本發明屬于(yu)分(fen)子(zi)生物學dna標記技術與應用領域，具體涉及一種用于(yu)狼(lang)(lang)尾草(cao)屬牧草(cao)遺傳多樣性(xing)分(fen)析(xi)的(de)srap分(fen)子(zi)標記引物及其在狼(lang)(lang)尾草(cao)屬牧草(cao)遺傳多樣性(xing)分(fen)析(xi)中的(de)應用以及狼(lang)(lang)尾草(cao)屬牧草(cao)遺傳多樣性(xing)分(fen)析(xi)的(de)方(fang)法。

背景技術：

1、相(xiang)關序(xu)列(lie)擴增多態性(xing)(xing)(xing)(xing)(sequence-related?amplified?polymorphism，srap)是一(yi)種新型的(de)(de)(de)基于(yu)(yu)pcr的(de)(de)(de)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)系(xi)統，為顯性(xing)(xing)(xing)(xing)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)，是由(you)美國加(jia)州大學(xue)蔬菜(cai)系(xi)li與quiros博(bo)士于(yu)(yu)2001年在蕓薹屬作物開(kai)發(fa)出(chu)來。該標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)具(ju)有簡便(bian)、高(gao)(gao)效(xiao)、產(chan)率高(gao)(gao)、高(gao)(gao)共顯性(xing)(xing)(xing)(xing)、重復性(xing)(xing)(xing)(xing)好(hao)、易測序(xu)、便(bian)于(yu)(yu)克(ke)隆目標(biao)(biao)片(pian)段(duan)的(de)(de)(de)特點。目前(qian)已成功(gong)地應用(yong)于(yu)(yu)作物遺(yi)傳(chuan)多樣性(xing)(xing)(xing)(xing)分析、遺(yi)傳(chuan)圖譜的(de)(de)(de)構建、重要性(xing)(xing)(xing)(xing)狀的(de)(de)(de)標(biao)(biao)記(ji)(ji)(ji)以及相(xiang)關基因的(de)(de)(de)克(ke)隆等方面。

2、狼(lang)(lang)尾草(cao)(cao)屬(shu)(shu)牧(mu)草(cao)(cao)作(zuo)為(wei)世界重要牧(mu)草(cao)(cao)資源之一，主要包括象草(cao)(cao)、狼(lang)(lang)尾草(cao)(cao)、以及各(ge)種(zhong)種(zhong)間雜(za)交品(pin)(pin)種(zhong)(雜(za)交狼(lang)(lang)尾草(cao)(cao)和雜(za)交象草(cao)(cao))等，狼(lang)(lang)尾草(cao)(cao)屬(shu)(shu)牧(mu)草(cao)(cao)在世界各(ge)地(di)廣泛(fan)種(zhong)植(zhi)，并且育成的(de)新品(pin)(pin)種(zhong)也日漸增多，從而使得(de)品(pin)(pin)種(zhong)間發生了多樣(yang)的(de)遺傳(chuan)分(fen)化(hua)。這(zhe)種(zhong)情況(kuang)下，傳(chuan)統的(de)分(fen)類法(fa)(fa)已經(jing)很難識別這(zhe)些(xie)品(pin)(pin)種(zhong)，近(jin)年來(lai)研究(jiu)者們(men)也開始利用分(fen)子標記技術(shu)對(dui)狼(lang)(lang)尾草(cao)(cao)屬(shu)(shu)牧(mu)草(cao)(cao)進行遺傳(chuan)多樣(yang)性和親緣關系分(fen)析(xi)。但(dan)目前為(wei)止未(wei)見(jian)到srap方法(fa)(fa)對(dui)狼(lang)(lang)尾草(cao)(cao)屬(shu)(shu)牧(mu)草(cao)(cao)品(pin)(pin)種(zhong)進行遺傳(chuan)多樣(yang)性分(fen)析(xi)的(de)研究(jiu)報(bao)道。

3、本研究以(yi)20個狼尾草屬牧草品種(zhong)為(wei)對(dui)象，利(li)用合成的(de)srap分子(zi)標記引物(wu)，進行srap研究其(qi)遺傳多樣性。以(yi)供狼尾草屬牧草種(zhong)質資源保護利(li)用和新品種(zhong)(系(xi))的(de)選育提供分子(zi)水平的(de)參考。

技術實現思路

1、本發明的(de)目的(de)在于(yu)提供一種能夠用于(yu)狼尾草屬牧(mu)草遺(yi)傳(chuan)多樣(yang)性分析的(de)srap分子標記引物體系及其狼尾草屬牧(mu)草遺(yi)傳(chuan)多樣(yang)性分析的(de)方法(fa)。

2、本發(fa)明的(de)(de)目的(de)(de)通過如下技術方案實現：

3、一種用于(yu)狼尾草(cao)屬牧草(cao)遺(yi)傳(chuan)多樣(yang)性分(fen)(fen)析的srap分(fen)(fen)子(zi)標(biao)記引(yin)物，它包括(kuo)8對引(yin)物，8對引(yin)物分(fen)(fen)別為(wei)：

4、me1-em5，其核苷酸序列如seq?id?no.1和seq?id?no.25所示(shi)；

5、me2-em3，其核苷酸序列如seq?id?no.2和seq?id?no.23所示；

6、me3-em5，其核(he)苷酸序列如(ru)seq?id?no.3和seq?id?no.25所示；

7、me4-em3，其(qi)核苷(gan)酸序列如seq?id?no.4和seq?id?no.23所示；

8、me5-em2，其核苷酸序列如seq?id?no.5和seq?id?no.22所示；

9、me6-em7，其核苷酸(suan)序列如seq?id?no.6和seq?id?no.27所示；

10、me7-em2，其核苷酸序列如(ru)seq?id?no.2和seq?id?no.22所(suo)示；

11、me8-em2，其核苷酸序列如(ru)seq?id?no.8和seq?id?no.22所示。

12、本發明合成了多(duo)條srap引(yin)物(wu)(wu)并(bing)(bing)隨(sui)機(ji)分別(bie)選(xuan)出20條正向(xiang)引(yin)物(wu)(wu)和20條反(fan)向(xiang)引(yin)物(wu)(wu)(引(yin)物(wu)(wu)序列見表(biao)2)，并(bing)(bing)進行(xing)優(you)化(hua)，兩(liang)兩(liang)組合成400對引(yin)物(wu)(wu)組合，隨(sui)機(ji)抽取4個提取的dna模(mo)板樣品進行(xing)引(yin)物(wu)(wu)組合篩選(xuan)，最后篩選(xuan)出上述8對引(yin)物(wu)(wu)。

13、本發(fa)明提(ti)供(gong)一(yi)種(zhong)利用(yong)所(suo)(suo)述(shu)的srap分(fen)子標(biao)記引物進行狼尾草(cao)屬(shu)牧草(cao)遺傳多(duo)樣(yang)性分(fen)析的方(fang)法，采(cai)用(yong)所(suo)(suo)述(shu)的srap分(fen)子標(biao)記引物對待檢測的狼尾草(cao)屬(shu)牧草(cao)樣(yang)品dna進行擴(kuo)增、檢測和srap。具體包(bao)括以下步驟：

14、(1)采(cai)用(yong)ctab法(fa)提(ti)取待檢(jian)測樣品的dna備用(yong)；

15、(2)利用權利要(yao)求1所述的srap分子標(biao)記引物(wu)對步驟(1)中提取(qu)的dna樣(yang)品進行擴(kuo)增，分別得到pcr擴(kuo)增產(chan)物(wu)；

16、(3)將所述(shu)步驟(2)得到的pcr擴增(zeng)產物分別進行凝膠(jiao)電泳、成像后，得到對(dui)應的譜(pu)帶信息；

17、(4)根(gen)據所述步驟(3)得到的譜帶信息對(dui)樣品進行聚類分(fen)析，生成聚類圖。

18、步驟(2)中所(suo)述的pcr擴增的反(fan)應體系具體為：2.5μl?10xpcr?buffer、0.5μldntps、0.5μl?taq酶、引物(wu)各1μl和(he)2μl模(mo)板dna，ddh2o補(bu)充到總(zong)體積25μl；

19、所述的(de)(de)引物為權利要求1中(zhong)的(de)(de)所述me1-em5、me2-em3、me3-em5、me4-em3、me5-em2、me6-em7、me7-em2、me8-em2中(zhong)的(de)(de)任意一對。

20、所述pcr擴增的程(cheng)序(xu)(xu)為：pcr程(cheng)序(xu)(xu)：94℃預變性(xing)5min；94℃變性(xing)1min、35℃退火1min、72℃延伸(shen)1min，5個(ge)循環；94℃變性(xing)1min、50℃退火1min、72℃延伸(shen)1min，35個(ge)循環；循環結束后(hou)72℃延伸(shen)10min，4℃保存。擴增反應在美國伯樂pcr儀上進行。

21、所述引物(wu)可合成(cheng)采用熒光(guang)(guang)(guang)引物(wu)，所有擴增產(chan)物(wu)用熒光(guang)(guang)(guang)檢測(ce)。熒光(guang)(guang)(guang)引物(wu)的合成(cheng)以及熒光(guang)(guang)(guang)檢測(ce)屬于本領(ling)域常規的檢測(ce)方法，在(zai)此不作贅述。

22、步驟(4)的具體方法為：

23、由自動測(ce)序儀(yi)377掃(sao)描得(de)到的(de)(de)樣(yang)品(pin)凝(ning)膠圖(tu)，用(yong)(yong)genescan?3.1軟件(jian)分(fen)(fen)析(xi)樣(yang)品(pin)凝(ning)膠圖(tu)，通過binthere軟件(jian)提取樣(yang)品(pin)的(de)(de)各片段大小的(de)(de)結果；excel轉換將(jiang)表內的(de)(de)數(shu)(shu)值不為(wei)(wei)0轉換為(wei)(wei)1(即電泳圖(tu)譜上同一(yi)位置有條帶(dai)出現(xian)(xian)的(de)(de)記(ji)為(wei)(wei)1，同一(yi)位置沒有條帶(dai)出現(xian)(xian)的(de)(de)記(ji)為(wei)(wei)0)，數(shu)(shu)值為(wei)(wei)0的(de)(de)不轉換，從而生成(cheng)由“1”和“0”組成(cheng)的(de)(de)原始矩(ju)(ju)(ju)陣(zhen)；用(yong)(yong)ntsyspc-2.11f軟件(jian)進行(xing)數(shu)(shu)據分(fen)(fen)析(xi)；對原始矩(ju)(ju)(ju)陣(zhen)用(yong)(yong)simqual程序求(qiu)dice相似系數(shu)(shu)矩(ju)(ju)(ju)陣(zhen)，并獲(huo)得(de)相似系數(shu)(shu)矩(ju)(ju)(ju)陣(zhen)；用(yong)(yong)shan程序中的(de)(de)upgma方法(fa)進行(xing)聚類分(fen)(fen)析(xi)，并通過tree?plot模塊生成(cheng)聚類圖(tu)。

24、所述的(de)(de)srap分子標記引(yin)物在(zai)狼(lang)尾草屬(shu)牧草遺(yi)傳多樣(yang)性(xing)分析中(zhong)的(de)(de)應用。

25、較之現有技(ji)術(shu)而(er)言，本發明(ming)的(de)(de)(de)優點(dian)(dian)(dian)在(zai)于：本發明(ming)合(he)(he)(he)成了多條(tiao)(tiao)srap引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)并(bing)隨機分(fen)(fen)別選(xuan)出(chu)20條(tiao)(tiao)正向(xiang)引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)和20條(tiao)(tiao)反向(xiang)引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)，并(bing)進(jin)行優化，兩(liang)兩(liang)組合(he)(he)(he)成400對(dui)引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)組合(he)(he)(he)，隨機抽(chou)取4個(ge)(ge)提(ti)取的(de)(de)(de)dna模板樣(yang)品(pin)進(jin)行引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)組合(he)(he)(he)篩選(xuan)，最后篩選(xuan)出(chu)8對(dui)srap分(fen)(fen)子標(biao)記引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)。這(zhe)8對(dui)srap分(fen)(fen)子標(biao)記引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)擴增條(tiao)(tiao)帶多、多態(tai)(tai)性(xing)豐(feng)富、亮度大、重復性(xing)好，可用(yong)于狼尾草屬(shu)(shu)牧(mu)草品(pin)種(zhong)的(de)(de)(de)遺傳多樣(yang)性(xing)分(fen)(fen)析。這(zhe)8對(dui)srap分(fen)(fen)子標(biao)記引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)對(dui)20個(ge)(ge)狼尾草屬(shu)(shu)品(pin)種(zhong)的(de)(de)(de)pcr擴增，共得(de)到(dao)1278個(ge)(ge)位(wei)點(dian)(dian)(dian)，其中(zhong)多態(tai)(tai)性(xing)位(wei)點(dian)(dian)(dian)有1273個(ge)(ge)，占(zhan)總數(shu)的(de)(de)(de)99.6％。如引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)組合(he)(he)(he)me1-em5擴增得(de)到(dao)的(de)(de)(de)多態(tai)(tai)性(xing)位(wei)點(dian)(dian)(dian)最多達216個(ge)(ge)，引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)組合(he)(he)(he)me3-em5擴增到(dao)的(de)(de)(de)多態(tai)(tai)性(xing)位(wei)點(dian)(dian)(dian)最少有131個(ge)(ge)。平(ping)均位(wei)點(dian)(dian)(dian)數(shu)為(wei)159.8個(ge)(ge)，平(ping)均多態(tai)(tai)性(xing)位(wei)點(dian)(dian)(dian)數(shu)為(wei)159.1個(ge)(ge)。可以看出(chu)選(xuan)取的(de)(de)(de)這(zhe)8對(dui)srap引(yin)(yin)(yin)物(wu)(wu)組合(he)(he)(he)在(zai)狼尾草屬(shu)(shu)牧(mu)草上(shang)多態(tai)(tai)性(xing)極其豐(feng)富，可以進(jin)行遺傳多樣(yang)性(xing)分(fen)(fen)析。

技術特征：

1.一種用于狼(lang)尾草(cao)屬(shu)牧草(cao)遺傳多樣性分析的(de)srap分子標記引物，其特征在(zai)于：包括8對(dui)引物，8對(dui)引物分別為：

2.一(yi)種利(li)用權利(li)要(yao)求1所述的(de)srap分(fen)子(zi)標記引物(wu)進行狼尾(wei)草屬(shu)牧草遺傳(chuan)多樣性分(fen)析的(de)方(fang)法，其特征(zheng)在于：采(cai)用權利(li)要(yao)求1所述的(de)srap分(fen)子(zi)標記引物(wu)對(dui)待檢測(ce)的(de)狼尾(wei)草屬(shu)牧草樣品dna進行擴增、檢測(ce)和分(fen)析。

3.根據權利要求2所述的(de)方法，其特征在于：它包括以(yi)下步驟：

4.根據(ju)權利要求3所述的方法，其特征在于(yu)：步驟(2)中所述的pcr擴增的反應體(ti)系(xi)具體(ti)為：2.5μl?10xpcr?buffer、0.5μl?dntps、0.5μl?taq酶、引物各1μl和1μl模(mo)板(ban)dna，ddh2o補充到總體(ti)積25μl；

5.根據權利要求(qiu)4所述的方法，其特(te)征在于：所述pcr擴(kuo)增的程(cheng)序為：pcr程(cheng)序：94℃預變性5min；94℃變性1min、35℃退(tui)火1min、72℃延(yan)伸(shen)1min，5個循環(huan)；94℃變性1min、50℃退(tui)火1min、72℃延(yan)伸(shen)1min，35個循環(huan)；循環(huan)結束后72℃延(yan)伸(shen)10min，4℃保存。

6.根(gen)據權利要求3所述的(de)(de)方法(fa)，其(qi)特征在于：步驟(4)的(de)(de)具體方法(fa)為(wei)：

7.如(ru)權(quan)利要求1所述(shu)的(de)srap分子標記引物在狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析中(zhong)的(de)應用(yong)。

8.一(yi)種分(fen)析狼尾(wei)草屬牧(mu)草遺傳多(duo)樣(yang)性(xing)(xing)的(de)(de)試(shi)劑盒，其特征在于：它包括權利要求(qiu)1所述的(de)(de)用于狼尾(wei)草屬牧(mu)草遺傳多(duo)樣(yang)性(xing)(xing)分(fen)析的(de)(de)srap分(fen)子標記引物(wu)。

技術總結
本發明涉及一種用于狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析的SRAP分子標記引物及其在狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析中的應用以及狼尾草屬牧草遺傳多樣性分析的方法；所述SRAP分子標記引物，它包括8對引物，8對引物分別為：ME1?EM5，ME2?EM3，ME3?EM5，ME4?EM3，ME5?EM2，ME6?EM7，ME7?EM2，ME8?EM2，本發明篩選出的這8對SRAP分子標記引物擴增條帶多、多態性豐富、亮度大、重復性好，可用于狼尾草屬牧草品種的遺傳多樣性分析。這8對SRAP分子標記引物對20個狼尾草屬品種的PCR擴增，共得到1278個位點，其中多態性位點有1273個，占總數的99.6％。如引物組合ME1?EM5擴增得到的多態性位點最多達216個，引物組合ME3?EM5擴增到的多態性位點最少有131個。平均位點數為159.8個，平均多態性位點數為159.1個。可以看出選取的這8對SRAP引物組合在狼尾草屬牧草上多態性極其豐富，可以進行遺傳多樣性分析。

技術研發人員：張曉佩,李文楊,劉遠,高承芳
受保護的技術使用者：福建省農業科學院畜牧獸醫研究所
技術研發日：
技術公布日：2024/10/10