專利名稱:水華魚腥藻厚壁孢子的誘導技術及其干藻粉的制備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種生物技術領域：
的優化生產方法，具體是一種水華魚腥藻厚壁孢子的誘導技術及其干藻粉的制備方法。
背景技術：
水華魚腥藻(Anabaena flos-aquae)由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供(編號FACHB_245),記載于《Jianying Shen, Antomo DiTommaso, Mingquan Shen,Wei Lu, and Zhengming Li ；Molecular basis for differential metabolic responsesto monosulfuron inthree nitrogen-fixing cyanobacteria, Weed Science,2009,57 :178-188〉〉、〈〈Jianying Shen, JingJiang, Peizhong Zheng ；Effects of Light andMonosulfuron on growth and PhotosyntheticPigments of Anabaena flos-aquae Breb,Water Resource and Protection, 2009,1 :408_413》、《鄭培忠，沈健英；有機溶劑丙酮對固 氮藍藻生長效應的研究，上海農業學報，2010. 4 :33-38))等中公開。
水華魚腥藻能固定大氣中的游離氮，是固氮藍藻的一種。它生長繁殖迅速，固氮量達10_51kg/ha，其藻體沉入土壤后可被作物根系吸收，特有的藻促生長素能促進作物茁壯生長，使作物增產10-30%，因此這是一種良好的有機肥。而農用化學肥料和農藥的生產、施用又會帶來大量的溫室氣體排放，因此開發農業生物固氮技術，降低化肥施用量，是當前發展低碳農業的重要途徑。
水華魚腥藻的用途主要有提取天然色素、藻膽蛋白和多糖，藻毒素研究及利用，生物固氮及其他方面等。用途雖多，但是因為水華魚腥藻含水量高導致容易霉變，占用體積大導致難以運輸，施用不方便導致不能大面積推廣，因而不便于利用。為了大量并且方便應用這種藍藻，可以通過施加某些條件，誘導厚壁孢子大量生成，再把水華魚腥藻的藻液干燥，制備成干藻粉，以便長距離運輸和長時間保存。在自然條件下，厚壁孢子比營養細胞的存活率要高很多，應用稻田后更容易萌發。現有的水華藍藻中已知含有微量的厚壁孢子，厚壁孢子不僅耐低溫，就是在高溫下也不易死亡。天然存在的厚壁孢子因為極微量，所以應用于稻田后萌發率不高，肥效不明顯。
目前為止國內外對水華藍藻的異形胞有所研究，而對水華藍藻厚壁孢子的誘導的研究則幾乎沒有。公開號為CN 1380901A的專利文獻，公開了大量生產Trichodermaherzianum SK-55的菌絲體的厚壁抱子的方法。Trichoderma herzianum SK-55屬于真菌，而水華魚腥藻則屬于細菌，尚未見關于水華魚腥藻厚壁孢子大量生產的技術公開。
藍藻的干燥方法有很多有攤開在玻璃板上干燥，有放置在大瓷盤里干燥，還有直接在大小培養皿里干燥，但是這些干燥方法都很難把干燥的藍藻收集儲存。本發明的簡易干燥方法是把倒去培養液的水華魚腥藻轉移到滅過菌的覆蓋有塑料膜的大培養皿或瓷盤中，待干燥時藍藻會自動與塑料膜剝離，非常便于收集。
發明內容
[0007]本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種水華魚腥藻厚壁孢子的誘導技術及其干藻粉的制備方法，針對目前大力推廣低碳農業，減少化肥和農藥的施用，提高有機肥的用量和肥效的政策，和水華藍藻的含水量高、占用體積大，不便于運輸保存的弊端，以及水華魚腥藻不便于收獲的缺陷，本發明提供了一種以水華藍藻為原料，外加理化條件大量誘導厚壁孢子形成并借助塑料膜制備干藻粉的高效安全方便的生產肥料的技術。
本發明是通過以下技術方案實現的
本發明涉及水華魚腥藻厚壁孢子的一種誘導方法，使用含有磷酸氫二鉀、檸檬酸鐵、鑰酸和碳酸鈣的液體培養基在PH調到6-7，蔗糖或葡萄糖調到80-100mg/L的條件下培養水華魚腥藻3-4天，實現水華魚腥藻厚壁孢子的誘導。
所述的水華魚腥藻是指將含水量約10%的水華魚腥藻干藻粉密閉保存于4°C的冰箱中兩周后取出，轉移到加有培養液的小燒杯中并用打藻機打碎。
所述的培養液的組分為75g/L磷酸氫二鉀、10g/L檸檬酸鐵、10g/L鑰酸、100g/L 碳酸鈣，余量為50g/L的土壤提取液。
所述的在pH調到6-7的環境下培養是指將水華魚腥藻以接種量為280_300mg/L接種在液體培養基中，在光強為3000±200Lx，溫度為30±2°C，pH為6_7的環境下定時開
蓋攪拌培養。
所述的定時是指每天在同一個時間段攪拌一次。
所述的攪拌是指借助滅過菌的三角棒或玻璃棒或移液槍把細胞打散打勻。
本發明涉及上述水華魚腥藻厚壁孢子的干藻粉的制備方法，通過將所述水華魚腥藻厚壁孢子平鋪瓷盤中，置于35-40°C的烘箱烘干或30°C的無菌室中干燥3-5天得到干藻粉。
所述的平鋪是指采用厚度不超過Icm的高度平鋪在瓷盤底部且使其均勻散開。
所述的瓷盤是指鋪有滅過菌的塑料膜的白瓷盤。
本發明的優點在于有效的理化條件大量提高了厚壁孢子的含量；簡易的干燥方式可以更加高效的收獲干藻粉；以水華藍藻為原料制備干藻粉的方法涉及的工藝簡單；月巴料施用安全高效，易于推廣實施；實施后不會對環境、食品安全造成新的污染；所以本發明具有極大的理論價值和應用價值。
圖I是本發明中水華魚腥藻厚壁孢子的誘導及其干藻粉制備的原理圖
圖2是實施例中在不同pH的誘導條件下，水華魚腥藻厚壁孢子在連續培養7天的含量。
圖3是實施例中在不同培養液的誘導條件下，水華魚腥藻厚壁孢子在連續培養7天的含量。
圖4是實施例中在不同保存溫度的誘導條件下，水華魚腥藻厚壁孢子在連續培養7天的含量。
圖5是實施例中水華魚腥藻的三類細胞。
圖6是實施例中水華魚腥藻厚壁孢子的透射電鏡圖。
具體實施方式
下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例I
主要材料氫氧化鈉、鹽酸、蔗糖、培養液、干藻粉、塑料膜、大瓷盤。
如圖I所示，具體方案是稱取O. Olg左右的水華干藻粉，溶解在含有IOmL培養液的小燒杯中，用75%酒精滅菌的打藻機打碎3次，每次10s，再把藻液轉移到90X 15mm的小培養皿中，用培養液沖洗燒杯再倒在培養皿中,最后培養皿補加培養液到35mL。用氫氧化鈉和鹽酸將pH調到6，然后加3mg蔗糖于培養皿中，最后放置在光強為3000±200Lx、溫度為30±2°C的無菌室中培養。一般培養3天后厚壁孢子含量將達到峰值，此時倒出多余培養液，保留水華魚腥藻。再把藍藻轉移到滅過菌的覆蓋有塑料膜的大瓷盤中，平鋪厚度不超 過1cm，并且使其均勻散開，置于30°C的光照室，大概3-5天后水華魚腥藻將會自動與薄膜剝離，非常容易收獲。
顯微計數在培養第三天，取樣進行顯微計數，經計算得知，細胞總數為6. 15X105個/mL，厚壁孢子數為I. 03 X IO5個/mL，占細胞總數的16.75%。
如圖5所示，為實施例中水華魚腥藻的三類細胞；對應如圖6所示,為水華魚腥藻厚壁孢子的透射電鏡圖。
實施例2
主要材料氫氧化鈉、鹽酸、葡萄糖、培養液、干藻粉、塑料膜、大瓷盤。
具體方案是稱取O. Olg左右的水華干藻粉，溶解在含有IOmL培養液的小燒杯中，用75%酒精滅菌的打藻機打碎3次，每次10s，再把藻液轉移到90X 15mm的小培養皿中，用培養液沖洗燒杯再倒在培養皿中，最后培養皿補加培養液到35mL。用氫氧化鈉和鹽酸將pH調到6，然后加3mg葡萄糖于培養皿中，最后放置在光強為3000±200Lx、溫度為30±2°C的無菌室中培養。一般培養3天后厚壁孢子含量將達到峰值，此時倒出多余培養液，保留水華魚腥藻。再把藍藻轉移到滅過菌的覆蓋有塑料膜的大瓷盤中，平鋪厚度不超過1cm，并且使其均勻散開，置于30°C的光照室，大概3-5天后水華魚腥藻將會自動與薄膜剝離，非常容易收獲。
顯微計數在培養第三天，取樣進行顯微計數，經計算得知，細胞總數為1.02X106個/mL，厚壁孢子數為I. 13 X IO5個/mL，占細胞總數的11.08%。
實施例3
主要材料氫氧化鈉、鹽酸、葡萄糖、培養液、干藻粉、塑料膜、大培養皿、烘箱。
具體方案是稱取O. Olg左右的水華干藻粉，溶解在含有IOmL培養液的小燒杯中，用75%酒精滅菌的打藻機打碎3次，每次10s，再把藻液轉移到90X 15mm的小培養皿中，用培養液沖洗燒杯再倒在培養皿中，最后培養皿補加培養液到35mL。用氫氧化鈉和鹽酸將pH調到7，然后加3mg葡萄糖于培養皿中，最后放置在光強為3000±200Lx、溫度為30±2°C的無菌室中培養。一般培養3天后厚壁孢子含量將達到峰值，此時倒出多余培養液，保留水華魚腥藻。再把藍藻轉移到滅過菌的覆蓋有塑料膜的150 X 15_大培養皿中，平鋪厚度不超過1cm，并且使其均勻散開，置于40°C的烘箱中干燥，大概12h后水華魚腥藻將會自動與薄膜剝離，非常容易收獲。
顯微計數在培養第三天，取樣進行顯微計數，經計算得知，細胞總數為8. 23 X IO5個/mL，厚壁孢子數為I. 53 X IO5個/mL，占細胞總數的18. 59%。
實施例4
主要材料氫氧化鈉、鹽酸、蔗糖、培養液、干藻粉、塑料膜、大培養皿、烘箱。
具體方案是稱取O. Olg左右的水華干藻粉，溶解在含有IOmL培養液的小燒杯中，用75%酒精滅菌的打藻機打碎3次，每次10s，再把藻液轉移到90X 15mm的小培養皿中，用培養液沖洗燒杯再倒在培養皿中，最后培養皿補加培養液到35mL。用氫氧化鈉和鹽酸將pH調到7，然后加3mg蔗糖于培養皿中，最后放置在光強為3000±200Lx、溫度為30±2°C的無菌室中培養。一般培養3天后厚壁孢子含量將達到峰值，此時倒出多余培養液，保留水華魚腥藻。再把藍藻轉移到滅過菌的覆蓋有塑料膜的150 X 15_大培養皿中，平鋪厚度不超過 Icm,并且使其均勻散開，置于40°C的烘箱中干燥，大概12h后水華魚腥藻將會自動與薄膜剝離，非常容易收獲。
顯微計數在培養第三天，取樣進行顯微計數，經計算得知，細胞總數為5.83X105個/mL，厚壁孢子數為I. 15 X IO5個/mL，占細胞總數的19. 73%。
以上實施例不是對本發明的限制，具體實施時可以在權利要求
限定的范圍內按一定比例配制大體積的培養液，如IOOmL培養液中加9mg葡萄糖或鹿糖,加O. 03g水華干藻粉；轉移水華時可以用滅過菌的覆蓋有塑料膜的大瓷盤。如圖2-圖4所示，為在不同pH、不同培養液、不同保存溫度誘導條件下，水華魚腥藻厚壁孢子在連續培養7天的含量比較。
權利要求
1.一種水華魚腥藻厚壁孢子的誘導方法，其特征在于，使用含有磷酸氫二鉀、檸檬酸鐵、鑰酸和碳酸鈣的液體培養基在添加蔗糖或葡萄糖80-100mg/L的基礎上，pH調到6_7的環境下培養水華魚腥藻3-4天，實現厚壁孢子的誘導； 所述的水華魚腥藻是指將含水量10%的水華魚腥藻干藻粉密閉保存于4°C的冰箱中兩周后取出，轉移到加有培養液的小燒杯中并用打藻機打碎； 所述的培養液的組分為75g/L磷酸氫二鉀、10g/L檸檬酸鐵、10g/L鑰酸、100g/L碳酸鈣，余量為50g/L 土壤浸提液； 所述的在pH調到6-7的環境下培養是指通過添加氫氧化鈉和鹽酸，將pH調為6-7的環境下定時開蓋攪拌培養。
2.根據權利要求
I所述的水華魚腥藻厚壁孢子的誘導方法，其特征是，所述的定時是指每天在同一個時間段攪拌一次。
3.根據權利要求
I所述的水華魚腥藻厚壁孢子的誘導方法，其特征是，所述的攪拌是指借助滅過菌的三角棒或玻璃棒或移液槍把細胞打散打勻。
4.一種根據上述任一權利要求
所述方法制備得到水華魚腥藻厚壁孢子的干藻粉的制備方法，其特征在于，通過將所述水華魚腥藻厚壁孢子平鋪瓷盤中，置于35-40°C的烘箱烘干或30°C的無菌室中干燥3-5天得到干藻粉；所述的瓷盤是指覆蓋有塑料膜的白色的瓷盤。
5.根據權利要求
4所述的干藻粉的制備方法，其特征是，所述的平鋪是指采用厚度不超過Icm的高度平鋪在瓷盤底部且使其均勻散開。
專利摘要
一種生物技術領域：
的水華魚腥藻厚壁孢子的誘導方法，使用含有磷酸氫二鉀、檸檬酸鐵、鉬酸和碳酸鈣的液體培養基在添加土壤提取液、蔗糖或葡萄糖的基礎上，在pH調到6-7的環境下培養水華魚腥藻3-4天，實現厚壁孢子的誘導。再將所述的水華魚腥藻平鋪于瓷盤或150×15mm的大培養皿中，置于35-40℃的烘箱烘干或30℃的無菌室中干燥3-5天得到干藻粉。本發明有效的理化條件大量提高了厚壁孢子的含量；簡易的干燥方式可以更加高效的收獲干藻粉；以水華藍藻為原料制備干藻粉的方法涉及的工藝簡單；肥料施用安全高效，易于推廣實施；實施后不會對環境、食品安全造成新的污染；所以本發明具有極大的理論價值和應用價值。
文檔編號C12N3/00GKCN102242078 B發布類型授權 專利申請號CN 201110046706
公開日2013年1月9日 申請日期2011年2月25日
發明者沈健英, 萬旗東, 鄭培忠, 陳瑞 申請人:上海交通大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (4),