專利名稱:雜交瘤細胞株4 e 9及其所產生的單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種雜交瘤細胞株及其所產生的單克隆抗體，具體地本發明涉及一種雜交瘤細胞株4e9及其所產生的單克隆抗體4e9。
背景技術：
中國專利公開號CN100587069C公開了名稱為“人癌來源的Ig輕鏈可變區序列和CDR3序列以及它們的用途”。公開了 Vk 4-1/J3組合序列及其抗體在制備誘導腫瘤細胞凋亡的藥物中的應用。針對該組合序列的應用，篩選到特異性高、抗腫瘤效果好的單克隆抗體，以在制備誘導腫瘤細胞凋亡的藥物中進行更好地應用，無疑是本領域技術人員所期望的。

發明內容
本發明的目的是提供一種特異性高、抗腫瘤效果好的能夠識別Vk 4-1/J3組合序列的單克隆抗體以及產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
為了達到上述目的，本發明的技術方案如下
本發明提供了具有保藏號為CGMCC No. 4572的雜交瘤細胞株4e9。
進一步，本發明提供了一種單克隆抗體4e9，其從具有保藏號為CGMCCNo. 4572的雜交瘤細胞株4e9產生。
進一步，本發明的單克隆抗體4e9,其特征在于該單克隆抗體4e9特異性識別V K 4-1/J3組合序列的Ig輕鏈。
進一步，本發明也提供了本發明的單克隆抗體4e9在制備誘導腫瘤細胞凋亡的藥物中的應用。
本發明保藏號為CGMCC No. 4572的雜交瘤細胞株4e9產生的單克隆抗體4e9特異性高，抗腫瘤效果好，并且可以識別Vk 4-1/J3組合序列的Ig輕鏈。
本發明的雜交瘤細胞株4e9于2011年I月25日保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)Jia :北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所，保藏編號CGMCC No. 4572。


圖I :單克隆抗體4e9的流式鑒定。
A列為商品化小鼠IgG2b (冋型對照)，B列為單克隆抗體4e9 ；
①行為A549細胞胞內蛋白熒光染色，②行為A549細胞膜表面熒光染色；
③行為HT-29細胞胞內蛋白熒光染色，④行為HT-29細胞膜表面熒光染色。
圖2 :蛋白質譜分析鑒定單克隆抗體4e9特異性識別的蛋白。
圖3 :單克隆抗體4e9和商品化人Ig κ單抗特異性識別多種腫瘤組織和正常人血清中的IgK。[0017]I.人結腸癌腫瘤組織；2.人骨肉瘤腫瘤組織；3.人結腸癌細胞系HT29在裸鼠體內成瘤的腫瘤組織；4.正常人血清。RIPA裂解液獲得親水性的腫瘤組織蛋白。尿素裂解液獲得疏水性的腫瘤組織蛋白。
上圖為單克隆抗體4e9的識別結果；下圖為商品化人IgK單抗的識別結果。
圖4 :多種腫瘤組織中單克隆抗體4e9和商品化人IgK單抗免疫組化結果的比較研究。
圖5 :單克隆抗體4e9的抗腫瘤結果。其中該四格圖中，左上方表示死亡細胞的百分比，右上方表示凋亡細胞的百分比，左下方表示存活細胞百分比，右下方表示早期凋亡細胞百分比。
圖6 :單克隆抗體4e9臨床診斷多發性硬化癥的應用。
為了更好地理解本發明，下面結合附圖及實施例對本發明做進一步說明。該實施 例僅僅是示例，本發明不限于該實施例。
本發明所用的生物材料、試劑、方法和儀器，如無特別說明，為本領域常規的生物材料、試劑、方法和儀器。本發明所涉及的生物材料、試劑、方法和儀器均可以通過商購途徑購買。
具體實施方式
實施例I :雜交瘤細胞株4e9、其所產生的單克隆4e9的制備、純化及鑒定
以原核重組蛋白(GST-VK4-1-J3)作為免疫原免疫Balb/c小鼠，取其脾細胞與NS-I細胞進行融合，經篩選、克隆化后獲得I株(4e9)穩定分泌針對Vk 4-1/J3型IgK的抗體的雜交瘤細胞株。這株單抗的亞類為IgG2b。將腹水單抗經辛酸-硫酸銨沉淀法或經Protein G親和層析純化法獲得高純度的單抗。ELISA鑒定結果顯示所得單抗均與原核重組蛋白(GST-V κ 4-1-J3)發生特異性結合，與常見的載體蛋白KLH、BC、BSA、OVA不發生交叉反應，同時與商品化的人IgG、羊IgG、兔IgG、鼠IgG均不反應。并對抗體進行了辣根過氧化物酶標記和FITC標記。通過ELISA及流式細胞術對抗體的效價及特異性經行了初步鑒定。
具體步驟如下
I.材料和方法
I. I主要材料
(I)主要試劑RPMI 1640培養基、MDM培養基、小牛血清及FBS均購自GIBCO公司；福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑購自Pierce公司；PEG(MW. 4000)購自Merck公司；HAT、HT、avidin、Pristane及小鼠單抗亞類檢測試劑盒均為Sigma公司產品；HRP標記的羊抗鼠IgG購自鼎國試劑公司；其它試劑均為國產分析純。
(2)實驗動物6周齡雌性SPF級Balb/c小鼠購自南方醫科大學實驗動物中心。
(3)細胞系小鼠骨髓瘤細胞系NS-1，人腫瘤細胞系HT-29和A549均可以商購得到。
I. 2主要溶液配制
(l)PBS(pH7. 4)
NaCl8g[0035]KClO. 2g
Na2HP04I. 44g
KH2P040. 24g
蒸餾水IL
(2) 0. I % PBST 洗液
Tween 20Iml
PBS (pH7. 2)IL(3)酪蛋白封閉液
TrisI. 21g
明膠2g
蔗糖20g
硫柳萊0. 2g
酪蛋白2.5g
蒸餾水IL
(4)0. 06M 乙酸緩沖液(PH4. 4)
溶液A (O. 06M NaAc)
NaAc. 3H20O. 816g
去離子水100ml
溶液B (O. 06M HAc)
HAcO. 344ml
去離子水IOOml
取59ml溶液A與41ml溶液B混勻后，用5M NaOH調PH值至4. 4 (5) O. 2M EDTA
在80ml去離子水中溶解EDTA 二鈉鹽7. 44g，加熱攪拌促溶，用NaOH調pH值至8. 0，最后用去離子水定容至100ml。(6) PBS (pH7. 4含O. 2mM EDTA)
O. 2M EDTAIml
PBS (pH7. 2)IL
(7) O. 06M NaI04 (現配現用)
NaI04O. 0256g
去離子水2ml
(8)0·016Μ 乙二醇
乙二醇93ul
去離子水IOml
(9) O. 05M 碳酸鹽緩沖液(PH = 9. 5)
NaHC032. 94g
Na2C03I. 59g
去離子水IL
I. 3主要儀器與器材
'名稱I規格與型號I產地
權利要求
1.具有保藏號為CGMCCNo. 4572的雜交瘤細胞株4e9。
2.單克隆抗體4e9，其從具有保藏號為CGMCCNo. 4572的雜交瘤細胞株4e9產生。
3.根據權利要求
2所述的單克隆抗體4e9，其特征在于該單克隆抗體4e9特異性識別VK4-1/J3組合序列。
4.權利要求
2所述的單克隆抗體4e9在制備誘導腫瘤細胞凋亡的藥物中的應用。
專利摘要
本發明公開了一種具有保藏號為CGMCC No.4572的雜交瘤細胞株4e9，及由該雜交瘤細胞株4e9所產生的單克隆抗體4e9。該單克隆抗體4e9特異性識別V κ4-1/J3組合序列的Ig輕鏈。該單克隆抗體4e9特異性高，抗腫瘤效果好。
文檔編號C12N5/20GKCN102154218 B發布類型授權 專利申請號CN 201110035394
公開日2013年1月16日 申請日期2011年2月10日
發明者邱曉彥, 富寧, 初明, 鄭杰, 葉青, 黃晶, 朱平, 姜冬陽 申請人:北京大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (1), 非專利引用 (2),