專利名稱:一種以菊芋為原料發酵生產2,3-丁二醇的方法
技術領域：
本發明屬于生物化工技術領域：
，涉及一種發酵生產2，3_ 丁二醇的方法，特別涉及到一種以菊芋為原料經微生物發酵生產2，3- 丁二醇的方法。
背景技術：
2，3-丁二醇(英文名2，3-Butanediol，以下簡稱2，3_BD)是一種極其重要的化工原料，具有廣泛的應用領域。它是極具價值的液體燃料；并且易于脫水得到重要的工業有機溶劑或燃料添加劑甲乙酮以及合成塑料和人造橡膠的單體-2-丁烯和1，3_ 丁二烯； 同時2，3-BD也很容易催化脫氫獲得乙偶姻和二乙酰化合物，用來制作高價值香料和食品添加劑；酯化形式的2，3-BD是合成聚亞胺的前體，可應用于藥物、化妝品、洗滌液等；2， 3-BD自身也可以作為單體用來合成高分子化合物；左旋形式的2，3-BD由于其較低的凝固點可用作抗凍劑；此外，2，3-BD還在染料、炸藥、香水、藥物載體等領域顯示出潛在的應用價值(ApplMicrobiol Biotechnol, 2001, 55 (1) 10-18 ；精細與化工專用品，2006，14 (15) 15-18)。2，3-BD雖然具有如此廣泛的應用潛力，但偏高的價格卻一直影響并限制了其大規模生產和廣泛的應用。
2,3-BD的生產方法主要有化學法和生物轉化法。由于化學法合成比較困難，至今尚未實現工業化生產；生物轉化法是以可再生資源為原料，通過微生物代謝將單糖轉化為目標產物。由于生物轉化法具有安全、環保、反應條件溫和等特點，越來越成為國內外研究開發的熱點。目前對生物轉化法生產2，3-BD的報道較多，且多是利用葡萄糖為碳源(Appl Microbiol Biotechnol,1991,34(4) :463-468 ；Chin J Chem Eng,2006,14(1) :132-136), 而利用葡萄糖為碳源又存在其價格較高且與人爭糧、與糧爭地等問題。同時也有報道利用糖蜜、淀粉或甘蔗汁為碳源發酵生產2，3-BD(Z. Naturforsch,2001,56 :787-791 ；中國專利申請公開號CN1710086A)，還有少量報道是以纖維素為碳源(Appl MicrobiolBiotechnol, 2001,55 10-18 ；Enzyme Microb Technol，1991，13 :110-115 ；中國專利申請公開號 CN101153^1A)，但最終產物2，3-BD的濃度都不高，因此尋找一種既廉價又有效的非糧原料來替代糧食作物是推進發酵生產2，3-BD的必經之路。由于用于生產2，3-BD的菌株具有較寬的底物食譜，己糖、戊糖、特定的二糖、糖醛酸等都可以作為底物，因此利用種植廣泛的、不與糧食爭地的非糧廉價原料菊芋作為發酵底物，是加快2，3-BD實現大規模生產的必然選擇。
菊芋(又名洋姜、鬼子姜)作為一種可再生資源，在我國分布廣泛。菊芋適應性和抗病能力都很強，不用施肥，但長勢旺盛，尤其適合在廢棄土地上種植，如沙漠、鹽堿地等。 菊芋非常容易栽培，通常一年種植后可每年收獲，可以連收4-5年。菊芋含有一種貯存性多糖一菊粉，約占菊芋肥大塊莖干重的70%以上。菊粉又叫菊糖，主要成分是各種果聚糖， 經菊糖酶水解得到以果糖為主并含有部分葡萄糖的水解液，可用來作為發酵生產2，3-BD 的底物。另外菊粉中還含有一定數量的蛋白質、果膠、纖維素及微量元素等其它營養成分對發酵可能存在促進作用(四川師范大學學報(自然科學版)，1999，22 (6) :747-751 ；北京工商大學學報(自然科學版)，2004，22 (16) :8-17)。Jacques Fages等人也曾嘗試過用菊芋為原料采用批式發酵的方式來生產2，3-BD (Appl Microbiol Biotechnol, 1986, 25 (3) 197-202)，但在最佳培養條件下得到的2，3-BD濃度僅為44g/L。目前已有不少文獻報道利用菊芋為原料發酵生產燃料乙醇以及微生物油脂(FoodTechnol Biotechnol, 2005,43 (3) 241-246 ；中國專利申請公開號:CN101108997A ；中國專利申請公開號:CN1952163A)，都取得了較好的結果。因此利用非糧可再生資源菊芋為原料，采用分步糖化發酵或同步糖化發酵工藝獲得較高濃度的2，3-BD,可以在一定程度上降低生產成本，提高生產效率，還能為山區資源的開發利用開辟一條很好的途徑。

發明內容
本發明的目的是提供一種使用非糧的廉價原料菊芋來代替葡萄糖發酵生產2， 3-BD的技術方法，解決目前主要利用葡萄糖為底物發酵生產2，3-BD存在成本較高的問題。
為實現上述目的，本發明的技術方案具體步驟如下
(1)原料制備和處理以菊芋塊莖為原料，將其制備成菊芋汁或菊芋漿。向菊芋汁、菊芋漿中添加菊糖酶，加酶量為10-100U/g菊芋干重，在37-60°C，pH4. 0-7. 0條件下，水解2-20小時，制成菊糖水解液，其中還原糖濃度范圍80-400g/L。
(2)培養基
種子培養基是將(1)中菊糖水解液與無機鹽營養成分分別在115-121°C條件下滅菌15-20min，冷卻后混合得到；種子培養基中無機鹽成分包括(NH4)2HPO4 6. 0g/L ；KCl 1. 8g/L ；EDTA 0. 51g/L ；MgSO4 · 7H20 0. 6g/L ；檸檬酸 0. 21g/L ；檸檬酸鈉 0. 294g/L ；
發酵培養基是將(1)中的菊芋汁、漿或菊糖水解液與無機鹽營養成分分別在 115-121°C條件下滅菌15-20min，冷卻后混合得到；發酵培養基中無機鹽成分包括=KH2PO4 1. 36g/L ； (NH4)2SO4 6. 61g/L ；MgCl2 · 6H20 0. 26g/L ；酵母粉 lg/L ；檸檬酸 0. 428g/L。
(3)菌種采用的菌種通常為克雷伯氏菌屬、多粘芽孢桿菌屬或產氣腸桿菌屬。
(4)發酵培養經活化后(3)中的菌種接種到種子培養基中，在35-38°C，200rpm 條件下培養20-24小時；將上述種子按照2-10%的接種量接種到發酵培養基中，在pH 5. 0-7. 0、35-38°C、200-300rpm、0. 02-0. 5vvm通空氣條件下，通過分步糖化發酵或同步糖化發酵兩種工藝進行發酵。
所述的分步糖化發酵工藝是先將菊芋汁或菊芋漿經菊糖酶糖化制成菊糖水解液， 其中菊糖酶的添加量為ιο-ιοου/g菊芋干重，然后以菊糖水解液為底物，進行批式發酵或批式流加發酵。
所述的同步糖化發酵工藝是以菊芋汁或漿為底物，在發酵接種的同時加入菊糖酶，其中菊糖酶的添加量為ιο-ιοου/g菊芋干重，進行批式發酵或批式流加發酵。
采用這兩種發酵工藝，可得到2，3-BD的最終濃度為49-105g/L ；2，3_BD與乙偶姻的最終濃度之和為60-115g/L。
本發明的效果和益處是本發明所用原料種植范圍廣泛，且不與糧食爭地、價格低廉，可顯著地降低微生物發酵生產2，3-BD的成本；采用批式流加的發酵方式，可以提高目標產物的濃度；采用同步糖化發酵工藝，可以減輕高濃度底物的抑制作用、節省發酵時間、 提高生產效率，并容易形成規模化生產，是一種資源高值化利用的新技術。
具體實施方式
以下結合技術方案詳細敘述本發明的具體實施例。
本實施例中所用菌種為克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)，中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)保藏，保藏號CICC No. 10011。具體實例如下
實施例1
以菊芋汁為原料采用分步糖化發酵工藝
將菊芋塊莖清洗、壓榨、濃縮調漿得到菊芋汁，將菊芋濃汁在55°C、pH 6. 0條件下，加入30U/g菊芋干重的菊糖酶，水解12個小時，得到還原糖濃度為254. 2g/L的菊糖水解液；將IL菊糖水解液在115°C單獨滅菌15min，冷卻后與500mL滅菌的發酵培養基中無機鹽成分混合；將培養22小時的種子按照5%的接種量接入，發酵培養在37°C、300rpm、 pH6. 0、通氣量為0. Ivvm條件下進行；培養方式采用批式流加發酵的方式，當殘留還原糖濃度低于50g/L時，補加還原糖濃度為368g/L的菊糖水解液200ml，發酵共進行72小時，發酵液中2，3-BD的最終濃度為68. 06g/L ；2,3-BD與乙偶姻的最終濃度之和為87. 08g/L。
實施例2
以菊芋粉為原料采用分步糖化發酵工藝
為方便儲存，將菊芋塊莖清洗、干燥、粉碎制成菊芋粉，使用前加水調成漿；將 400g菊芋粉加水調制成漿定容到1L，在55°C、pH6. 0條件下，加入30U/g菊芋干重的菊糖酶，水解12個小時，得到還原糖濃度為M6. 50g/L的菊糖水解液；將其在115°C條件下單獨滅菌15min，冷卻后與500mL滅菌的發酵培養基中無機鹽成分混合；將培養22小時的種子按5%的接種量接入，發酵培養在37°C、300rpm、pH6. 0、通氣量為0. Ivvm條件下進行；培養方式采用批式發酵的方式，發酵共進行56小時，發酵液中2，3-BD的最終濃度為49. 68g/L ； 2,3-BD與乙偶姻的最終濃度之和為62. 25g/L，生產強度為1. llg/(L · h)。
實施例3
以菊芋粉為原料采用同步糖化發酵工藝
將400g菊芋粉加水調制成漿定容到1L，將其在115°C條件下單獨滅菌15min，冷卻后與500mL滅菌的發酵培養基中無機鹽成分混合；將培養22小時的種子按5%的接種量接入，與此同時接入經過膜除菌的糖化酶，糖化酶的添加量為30U/g菊芋干重；發酵培養在37°C、300rpm、pH6. 0、通氣量為0. Ivvm條件下進行；培養方式采用批式發酵的方式；在發酵Mh時，發酵液中2，3-BD的濃度為48. 95g/L，2，3-BD與乙偶姻的濃度之和就已經達到了 53. 91g/L，發酵40h時2,3-BD的濃度為70. llg/L, 2,3-BD與乙偶姻的濃度之和高達 81.59g/L，生產強度為2.04g/(L*h)。整個發酵過程中，還原糖的濃度維持在16-38g/L。與實施例二相比，菌體生長狀況更好，發酵時間明顯縮短，2，3-BD和乙偶姻的生產強度有很大的提高。
權利要求
1.一種以菊芋為原料發酵生產2，3-丁二醇的方法，是分別以菊芋汁、漿或菊糖水解液為原料，與滅菌后的無機鹽成分混合，接入產2，3-丁二醇的菌種，通過分步糖化發酵或同步糖化發酵兩種工藝，得到較高的2，3-丁二醇濃度，其特征在于如下步驟(1)原料制備和處理以菊芋塊莖為原料，將其制備成菊芋汁或菊芋漿，向菊芋汁、漿中添加菊糖酶，加酶量為10-100U/g菊芋干重，在55-60°C，pH6. 0條件下，水解2_20小時， 制成菊糖水解液，其中還原糖濃度范圍120-400g/L ；(2)培養基種子培養基是將(1)中菊糖水解液與無機鹽營養成分分別在115-121°C條件下滅菌 15-20min，冷卻后混合得到；發酵培養基是將(1)中的菊芋汁、漿或菊糖水解液與無機鹽營養成分分別在 115-121°C條件下滅菌15-20min，冷卻后混合得到；(3)菌種采用的菌種為克雷伯氏菌屬(Klebsiellapneumoniae)，CICC No. 10011 ；(4)發酵培養經活化后(3)中的菌種接種到種子培養基中，在35-38°C，200rpm條件下培養20-24小時；將上述種子按照2-10%的接種量接種到發酵培養基中，在pH 6. 0、 35-38°C、200-300rpm、0. 1-0. 5vvm通空氣條件下進行發酵。
2.根據權利要求
1所述的一種以菊芋為原料發酵生產2，3-丁二醇的方法，其特征在于所述的發酵培養采用分步糖化發酵工藝或同步糖化發酵工藝分步糖化發酵工藝是先將菊芋汁或菊芋漿經菊糖酶糖化制成菊糖水解液，然后以菊糖水解液為底物，進行批式發酵或批式流加發酵；同步糖化發酵工藝是以菊芋汁或漿為底物，在發酵接種的同時加入菊糖酶， 進行批式發酵或批式流加發酵。
專利摘要
本發明公開了一種以菊芋為原料發酵生產2，3-丁二醇的方法，屬于生物化工技術領域：
。其特征是以菊芋塊莖為原料，將其制備成菊芋汁或菊芋漿，向菊芋汁、漿中添加菊糖酶，可得到菊糖水解液。分別以菊芋汁、漿或菊糖水解液為碳源，與滅菌后的無機鹽營養成分混合，接入產2，3-丁二醇的菌種，通過分步糖化發酵或同步糖化發酵兩種工藝，可得到較高的2，3-丁二醇濃度。本發明的效果和益處是可降低微生物發酵生產2，3-丁二醇的原料成本，提高生產效率，可得到2，3-BD的最終濃度為49-105g/L；2，3-BD與乙偶姻的最終濃度之和為60-115g/L。
文檔編號C12P7/18GKCN101289680 B發布類型授權 專利申請號CN 200810011692
公開日2012年5月23日 申請日期2008年6月2日
發明者修志龍, 孫麗慧, 孫亞琴, 戴建英, 王旭東 申請人:大連理工大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (3),