本發明涉及食品安全免(mian)疫檢測領域，尤其是(shi)指(zhi)一種苦參堿半抗(kang)原、雜交瘤細(xi)胞株、抗(kang)體及其應用。

背景技術：

1、苦(ku)參堿(jian)(matrine)是(shi)由豆科植(zhi)物(wu)苦(ku)參的(de)根、莖、果(guo)實經(jing)(jing)乙醇等(deng)(deng)有(you)機溶劑提取的(de)一種生(sheng)(sheng)物(wu)堿(jian)，屬于喹(kui)諾里西(xi)啶類的(de)衍生(sheng)(sheng)物(wu)羽扇豆生(sheng)(sheng)物(wu)堿(jian)類。苦(ku)參堿(jian)具有(you)多(duo)種生(sheng)(sheng)物(wu)活(huo)性，包括免疫調(diao)節、抗(kang)炎、抗(kang)菌、抗(kang)腫瘤等(deng)(deng)。它能(neng)夠(gou)促進巨噬(shi)細(xi)胞吞噬(shi)和增強t淋巴(ba)細(xi)胞增殖，從而提高(gao)機體(ti)免疫力以對抗(kang)感染和疾病。此(ci)外，苦(ku)參堿(jian)還是(shi)一種天然的(de)植(zhi)物(wu)殺蟲(chong)劑，能(neng)夠(gou)防治蔬(shu)菜上(shang)菜青蟲(chong)、菜蚜、瓜蚜、螟蟲(chong)、瓢蟲(chong)、果(guo)樹上(shang)的(de)天慕毛(mao)蟲(chong)、刺蛾(e)、蝽象(xiang)等(deng)(deng)，糧食作(zuo)物(wu)上(shang)粘蟲(chong)、小(xiao)麥吸漿(jiang)蟲(chong)和蝗(huang)蟲(chong)等(deng)(deng)多(duo)種害蟲(chong)。苦(ku)參堿(jian)對害蟲(chong)具有(you)觸殺、胃毒作(zuo)用，施用后可(ke)(ke)麻痹害蟲(chong)的(de)神經(jing)(jing)中(zhong)樞(shu)系統(tong)，導致害蟲(chong)窒息死(si)亡。苦(ku)參堿(jian)作(zuo)用的(de)靶標大，能(neng)抑制抗(kang)藥性的(de)產(chan)生(sheng)(sheng)，對已經(jing)(jing)產(chan)生(sheng)(sheng)抗(kang)性的(de)害蟲(chong)仍有(you)很(hen)強的(de)活(huo)性。研究表明，長(chang)期攝入殘(can)留(liu)苦(ku)參堿(jian)的(de)食品會引(yin)發腹(fu)痛、惡心、嘔吐等(deng)(deng)胃腸道不適(shi)癥(zheng)狀，出現頭暈、胸悶、呼吸困(kun)難等(deng)(deng)情況，甚至可(ke)(ke)能(neng)會引(yin)起溶血反應，損(sun)害肝(gan)腎(shen)功能(neng)。

2、目(mu)前，針對(dui)苦(ku)參堿的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)方(fang)法主(zhu)要為儀器檢(jian)(jian)測(ce)，常用的(de)(de)有液(ye)相色(se)譜法和液(ye)相色(se)譜串聯質譜法。儀器檢(jian)(jian)測(ce)方(fang)法具有很(hen)高的(de)(de)靈敏度和特異性，存(cun)在一些缺(que)點，例如需要徹底的(de)(de)樣品凈化，高溶(rong)劑(ji)消耗，昂貴的(de)(de)設(she)備以(yi)及熟練的(de)(de)技術(shu)人員(yuan)。因此，需要一種快速，簡(jian)單的(de)(de)分(fen)析苦(ku)參堿殘留的(de)(de)檢(jian)(jian)測(ce)方(fang)法。

3、酶(mei)聯免(mian)(mian)疫法(fa)(elisa)是一(yi)種高(gao)(gao)效(xiao)、靈(ling)(ling)敏(min)(min)的(de)(de)(de)檢(jian)測(ce)方法(fa)，檢(jian)測(ce)時(shi)樣(yang)本(ben)(ben)前處理過程(cheng)簡單(dan)(dan)檢(jian)測(ce)成本(ben)(ben)低而(er)且操作簡便，適用(yong)于大(da)量(liang)樣(yang)本(ben)(ben)的(de)(de)(de)現場(chang)快速檢(jian)測(ce)，在(zai)農藥殘(can)留分(fen)析(xi)中得(de)(de)(de)到廣泛(fan)應(ying)用(yong)。酶(mei)聯免(mian)(mian)疫法(fa)檢(jian)測(ce)的(de)(de)(de)前提是得(de)(de)(de)到對目標檢(jian)測(ce)物(wu)具有高(gao)(gao)特異(yi)性(xing)和高(gao)(gao)靈(ling)(ling)敏(min)(min)度(du)的(de)(de)(de)單(dan)(dan)克(ke)(ke)隆(long)抗(kang)(kang)體，因此，制(zhi)備對苦參(can)堿(jian)具有高(gao)(gao)特異(yi)性(xing)和高(gao)(gao)靈(ling)(ling)敏(min)(min)度(du)的(de)(de)(de)單(dan)(dan)克(ke)(ke)隆(long)抗(kang)(kang)體的(de)(de)(de)方法(fa)十分(fen)關鍵。發(fa)明人(ren)嘗試通過雜交(jiao)瘤(liu)(liu)細胞制(zhi)備抗(kang)(kang)苦參(can)堿(jian)單(dan)(dan)克(ke)(ke)隆(long)抗(kang)(kang)體，但在(zai)制(zhi)備能分(fen)泌(mi)抗(kang)(kang)苦參(can)堿(jian)單(dan)(dan)克(ke)(ke)隆(long)抗(kang)(kang)體的(de)(de)(de)雜交(jiao)瘤(liu)(liu)細胞株的(de)(de)(de)過程(cheng)中，如(ru)何(he)制(zhi)備半抗(kang)(kang)原和完全抗(kang)(kang)原、如(ru)何(he)使小鼠產生(sheng)強(qiang)免(mian)(mian)疫，還(huan)需(xu)(xu)進一(yi)步(bu)的(de)(de)(de)研(yan)(yan)究；如(ru)何(he)使得(de)(de)(de)制(zhi)備出的(de)(de)(de)雜交(jiao)瘤(liu)(liu)細胞株能夠成功分(fen)泌(mi)出抗(kang)(kang)苦參(can)堿(jian)單(dan)(dan)克(ke)(ke)隆(long)抗(kang)(kang)體，還(huan)需(xu)(xu)進一(yi)步(bu)的(de)(de)(de)研(yan)(yan)究；如(ru)何(he)使得(de)(de)(de)分(fen)泌(mi)出的(de)(de)(de)單(dan)(dan)克(ke)(ke)隆(long)抗(kang)(kang)體特異(yi)性(xing)強(qiang)、靈(ling)(ling)敏(min)(min)度(du)高(gao)(gao)，也還(huan)需(xu)(xu)進一(yi)步(bu)的(de)(de)(de)研(yan)(yan)究。

技術實現思路

1、為(wei)解(jie)決上述技術問題，本發明提供了一種苦參(can)堿半(ban)抗原、雜交瘤細胞株、抗體(ti)及其(qi)應用。

2、本發(fa)明(ming)通過以下(xia)技術方(fang)案(an)實現：

3、本發明第一(yi)個目(mu)的是提供(gong)一(yi)種苦(ku)參堿半(ban)抗原，所述苦(ku)參堿半(ban)抗原的結(jie)構式為：

4、

5、本發明第二個目的(de)(de)是提供所(suo)述的(de)(de)苦(ku)參堿半(ban)抗原的(de)(de)制(zhi)備方法，包括以下步驟：

6、將槐果堿與4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽在(zai)堿性(xing)(xing)溶(rong)液(ye)中混合(he)反應，得(de)到苦參(can)堿半抗(kang)原。所述堿性(xing)(xing)溶(rong)液(ye)為氫氧(yang)化鈉；所述反應的(de)條(tiao)件為80℃下(xia)攪拌16h。

7、本發明(ming)第二個目的是提(ti)供一種苦參堿人工抗原(yuan)，由所(suo)述的苦參堿半抗原(yuan)與載體蛋白偶聯得(de)到。

8、在本發明的(de)一(yi)些實施例(li)中(zhong)，所述(shu)載體蛋(dan)白(bai)(bai)選自鑰雞卵白(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)、孔血(xue)(xue)藍(lan)蛋(dan)白(bai)(bai)、牛血(xue)(xue)清(qing)白(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)、人血(xue)(xue)清(qing)白(bai)(bai)蛋(dan)白(bai)(bai)、乳鐵(tie)蛋(dan)白(bai)(bai)、辣根過氧化物酶、甲狀腺球蛋(dan)白(bai)(bai)、免疫(yi)球蛋(dan)白(bai)(bai)和激素(su)中(zhong)的(de)至少一(yi)種。

9、本發明第三(san)個目的是(shi)提(ti)供一株(zhu)分(fen)泌苦參堿單克隆抗體的雜(za)交瘤(liu)細胞株(zhu)，其特(te)征在于(yu)，所述雜(za)交瘤(liu)細胞株(zhu)已保(bao)藏于(yu)中(zhong)國(guo)微(wei)生(sheng)物(wu)菌種(zhong)保(bao)藏管(guan)理委(wei)員(yuan)會(hui)普通微(wei)生(sheng)物(wu)中(zhong)心cgmcc，保(bao)藏地址為(wei)北京(jing)市朝陽區(qu)北辰西路1號(hao)(hao)院(yuan)3號(hao)(hao)中(zhong)國(guo)科學院(yuan)微(wei)生(sheng)物(wu)研究所，分(fen)類(lei)命名為(wei)單克隆細胞株(zhu)，保(bao)藏日期為(wei)2024年04月18日，保(bao)藏編號(hao)(hao)為(wei)cgmcc?no.45902。

10、本發明第(di)四個(ge)目(mu)的是(shi)提(ti)供一種苦參堿單克隆抗(kang)體，由所述的雜交(jiao)瘤細(xi)胞(bao)株分泌產生(sheng)。

11、本發(fa)明第(di)五個目的是(shi)提供一(yi)種組合物，所(suo)述(shu)組合物中含有所(suo)述(shu)的雜交瘤細胞株(zhu)和(he)/或(huo)所(suo)述(shu)的苦參(can)堿單克隆抗體。

12、本發明第六(liu)個目的(de)是提供一種苦參堿免疫(yi)檢(jian)測試劑盒，所(suo)述苦參堿免疫(yi)檢(jian)測試劑盒包含所(suo)述雜(za)交瘤細(xi)胞株或(huo)所(suo)述苦參堿單克隆抗體。

13、在本發明的(de)一些(xie)實施(shi)例(li)中，所(suo)述(shu)苦(ku)參(can)堿(jian)(jian)免疫檢測(ce)試劑盒還包含偶聯有信號物質的(de)苦(ku)參(can)堿(jian)(jian)或(huo)所(suo)述(shu)的(de)苦(ku)參(can)堿(jian)(jian)半抗原。

14、在本發(fa)明(ming)的一些實施例中，所(suo)述(shu)苦參堿(jian)(jian)免疫(yi)檢測試劑盒(he)還(huan)包(bao)含酶(mei)(mei)標(biao)板、苦參堿(jian)(jian)包(bao)被抗原、苦參堿(jian)(jian)標(biao)準(zhun)液(ye)、酶(mei)(mei)標(biao)記二抗和底物反(fan)應(ying)液(ye)。

15、在本發(fa)明的一些實施例(li)中，所(suo)述苦(ku)參堿(jian)包被(bei)抗原具(ju)有(you)如(ru)下所(suo)示結(jie)構(gou)：

16、

17、本(ben)發明第七(qi)個(ge)目的(de)是提供(gong)一種苦參堿(jian)檢(jian)測膠體金試(shi)紙(zhi)條(tiao)，所(suo)(suo)述膠體金試(shi)紙(zhi)條(tiao)含有所(suo)(suo)述的(de)雜交瘤細(xi)胞株、所(suo)(suo)述的(de)苦參堿(jian)單(dan)克隆(long)抗體和(he)所(suo)(suo)述的(de)組(zu)合物中的(de)至少一種。

18、在本發明的(de)一些實施(shi)例中(zhong)，所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)苦(ku)(ku)參堿(jian)(jian)檢(jian)測膠體金試紙條，包括樣品墊、膠體金結(jie)合墊、硝(xiao)酸纖維素膜和吸水墊，所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)硝(xiao)酸纖維素膜上(shang)依(yi)次設有檢(jian)測線和質控線，所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)膠體金結(jie)合墊上(shang)包被(bei)所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)苦(ku)(ku)參堿(jian)(jian)單克(ke)隆抗體。所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)檢(jian)測線由苦(ku)(ku)參堿(jian)(jian)包被(bei)抗原(yuan)印制得(de)到。所(suo)(suo)(suo)述(shu)(shu)苦(ku)(ku)參堿(jian)(jian)包被(bei)抗原(yuan)具有如下(xia)所(suo)(suo)(suo)示(shi)結(jie)構(gou)：

19、

20、本(ben)發明第八個目的是提供(gong)所(suo)述(shu)(shu)(shu)的雜交瘤細胞(bao)株(zhu)、所(suo)述(shu)(shu)(shu)的苦參(can)堿(jian)單(dan)克隆(long)抗體(ti)、所(suo)述(shu)(shu)(shu)的組合物、所(suo)述(shu)(shu)(shu)的苦參(can)堿(jian)免(mian)疫檢(jian)測(ce)試劑(ji)盒(he)或所(suo)述(shu)(shu)(shu)的苦參(can)堿(jian)檢(jian)測(ce)膠體(ti)金(jin)試紙條在(zai)檢(jian)測(ce)苦參(can)堿(jian)中的應用。

21、本發明分泌苦參堿單克(ke)隆抗(kang)體的(de)雜交瘤細胞株的(de)制備(bei)方法，包含如下步驟：

22、(1)設計并制備苦參堿(jian)半抗原；

23、(2)制備苦(ku)參堿完全抗(kang)原(yuan)，將獲(huo)得的苦(ku)參堿完全抗(kang)原(yuan)配(pei)制弗氏佐(zuo)劑與不(bu)完全弗氏佐(zuo)劑；

24、(3)將(jiang)得到的(de)弗(fu)氏(shi)佐(zuo)(zuo)(zuo)劑通過背(bei)部皮下注射(she)，注射(she)進入(ru)balb/c小鼠(shu)體內(nei)進行多(duo)次免(mian)疫(yi)，首次免(mian)疫(yi)采用(yong)完全弗(fu)氏(shi)佐(zuo)(zuo)(zuo)劑，加(jia)強免(mian)疫(yi)采用(yong)不完全弗(fu)氏(shi)佐(zuo)(zuo)(zuo)劑；

25、(4)將經過(guo)上述免疫過(guo)程的小鼠(shu)(shu)進行采血，通過(guo)間接(jie)elisa檢測小鼠(shu)(shu)血清免疫效價(jia)和(he)免疫抑制能力，篩選出(chu)血清中苦(ku)參堿抗體含量(liang)高(gao)的獲得免疫的小鼠(shu)(shu)；

26、(5)將(jiang)篩選出的小鼠(shu)用不(bu)完(wan)全(quan)弗氏(shi)佐劑(ji)再進(jin)行最后一次加強免(mian)疫(yi)(yi)，然后通(tong)過腹(fu)腔注(zhu)射進(jin)行沖刺(ci)(ci)免(mian)疫(yi)(yi)，沖刺(ci)(ci)免(mian)疫(yi)(yi)采用不(bu)含弗氏(shi)佐劑(ji)的苦參堿完(wan)全(quan)抗(kang)原進(jin)行；

27、(6)將(jiang)進行(xing)(xing)沖(chong)刺免疫后的(de)balb/c小鼠的(de)脾細(xi)胞(bao)和骨髓(sui)瘤(liu)細(xi)胞(bao)融(rong)合(he)，將(jiang)融(rong)合(he)的(de)細(xi)胞(bao)通過(guo)培養基培養，利用(yong)間(jian)接(jie)elisa檢(jian)測(ce)(ce)陽性細(xi)胞(bao)孔(kong)，并(bing)進一步利用(yong)間(jian)接(jie)競爭elisa法(fa)測(ce)(ce)定陽性細(xi)胞(bao)孔(kong)的(de)抑制效果(guo)，通過(guo)有限(xian)稀釋(shi)法(fa)對有最好(hao)抑制的(de)陽性細(xi)胞(bao)孔(kong)進行(xing)(xing)亞克(ke)隆(long)，最終篩(shai)選出獲得能(neng)分泌苦參堿單克(ke)隆(long)抗體的(de)雜交(jiao)瘤(liu)細(xi)胞(bao)株。

28、在(zai)本發明的上述(shu)制(zhi)備方法中(zhong)，所(suo)述(shu)步(bu)驟(3)、(5)中(zhong)的首次(ci)免疫與加(jia)(jia)強免疫之(zhi)間(jian)間(jian)隔一個月(yue)，加(jia)(jia)強免疫之(zhi)間(jian)間(jian)隔21天，加(jia)(jia)強免疫與沖刺免疫之(zhi)間(jian)間(jian)隔18～21天。

29、在(zai)本發明的(de)上述制備方法中(zhong)，所述步驟(3)、(5)中(zhong)的(de)首次免(mian)疫劑(ji)量(liang)(liang)為(wei)100μg/只(zhi)，加強免(mian)疫劑(ji)量(liang)(liang)為(wei)50μg/只(zhi)，沖(chong)刺免(mian)疫劑(ji)量(liang)(liang)為(wei)25μg/只(zhi)。

30、在本(ben)發明的(de)上述制備方法(fa)中(zhong)，所述步驟3、5中(zhong)的(de)免(mian)疫(yi)(yi)過程，包含1次(ci)首(shou)次(ci)免(mian)疫(yi)(yi)、4次(ci)加(jia)強免(mian)疫(yi)(yi)和1次(ci)沖(chong)刺免(mian)疫(yi)(yi)；

31、在本(ben)發明的(de)上述(shu)制(zhi)備方法中，所(suo)述(shu)步驟4中的(de)采(cai)(cai)血(xue)為第3次(ci)免疫過程結束后第7天進行采(cai)(cai)血(xue)。

32、在(zai)本發(fa)明的上述制備方法中(zhong)，所(suo)述步驟(zou)6中(zhong)的細胞融(rong)合是在(zai)沖刺免疫結(jie)束3天后進行。

33、在本發明的上述制(zhi)備(bei)方(fang)法中(zhong)，所述步驟(zou)6中(zhong)的細胞(bao)融合是(shi)通過聚乙二醇(peg4000)法進行的。

34、在(zai)本發明的上(shang)述(shu)(shu)制備方法(fa)中(zhong)，所述(shu)(shu)步驟6中(zhong)的培(pei)養基(ji)為rpmi-1640培(pei)養基(ji)。

35、在本發明的上述制備方(fang)法中，所述步驟(zou)6中的亞克隆(long)次(ci)數為3次(ci)。

36、本發(fa)明的有益效果(guo)為：

37、本(ben)(ben)發明(ming)提供了一種苦(ku)參(can)(can)堿(jian)(jian)半抗(kang)(kang)原(yuan)、雜(za)交(jiao)瘤細胞株(zhu)、抗(kang)(kang)體(ti)及其應用。本(ben)(ben)發明(ming)提供了分泌(mi)苦(ku)參(can)(can)堿(jian)(jian)單克隆抗(kang)(kang)體(ti)的(de)(de)(de)雜(za)交(jiao)瘤細胞株(zhu)4f12，該雜(za)交(jiao)瘤細胞株(zhu)分泌(mi)產生(sheng)的(de)(de)(de)苦(ku)參(can)(can)堿(jian)(jian)單克隆抗(kang)(kang)體(ti)具有較好親和力、較高(gao)的(de)(de)(de)特異性和較高(gao)靈敏度(ic50值為0.39ng/ml)，可(ke)用于制備苦(ku)參(can)(can)堿(jian)(jian)的(de)(de)(de)免疫檢(jian)測試(shi)劑盒(he)以(yi)及膠體(ti)金試(shi)紙條(tiao)，建立苦(ku)參(can)(can)堿(jian)(jian)的(de)(de)(de)免疫學檢(jian)測方(fang)法，為食品中苦(ku)參(can)(can)堿(jian)(jian)殘(can)留的(de)(de)(de)檢(jian)測提供有力的(de)(de)(de)檢(jian)測方(fang)法。

38、生物材(cai)料保藏：

39、一株分泌苦參堿單克隆(long)抗體(ti)的雜交瘤細胞株bont，已保(bao)藏(zang)于(yu)中(zhong)國(guo)(guo)微生(sheng)物菌種保(bao)藏(zang)管理委員會(hui)普通微生(sheng)物中(zhong)心cgmcc，保(bao)藏(zang)地址北(bei)京市朝陽區北(bei)辰西路1號院(yuan)3號中(zhong)國(guo)(guo)科學院(yuan)微生(sheng)物研究所，分類命名(ming)為單克隆(long)細胞株，保(bao)藏(zang)日期(qi)為2024年04月18日，保(bao)藏(zang)編號為cgmccno.45902。