本發明(ming)屬于生物檢測，具體涉及(ji)一種(zhong)同(tong)時檢測引(yin)起腦炎的6種(zhong)病原體的多重(zhong)rt-pcr方法及(ji)試劑盒(he)和(he)應用。

背景技術：

1、腦(nao)(nao)炎(yan)(encephalitis)是(shi)(shi)指腦(nao)(nao)實質受(shou)(shou)病(bing)(bing)(bing)(bing)原體(ti)侵襲導致的(de)(de)炎(yan)癥(zheng)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)病(bing)(bing)(bing)(bing)變。根(gen)(gen)據(ju)病(bing)(bing)(bing)(bing)因涉(she)及(ji)范(fan)圍的(de)(de)不同有廣(guang)義(yi)與(yu)狹義(yi)之(zhi)分。狹義(yi)指腦(nao)(nao)實質受(shou)(shou)病(bing)(bing)(bing)(bing)原微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)直接侵犯所引起(qi)的(de)(de)炎(yan)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)改變。通(tong)(tong)常(chang)采用狹義(yi)概(gai)念(nian)。絕大(da)數的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)因是(shi)(shi)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒，也可(ke)由細菌、霉(mei)菌、螺(luo)旋(xuan)體(ti)、立克次氏體(ti)、寄生(sheng)(sheng)蟲等(deng)(deng)感染引起(qi)，有的(de)(de)可(ke)能是(shi)(shi)變態(tai)反(fan)應(ying)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)疾病(bing)(bing)(bing)(bing)，如急(ji)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)播散性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)腦(nao)(nao)脊髓(sui)炎(yan)。通(tong)(tong)常(chang)所謂的(de)(de)腦(nao)(nao)炎(yan)多(duo)(duo)指病(bing)(bing)(bing)(bing)毒性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)腦(nao)(nao)炎(yan)和屬(shu)于(yu)急(ji)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)播散腦(nao)(nao)脊髓(sui)炎(yan)的(de)(de)感染后腦(nao)(nao)脊髓(sui)炎(yan)。按(an)照病(bing)(bing)(bing)(bing)程(cheng)分為急(ji)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)、亞(ya)急(ji)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)、慢性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)；按(an)照病(bing)(bing)(bing)(bing)原微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)分為細菌性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)、真菌性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)、病(bing)(bing)(bing)(bing)毒性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)等(deng)(deng)；根(gen)(gen)據(ju)流行(xing)情況分為流行(xing)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)與(yu)散發性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)。腦(nao)(nao)炎(yan)可(ke)以發病(bing)(bing)(bing)(bing)于(yu)不同性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)別和年齡，多(duo)(duo)為急(ji)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)或亞(ya)急(ji)性(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)(xing)。臨床(chuang)上以高(gao)熱、頭痛、嘔(ou)吐(tu)、昏迷、驚厥等(deng)(deng)癥(zheng)狀(zhuang)為其(qi)特征，大(da)多(duo)(duo)伴(ban)有腦(nao)(nao)脊液成(cheng)分的(de)(de)改變。應(ying)根(gen)(gen)據(ju)不同病(bing)(bing)(bing)(bing)因進行(xing)防治。

2、目前診(zhen)斷腦(nao)炎的常用(yong)方式為頭顱ct或者核磁共振(zhen)可(ke)顯示腦(nao)部(bu)病(bing)變(bian)部(bu)位，腦(nao)脊液培養(yang)可(ke)確(que)定病(bing)原體(ti)(ti)、還有血常規等手段，但除了培養(yang)法(fa)之外均(jun)無法(fa)確(que)定何(he)種病(bing)原體(ti)(ti)感染，且培養(yang)時間(jian)長，成功率低(di)，無法(fa)滿足臨床快速(su)診(zhen)療(liao)的需求。熒(ying)光定量pcr法(fa)能夠快速(su)明確(que)何(he)種病(bing)原體(ti)(ti)感染，能夠針對性使用(yong)藥(yao)物治療(liao)，能夠幫助(zhu)臨床診(zhen)療(liao)。

3、病因分為：

4、1.病毒

5、病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)不(bu)(bu)具(ju)備細胞(bao)結構(gou)，根據(ju)核(he)酸(suan)成分(fen)(fen)的不(bu)(bu)同分(fen)(fen)為兩類：一(yi)為脫氧核(he)糖核(he)酸(suan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(dna病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du))：包括微(wei)(wei)小病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、乳頭多瘤空泡(pao)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(引起進(jin)行性(xing)(xing)(xing)(xing)多灶性(xing)(xing)(xing)(xing)白質(zhi)腦(nao)(nao)(nao)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing))、腺病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、皰(pao)疹(zhen)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、水痘-帶狀(zhuang)(zhuang)皰(pao)疹(zhen)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)。另一(yi)為核(he)糖核(he)酸(suan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(rna病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du))：包括微(wei)(wei)小核(he)糖核(he)酸(suan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(脊(ji)髓灰質(zhi)炎(yan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、柯薩奇病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、echo病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du))、蟲媒病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、正黏病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(流行性(xing)(xing)(xing)(xing)感冒病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du))、副(fu)黏病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(麻疹(zhen)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)和腮腺炎(yan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du))、沙粒病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(淋巴細胞(bao)脈(mo)絡叢腦(nao)(nao)(nao)膜(mo)炎(yan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du))、彈(dan)狀(zhuang)(zhuang)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)(狂犬(quan)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du))。病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)性(xing)(xing)(xing)(xing)腦(nao)(nao)(nao)炎(yan)按起病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)緩急(ji)可分(fen)(fen)為急(ji)性(xing)(xing)(xing)(xing)、亞(ya)急(ji)性(xing)(xing)(xing)(xing)和慢性(xing)(xing)(xing)(xing)腦(nao)(nao)(nao)炎(yan)。按病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)種(zhong)類和感染途(tu)徑可分(fen)(fen)為蟲媒病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、腸道(dao)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、呼(hu)吸道(dao)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)、皰(pao)疹(zhen)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)腦(nao)(nao)(nao)炎(yan)等。根據(ju)發病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)情況(kuang)又可分(fen)(fen)為流行性(xing)(xing)(xing)(xing)、散發性(xing)(xing)(xing)(xing)腦(nao)(nao)(nao)炎(yan)。一(yi)般(ban)認為急(ji)性(xing)(xing)(xing)(xing)腦(nao)(nao)(nao)炎(yan)代表(biao)急(ji)性(xing)(xing)(xing)(xing)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)感染，而亞(ya)急(ji)性(xing)(xing)(xing)(xing)或(huo)慢性(xing)(xing)(xing)(xing)發病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)的如(ru)亞(ya)急(ji)性(xing)(xing)(xing)(xing)硬化性(xing)(xing)(xing)(xing)全(quan)腦(nao)(nao)(nao)炎(yan)、皮質(zhi)紋(wen)狀(zhuang)(zhuang)體(ti)脊(ji)髓變性(xing)(xing)(xing)(xing)代表(biao)慢性(xing)(xing)(xing)(xing)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)(du)(du)(du)(du)(du)感染。

6、2.其他

7、細菌(jun)(jun)(jun)(jun)(桿菌(jun)(jun)(jun)(jun)狀(zhuang)巴(ba)爾(er)通體(ti)(ti)(奧(ao)羅亞(ya)(ya)熱(re))、巴(ba)爾(er)通體(ti)(ti)及(ji)該(gai)屬其(qi)他種(zhong)類(lei)細菌(jun)(jun)(jun)(jun)(貓抓病(bing))、單核細胞增多性(xing)(xing)李(li)斯特(te)菌(jun)(jun)(jun)(jun)、肺炎(yan)支原體(ti)(ti)、革(ge)蘭(lan)陽性(xing)(xing)棒狀(zhuang)桿菌(jun)(jun)(jun)(jun)、結核分枝桿菌(jun)(jun)(jun)(jun))、立(li)克次體(ti)(ti)(粒細胞埃克次體(ti)(ti)、q熱(re)立(li)克次體(ti)(ti)、查菲埃立(li)克次體(ti)(ti)、立(li)氏立(li)克次體(ti)(ti)、伯氏疏螺旋體(ti)(ti)、梅毒螺旋體(ti)(ti))真(zhen)菌(jun)(jun)(jun)(jun)(球孢子菌(jun)(jun)(jun)(jun)、新型(xing)隱球、莢膜(mo)組織胞漿菌(jun)(jun)(jun)(jun))、寄生蟲(chong)(chong)(阿米(mi)巴(ba)屬、惡性(xing)(xing)瘧原蟲(chong)(chong)、弓(gong)形蟲(chong)(chong)、布(bu)氏錐蟲(chong)(chong)岡(gang)比亞(ya)(ya)亞(ya)(ya)種(zhong)、布(bu)氏錐蟲(chong)(chong)伊氏亞(ya)(ya)種(zhong)、浣熊貝利斯蛔蟲(chong)(chong)、顎口線蟲(chong)(chong)屬、豬帶絳蟲(chong)(chong))等(deng)都可引(yin)起腦炎(yan)。

8、臨床表現為

9、1.全(quan)身毒血癥狀(zhuang)

10、發熱(re)、頭痛、身(shen)痛、惡心、嘔吐、乏力。少數(shu)有出血疹及(ji)心肌炎表現。

11、2.神經系(xi)統癥(zheng)狀(zhuang)

12、意識(shi)障礙，腦膜刺激征。可(ke)出現頸肌(ji)及肩胛肌(ji)弛(chi)緩(huan)性癱(tan)瘓(huan)，以致頭下(xia)垂及手(shou)臂(bei)不能上舉，搖(yao)搖(yao)無依(yi)。腦神經及下(xia)肢受累少(shao)見。癱(tan)瘓(huan)2～3周(zhou)可(ke)恢(hui)復，約半數肌(ji)肉萎(wei)縮。輕癥可(ke)無明(ming)顯神經癥狀(zhuang)。

13、由于病(bing)變(bian)的(de)部位及(ji)病(bing)變(bian)程度(du)輕重不等，故表現(xian)多(duo)種多(duo)樣。彌漫型腦(nao)炎(yan)常(chang)先有全身(shen)不適，很快即出(chu)現(xian)昏迷、驚厥，同時(shi)伴(ban)有發(fa)熱；腦(nao)干型腦(nao)炎(yan)常(chang)有面(mian)神(shen)經癱瘓(huan)(huan)、嗆咳、吞咽困難、肢(zhi)體麻(ma)木、無力和(或)動眼神(shen)經麻(ma)痹(bi)、假性(xing)球(qiu)麻(ma)痹(bi)等表現(xian)。假腫(zhong)瘤型腦(nao)炎(yan)常(chang)有頭痛(tong)、嘔吐(tu)，肢(zhi)體活動差或癱瘓(huan)(huan)、失語、精神(shen)癥狀(zhuang)，顱(lu)內(nei)高壓等。同時(shi)注意原(yuan)發(fa)病(bing)癥狀(zhuang)，如(ru)腮腺炎(yan)病(bing)毒(du)腦(nao)炎(yan)伴(ban)有腮腺腫(zhong)大(da)；皰(pao)疹性(xing)病(bing)毒(du)腦(nao)炎(yan)時(shi)皮膚有皰(pao)疹，柯薩基病(bing)毒(du)和埃可病(bing)毒(du)腦(nao)炎(yan)時(shi)可有皮疹、心(xin)肌(ji)炎(yan)、手足口病(bing)等，如(ru)病(bing)變(bian)累及(ji)腦(nao)膜(腦(nao)膜腦(nao)炎(yan))，出(chu)現(xian)腦(nao)膜刺激征陽性(xing)。

14、pcr技術的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)本原(yuan)理類似于dna的(de)(de)(de)(de)(de)(de)天然復(fu)(fu)制(zhi)過(guo)程(cheng)(cheng)，其特(te)異性(xing)依(yi)賴于與靶序(xu)列(lie)(lie)(lie)兩(liang)端互(hu)補的(de)(de)(de)(de)(de)(de)寡核(he)苷酸引(yin)物(wu)，pcr由變性(xing)-退火(huo)-延伸三個基(ji)(ji)本反應(ying)步驟(zou)構成：①模(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)dna的(de)(de)(de)(de)(de)(de)變性(xing)：模(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)dna經加熱(re)至93℃左右(you)一定時(shi)間(jian)后(hou)，使模(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)dna雙鏈(lian)或經pcr擴增(zeng)形成的(de)(de)(de)(de)(de)(de)雙鏈(lian)dna解離，使之成為單鏈(lian)，以(yi)便它與引(yin)物(wu)結(jie)合(he)，為下(xia)輪(lun)反應(ying)作(zuo)(zuo)準(zhun)備；②模(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)dna與引(yin)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)退火(huo)(復(fu)(fu)性(xing))：模(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)dna經加熱(re)變性(xing)成單鏈(lian)后(hou)，溫度降至55℃左右(you)，引(yin)物(wu)與模(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)dna單鏈(lian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)互(hu)補序(xu)列(lie)(lie)(lie)配(pei)對(dui)結(jie)合(he)；③引(yin)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)延伸：dna模(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)-引(yin)物(wu)結(jie)合(he)物(wu)在72℃、dna聚合(he)酶(mei)(如taqdna聚合(he)酶(mei))的(de)(de)(de)(de)(de)(de)作(zuo)(zuo)用下(xia)，以(yi)dntp為反應(ying)原(yuan)料，靶序(xu)列(lie)(lie)(lie)為模(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)，按(an)堿基(ji)(ji)互(hu)補配(pei)對(dui)與半保留復(fu)(fu)制(zhi)原(yuan)理，合(he)成一條新(xin)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)與模(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)dna鏈(lian)互(hu)補的(de)(de)(de)(de)(de)(de)半保留復(fu)(fu)制(zhi)鏈(lian)，重(zhong)復(fu)(fu)循(xun)環(huan)變性(xing)-退火(huo)-延伸三過(guo)程(cheng)(cheng)就可獲得更多(duo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)“半保留復(fu)(fu)制(zhi)鏈(lian)”，而且這種新(xin)鏈(lian)又可成為下(xia)次循(xun)環(huan)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)模(mo)板(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)。每完成一個循(xun)環(huan)需2～4分鐘，2～3小時(shi)就能將待擴目的(de)(de)(de)(de)(de)(de)基(ji)(ji)因擴增(zeng)放大幾(ji)百萬(wan)倍(bei)。因此，相比于傳(chuan)統的(de)(de)(de)(de)(de)(de)檢測手段(duan)熒光定量pcr技術具有靈(ling)敏性(xing)高，特(te)異性(xing)高的(de)(de)(de)(de)(de)(de)優(you)點。

技術實現思路

1、為解決上述問題，本(ben)發明(ming)公開了一(yi)種(zhong)(zhong)同(tong)時(shi)檢測引(yin)起腦炎(yan)的(de)6種(zhong)(zhong)病(bing)原體的(de)多重rt-pcr方法及試劑盒，其能夠同(tong)時(shi)對6種(zhong)(zhong)易(yi)引(yin)起腦炎(yan)的(de)病(bing)原體進(jin)行快速檢測，具(ju)有非常高的(de)靈敏度。

2、為(wei)達到(dao)上述目(mu)的，本(ben)發明的技術(shu)方案如下：

3、本發(fa)明提供一種同時檢測(ce)引起腦炎的6種病(bing)原體(ti)的多重(zhong)rt-pcr試(shi)(shi)(shi)劑(ji)盒(he)，包括管(guan)1試(shi)(shi)(shi)劑(ji)、管(guan)2試(shi)(shi)(shi)劑(ji)和(he)tap酶；所述管(guan)1試(shi)(shi)(shi)劑(ji)、管(guan)2試(shi)(shi)(shi)劑(ji)包括pcr引物(wu)探針緩(huan)沖液、病(bing)原體(ti)引物(wu)探針、人dna內(nei)參(can)引物(wu)探針；其(qi)中，管(guan)1試(shi)(shi)(shi)劑(ji)內(nei)靶標為(wei)單純皰(pao)疹病(bing)毒(du)、eb病(bing)毒(du)、柯薩(sa)奇病(bing)毒(du)，管(guan)2試(shi)(shi)(shi)劑(ji)內(nei)靶標為(wei)腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿(gan)(gan)菌、結核分枝桿(gan)(gan)菌；

4、所述pcr引物探針(zhen)緩沖液包(bao)括：

5、單純皰疹(zhen)病毒(du)的正(zheng)向pcr擴(kuo)增(zeng)引(yin)物(wu)、反(fan)向pcr擴(kuo)增(zeng)引(yin)物(wu)、檢測探針；

6、eb病毒(du)的正向pcr擴增引物、反向pcr擴增引物、檢測探(tan)針；

7、柯薩奇(qi)病毒的正(zheng)向pcr擴(kuo)增(zeng)引物、反向pcr擴(kuo)增(zeng)引物、檢測(ce)探針；

8、腦膜炎奈瑟(se)菌的正向(xiang)pcr擴(kuo)增(zeng)引(yin)物、反向(xiang)pcr擴(kuo)增(zeng)引(yin)物、檢測探針；

9、流(liu)感嗜血桿(gan)菌的正向(xiang)pcr擴(kuo)增引(yin)物(wu)、反向(xiang)pcr擴(kuo)增引(yin)物(wu)、檢測探針；

10、結(jie)核分枝桿(gan)菌的正(zheng)向pcr擴(kuo)增引(yin)物、反向pcr擴(kuo)增引(yin)物、檢測探針；

11、人dna內參(can)的正向pcr擴(kuo)增(zeng)引(yin)物、反向pcr擴(kuo)增(zeng)引(yin)物、檢(jian)測探(tan)針；

12、單純皰(pao)疹(zhen)病毒的正向pcr擴增(zeng)引(yin)物(wu)(wu)、反向pcr擴增(zeng)引(yin)物(wu)(wu)及檢測探針(zhen)的序列(lie)分別(bie)如seq?id?no.1～seq?id?no.3所示；

13、eb病毒(du)的(de)(de)正(zheng)向pcr擴增(zeng)引物、反(fan)向pcr擴增(zeng)引物及檢測探針(zhen)的(de)(de)序(xu)列分(fen)別如seq?idno.4～seq?id?no.6所示；

14、柯薩奇病毒的(de)正向pcr擴增(zeng)引物、反(fan)向pcr擴增(zeng)引物及檢測探針的(de)序列分別如seqid?no.7～seq?id?no.9所示；

15、腦膜炎奈瑟菌(jun)的正向(xiang)pcr擴(kuo)增引物(wu)、反向(xiang)pcr擴(kuo)增引物(wu)及(ji)檢測探針的序(xu)列分別如seq?id?no.10～seq?id?no.12所示。

16、流感(gan)嗜血桿菌的(de)正向(xiang)pcr擴增引(yin)物、反向(xiang)pcr擴增引(yin)物及檢測探針(zhen)的(de)序(xu)列分別如seq?id?no.13～seq?id?no.15所示；

17、結(jie)核分枝桿菌的(de)正向pcr擴增(zeng)引物、反向pcr擴增(zeng)引物及檢測(ce)探(tan)針的(de)序列分別如seq?id?no.16～seq?id?no.18所示；

18、人(ren)dna內參的正向(xiang)(xiang)pcr擴增(zeng)引物(wu)(wu)、反向(xiang)(xiang)pcr擴增(zeng)引物(wu)(wu)及檢測探(tan)針(zhen)的序列分(fen)別如seqid?no.19～seq?id?no.21所示；

19、進一步(bu)地，所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)單純皰疹(zhen)病(bing)(bing)毒的(de)檢測(ce)(ce)(ce)探針序列(lie)5’端(duan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)有(you)fam發(fa)光(guang)基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)(tuan)(tuan)，3’端(duan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)有(you)熒(ying)光(guang)淬(cui)滅(mie)基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)(tuan)(tuan)bhq1；所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)eb病(bing)(bing)毒的(de)檢測(ce)(ce)(ce)探針序列(lie)5’端(duan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)有(you)rox發(fa)光(guang)基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)(tuan)(tuan)，3’端(duan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)有(you)熒(ying)光(guang)淬(cui)滅(mie)基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)(tuan)(tuan)bhq2；所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)柯薩奇病(bing)(bing)毒的(de)檢測(ce)(ce)(ce)探針序列(lie)5’端(duan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)有(you)vic發(fa)光(guang)基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)(tuan)(tuan)，3’端(duan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)有(you)熒(ying)光(guang)淬(cui)滅(mie)基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)(tuan)(tuan)bhq1；所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)腦膜炎奈瑟菌(jun)的(de)檢測(ce)(ce)(ce)探針序列(lie)5’端(duan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)有(you)fam發(fa)光(guang)基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)(tuan)(tuan)，3’端(duan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)有(you)熒(ying)光(guang)淬(cui)滅(mie)基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)(tuan)(tuan)bhq1；所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)流感嗜血桿菌(jun)的(de)檢測(ce)(ce)(ce)探針序列(lie)5’端(duan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)有(you)rox發(fa)光(guang)基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)(tuan)(tuan)，3’端(duan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)有(you)熒(ying)光(guang)淬(cui)滅(mie)基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)(tuan)(tuan)bhq2；所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)結核分枝桿菌(jun)的(de)檢測(ce)(ce)(ce)探針序列(lie)5’端(duan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)有(you)vic發(fa)光(guang)基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)(tuan)(tuan)，3’端(duan)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)有(you)熒(ying)光(guang)淬(cui)滅(mie)基(ji)(ji)(ji)團(tuan)(tuan)(tuan)(tuan)bhq1；

20、進一步地，所述人dna內參(can)的檢(jian)測探針(zhen)序列5’端標記有(you)cy5發光基團(tuan)，3’端標記有(you)熒光淬滅基團(tuan)bhq2。

21、進一步地(di)，所(suo)(suo)述(shu)管(guan)1試劑的(de)所(suo)(suo)述(shu)細菌(jun)引物(wu)濃度(du)均(jun)為(wei)0.1μm，所(suo)(suo)述(shu)病原(yuan)體探(tan)針濃度(du)為(wei)0.05μm，所(suo)(suo)述(shu)人(ren)(ren)dna內參引物(wu)濃度(du)為(wei)0.06μm，所(suo)(suo)述(shu)管(guan)2試劑的(de)所(suo)(suo)述(shu)細菌(jun)引物(wu)濃度(du)均(jun)為(wei)0.1μm，所(suo)(suo)述(shu)病原(yuan)體探(tan)針濃度(du)為(wei)0.05μm，所(suo)(suo)述(shu)人(ren)(ren)dna內參引物(wu)濃度(du)為(wei)0.06μm，所(suo)(suo)述(shu)人(ren)(ren)dna內參引物(wu)探(tan)針濃度(du)為(wei)0.03μm。

22、進一(yi)步地，所述pcr引物探針緩沖液(ye)具體成分還包括：150mm?tris-hcl，20mm?kcl，10mm?mgcl2，20mm硫酸銨，200μm?dntp，2mm?dtt，3％?dmso，0.03％吐溫(wen)20，余量為無核(he)酸酶水。上述緩沖液(ye)配(pei)置方法為，根據配(pei)置總量將各組分按比例稱量好(hao)后，全部溶(rong)解(jie)混勻后即配(pei)置完(wan)成，taq酶單獨分裝。

23、進一步地，進行pcr反應時，病原體(ti)的每條特(te)異性引物(wu)的終濃(nong)(nong)度為(wei)5-15umol；優(you)選地，病原體(ti)的每條特(te)異性引物(wu)的終濃(nong)(nong)度為(wei)10umol。

24、本(ben)發明還提供一種(zhong)同時引起腦炎(yan)的6種(zhong)病原體(ti)的多重rt-pcr檢測方法，包括以(yi)采(cai)集(ji)樣本(ben)并提取核(he)酸和以(yi)提取的核(he)酸為模板(ban)進行實時熒光(guang)定量pcr反應并采(cai)集(ji)熒光(guang)，具(ju)體(ti)包括以(yi)下步驟：

25、步驟(zou)(1)：將樣本(ben)使用(yong)(yong)核(he)酸提(ti)(ti)取(qu)試劑盒(磁珠法)(廠(chang)家(jia)：愛科(ke)睿特生物醫療(liao)科(ke)技(南京)有(you)限公(gong)司(si)備(bei)案(an)號(hao)(hao)：蘇寧械備(bei)20230070)，使用(yong)(yong)核(he)酸提(ti)(ti)取(qu)儀(型號(hao)(hao)：bnp32廠(chang)家(jia)：山東博弘基因科(ke)技有(you)限公(gong)司(si)，魯濟械備(bei)20200597號(hao)(hao))，按照如下表1提(ti)(ti)取(qu)程(cheng)序將樣本(ben)提(ti)(ti)取(qu)成核(he)酸備(bei)用(yong)(yong)。

26、表1

27、

28、步驟(zou)(2)：將樣本提取模板、無rnase水(陰性對(dui)照)、陽性質控品(陽性對(dui)照)各(ge)5μl分別加入(ru)不同的pcr反(fan)應管(guan)中(zhong)(zhong)，并向(xiang)各(ge)管(guan)中(zhong)(zhong)加入(ru)pcr引(yin)物探針緩(huan)沖液13.5μl、hot?start?taq酶1.5μl配成體系，蓋好管(guan)蓋，放入(ru)熒(ying)光定量(liang)pcr儀(yi)中(zhong)(zhong)進行熒(ying)光pcr檢測；

29、步驟(3)；設置儀器中的pcr擴(kuo)增反應條件：50℃5分鐘-3.1℃/s；95℃2秒(miao)鐘-3.1℃/s；95℃1秒(miao)鐘-3.1℃/s，60℃10秒(miao)鐘-2.38℃/s并采集熒光，循環40次；

30、步驟(4)：步驟(3)反應完成后，基線(xian)設定(ding)為自動(dong)調整，根據擴增曲線(xian)圖和ct值對檢測結果進行(xing)分析；

31、步驟(5)有效性(xing)判定：無(wu)rnase水(shui)檢(jian)測出的ct值(zhi)為(wei)undet或(huo)40，且陽(yang)性(xing)質控品檢(jian)測出的ct值(zhi)≤38，否則實驗視為(wei)無(wu)效；

32、步驟(6)：結果判(pan)讀：

33、樣(yang)本(ben)檢測(ce)孔(kong)ct值為(wei)undet或40，該樣(yang)本(ben)結果(guo)判斷為(wei)陰性，樣(yang)本(ben)dna/rna提取失(shi)敗、待測(ce)樣(yang)本(ben)中不含dna/rna或含量低于檢測(ce)限；

34、樣(yang)本(ben)檢(jian)測孔ct值≤38，該樣(yang)本(ben)結(jie)果(guo)判(pan)斷為對應的病(bing)原體(ti)陽(yang)性，樣(yang)本(ben)檢(jian)測成功；

35、樣(yang)本檢測孔ct值為38-40，需要復檢一次，如果ct值仍為38-40，則(ze)判(pan)斷為陰(yin)性。

36、本發明還(huan)提(ti)供了如上所述同時檢測(ce)引起腦炎的6種病原體(ti)的多重rt-pcr試劑盒在(zai)咽(yan)拭子樣本和痰(tan)液樣本檢測(ce)中的應用。

37、本發明的有(you)益(yi)效(xiao)果(guo)為(wei)：

38、本(ben)發(fa)明(ming)的(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)方(fang)法及(ji)試劑盒(he)，同時(shi)針對(dui)6種(zhong)容易引起腦(nao)(nao)炎(yan)的(de)(de)病(bing)(bing)原(yuan)體(ti)，單純(chun)皰疹病(bing)(bing)毒(du)(du)、eb病(bing)(bing)毒(du)(du)、柯薩(sa)奇(qi)病(bing)(bing)毒(du)(du)、腦(nao)(nao)膜(mo)炎(yan)奈瑟菌(jun)、流感嗜(shi)血桿(gan)菌(jun)、結(jie)核(he)分枝桿(gan)菌(jun)進行檢(jian)(jian)(jian)測(ce)，具有(you)較高(gao)的(de)(de)靈敏(min)度，較高(gao)的(de)(de)特(te)異性(xing)，并具有(you)極短的(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)時(shi)間(jian)，提(ti)(ti)高(gao)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)效(xiao)率；本(ben)試劑盒(he)能夠針對(dui)有(you)呼(hu)吸道癥狀(zhuang)或有(you)類似腦(nao)(nao)炎(yan)癥狀(zhuang)的(de)(de)患(huan)者進行篩查(cha)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)，能夠在感染早期預防腦(nao)(nao)炎(yan)。并且對(dui)于鑒(jian)別診斷何(he)種(zhong)原(yuan)因引起的(de)(de)腦(nao)(nao)炎(yan)有(you)很大的(de)(de)臨床(chuang)意義，減少病(bing)(bing)人痛苦，縮短病(bing)(bing)程，確(que)定(ding)哪(na)種(zhong)細菌(jun)感染后可以針對(dui)性(xing)使(shi)用(yong)針對(dui)性(xing)藥(yao)物進行治(zhi)療(liao)，減少抗生素(su)濫用(yong)。并且本(ben)發(fa)明(ming)將為醫院及(ji)其它醫療(liao)機構提(ti)(ti)供(gong)一種(zhong)靈敏(min)、準確(que)、快速且低成(cheng)本(ben)的(de)(de)檢(jian)(jian)(jian)測(ce)方(fang)案(an)。

39、本發明對(dui)6種容(rong)易引起腦炎(yan)病原體的檢測(ce)：

40、1、確認何種病原(yuan)體感染

41、通過檢咽(yan)拭(shi)子(zi)(zi)、鼻(bi)拭(shi)子(zi)(zi)、痰(tan)液、腦(nao)脊液中(zhong)存在(zai)的病(bing)毒核酸，可以確定患者是否感(gan)染了特定的病(bing)原體，對(dui)于(yu)確診腦(nao)炎(yan)有幫助。能(neng)夠明確因何種原因引起的腦(nao)炎(yan)，精(jing)準治療。

42、2、指導藥物治療

43、在(zai)確定是由何種病原體引起(qi)的(de)腦炎后，可以針對(dui)性(xing)使用藥(yao)物(wu)(wu)，減(jian)少經驗性(xing)用藥(yao)，使用針對(dui)性(xing)的(de)藥(yao)物(wu)(wu)進行治療，有效(xiao)遏制(zhi)抗(kang)生素的(de)濫用。

44、3、流行病學調查(cha)

45、通過核(he)酸檢測，可(ke)(ke)以(yi)對感染病原體的(de)(de)類型、數量(liang)和分布(bu)進行(xing)監測和追蹤，可(ke)(ke)以(yi)了解病原體的(de)(de)傳播途(tu)徑、流行(xing)趨勢和疫情爆發的(de)(de)可(ke)(ke)能性(xing)，從而(er)采取相應的(de)(de)預防和控制措施。

46、4、預防腦炎

47、在感(gan)染(ran)上(shang)述病原(yuan)(yuan)體早(zao)期，出現感(gan)冒癥狀時(shi)便(bian)可進行(xing)檢測，防止病原(yuan)(yuan)體持續感(gan)染(ran)繼發腦(nao)炎。