠原。
6.通過按權利要求1～4的方法可獲得的、可能含有其它具有藥物活性物質的、由牛腱獲得的凍干膠原的海綿狀片劑。
7.含有硫酸鋅的按權利要求6的片劑用于婦科學。
8.按權利要求5的膠原在藥物學實踐中的應用。
全文摘要
本發明描述了通過稀有機酸提取、鹽沉淀和可能的凝膠化和/或凍干以及切向過濾，而從動物腱或皮膚制備三螺旋、非變性的膠原。這樣制得的膠原與用常規方法制備的膠原相比，具有高純度和在治療過程中具有更高活性，而且它是非變應性的。
文檔編號C08H1/06GK1110284SQ9410469
公開日1995年10月18日 申請日期1994年4月14日 優先權日1994年4月14日
發明者迪歌·弗蘭 申請人:尤羅瑞瑟徹公司