本(ben)發明涉及一種(zhong)產(chan)γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric?acid，gaba)的(de)(de)乳桿菌(jun)的(de)(de)高(gao)通量(liang)篩選(xuan)(xuan)方(fang)法(fa)，結合(he)產(chan)氣(qi)法(fa)和測定(ding)菌(jun)液ph值兩種(zhong)低成本(ben)且快速的(de)(de)方(fang)法(fa)，使(shi)產(chan)gaba乳桿菌(jun)的(de)(de)篩選(xuan)(xuan)更加(jia)準確高(gao)效。

背景技術：

1、γ-氨(an)(an)基(ji)丁酸(suan)(suan)(suan)(γ-aminobutyric?acid，gaba)是一種由谷氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)脫羧(suo)酶(mei)(glutamatedecarboxylase，gad)催化l-谷氨(an)(an)酸(suan)(suan)(suan)脫羧(suo)產生(sheng)(sheng)的非蛋白質(zhi)氨(an)(an)基(ji)酸(suan)(suan)(suan)，廣泛存在于動(dong)(dong)植物(wu)(wu)和(he)微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)中。gaba被認為是一種具備(bei)食用安全性且具有多(duo)種生(sheng)(sheng)理(li)(li)功能(neng)的生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)活性成分。gaba作為一種主要的抑(yi)制性神經遞質(zhi)，在哺乳(ru)動(dong)(dong)物(wu)(wu)的中樞神經系統種傳送化學信息(xi)，此(ci)外，gaba還具有改善睡眠、抗抑(yi)郁、降血(xue)壓等(deng)多(duo)種生(sheng)(sheng)理(li)(li)功能(neng)。

2、目前，雖然多(duo)種(zhong)食物中(zhong)含有gaba，但(dan)其含量低，無(wu)法滿足人類的(de)需求。而乳桿菌(jun)(jun)作(zuo)為(wei)gaba的(de)重要來源，因其具有生長速度快、所需空間小、發(fa)酵(jiao)易于控制等(deng)眾多(duo)優點，逐漸(jian)走(zou)入人們的(de)視線。并(bing)且，乳桿菌(jun)(jun)是國際公認(ren)的(de)益生菌(jun)(jun)，其發(fa)酵(jiao)產品(pin)的(de)安全(quan)性(xing)已經(jing)過(guo)市場的(de)考驗(yan)。

3、隨(sui)著對gaba的(de)(de)(de)深入(ru)研究(jiu)，gaba的(de)(de)(de)檢測從(cong)定(ding)性到定(ding)量都有了許多(duo)可行的(de)(de)(de)方(fang)(fang)法(fa)，如紙層析法(fa)、薄層色(se)(se)譜法(fa)、分(fen)光(guang)光(guang)度計(ji)比色(se)(se)法(fa)和高效液(ye)相色(se)(se)譜法(fa)等(deng)；但這些(xie)傳統方(fang)(fang)法(fa)中，紙層析法(fa)及薄層色(se)(se)譜法(fa)步(bu)驟較多(duo)、操作較復(fu)雜，高效液(ye)相色(se)(se)譜的(de)(de)(de)成本較高等(deng)；分(fen)光(guang)光(guang)度計(ji)比色(se)(se)法(fa)無法(fa)去除培(pei)養液(ye)中游離銨的(de)(de)(de)干擾，檢測誤差(cha)較大(da)。這次(ci)方(fang)(fang)法(fa)皆存在成本較高或(huo)操作復(fu)雜難(nan)以實(shi)現(xian)高通量的(de)(de)(de)問(wen)題。

4、因此，建(jian)立(li)低成(cheng)本且快速的(de)(de)篩選產gaba乳桿(gan)菌的(de)(de)方法具有重要(yao)意義。

技術實現思路

1、本發明(ming)的(de)一個目(mu)的(de)在于(yu)提供一種篩選產γ-氨基丁酸的(de)乳桿菌的(de)方(fang)法。

2、具體地，本發明提供了(le)一種篩選產(chan)γ-氨(an)基丁(ding)酸(γ-aminobutyric?acid，gaba)的(de)乳桿菌的(de)方法，該方法包括：

3、將待(dai)選乳桿菌在篩選用(yong)培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)(zhong)進行培(pei)養(yang)；其中(zhong)(zhong)，所述篩選用(yong)培(pei)養(yang)基(ji)為(wei)含(han)有谷(gu)氨(an)(an)酸和/谷(gu)氨(an)(an)酸鈉(na)的(de)培(pei)養(yang)基(ji)；

4、根據培養過程中的產(chan)氣情況(kuang)和培養基ph值(zhi)，評估待選(xuan)乳(ru)桿菌產(chan)γ-氨基丁酸的能力(li)。

5、本發明的篩選方法對于乳(ru)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)(jun)具(ju)有普(pu)適性，所述待選乳(ru)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)(jun)可以為(wei)短乳(ru)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)(jun)、植物乳(ru)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)(jun)或(huo)發酵乳(ru)桿(gan)(gan)(gan)菌(jun)(jun)等。

6、根據本發明(ming)的(de)具體實(shi)施方案(an)，本發明(ming)的(de)篩選方法中，所(suo)述篩選用(yong)培(pei)養(yang)基(ji)為液體培(pei)養(yang)基(ji)。

7、根據本發(fa)明的(de)具(ju)體(ti)實施方案(an)，本發(fa)明的(de)篩選方法中，所(suo)述(shu)篩選用培養(yang)(yang)基為含有msg的(de)mrs液(ye)體(ti)培養(yang)(yang)基。更具(ju)體(ti)地，所(suo)述(shu)篩選用培養(yang)(yang)基為含0.3％-3％msg的(de)mrs液(ye)體(ti)培養(yang)(yang)基。

8、根據本發明(ming)的具體實施方案，本發明(ming)的篩選(xuan)方法中(zhong)，所述篩選(xuan)用培(pei)養(yang)基為經過除氣(qi)(qi)(qi)的培(pei)養(yang)基，以(yi)避免培(pei)養(yang)基本身(shen)所含氣(qi)(qi)(qi)體會(hui)對產(chan)氣(qi)(qi)(qi)結果造成干(gan)(gan)擾(rao)。優選(xuan)地，可采(cai)用超聲對培(pei)養(yang)基進行(xing)除氣(qi)(qi)(qi)。此(ci)外(wai)，接菌過程(cheng)種吹吸盡量輕柔，排除培(pei)養(yang)基中(zhong)氣(qi)(qi)(qi)體干(gan)(gan)擾(rao)的同(tong)時，確保(bao)菌株(zhu)接入不會(hui)產(chan)生氣(qi)(qi)(qi)泡。

9、根據本發(fa)(fa)(fa)(fa)明(ming)的(de)具體(ti)(ti)實(shi)施方案(an)，本發(fa)(fa)(fa)(fa)明(ming)的(de)篩選方法(fa)中，可(ke)采用震蕩觀(guan)察(cha)(cha)培養基菌(jun)(jun)(jun)液(ye)氣泡以判(pan)(pan)斷(duan)是(shi)否產氣，或者(zhe)采用扣(kou)蓋型(xing)(xing)試(shi)管進(jin)行乳桿菌(jun)(jun)(jun)的(de)培養通(tong)過(guo)觀(guan)察(cha)(cha)培養過(guo)程中是(shi)否頂蓋以判(pan)(pan)斷(duan)是(shi)否產氣。由于有些乳酸菌(jun)(jun)(jun)進(jin)行異(yi)型(xing)(xing)發(fa)(fa)(fa)(fa)酵，如短乳桿菌(jun)(jun)(jun)和(he)發(fa)(fa)(fa)(fa)酵乳桿菌(jun)(jun)(jun)等(deng)，其發(fa)(fa)(fa)(fa)酵葡(pu)萄(tao)糖(tang)本身就(jiu)會產生氣體(ti)(ti)，如果僅是(shi)通(tong)過(guo)震蕩觀(guan)察(cha)(cha)菌(jun)(jun)(jun)液(ye)氣泡等(deng)方法(fa)對(dui)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)產氣結果進(jin)行簡單檢測，則此類異(yi)型(xing)(xing)發(fa)(fa)(fa)(fa)酵的(de)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)會干擾產氣結果，導致誤判(pan)(pan)。因此，對(dui)于待選乳桿菌(jun)(jun)(jun)為異(yi)型(xing)(xing)發(fa)(fa)(fa)(fa)酵的(de)菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)(zhu)時，可(ke)采用扣(kou)蓋型(xing)(xing)試(shi)管進(jin)行培養通(tong)過(guo)觀(guan)察(cha)(cha)培養過(guo)程中是(shi)否頂蓋以判(pan)(pan)斷(duan)是(shi)否產氣。

10、根據本(ben)發(fa)明的具體實施方(fang)案(an)，本(ben)發(fa)明的篩選(xuan)方(fang)法，采用以下方(fang)式評估待選(xuan)乳桿菌產γ-氨基丁酸的能力：

11、待選乳桿菌在篩選用培(pei)養基中培(pei)養至穩定期(qi)時，產氣且ph值較高的菌株，具備產γ-氨基丁酸的能力；和/或

12、待選乳桿(gan)菌在篩選用(yong)培(pei)養基中培(pei)養至(zhi)穩定期時，產氣(qi)且(qie)ph值升(sheng)高的(de)菌株，具(ju)備產γ-氨基丁酸(suan)的(de)能力。

13、根據本發明的(de)具體實施(shi)方案，待(dai)選乳(ru)桿(gan)(gan)菌(jun)在篩(shai)選用培(pei)養基中培(pei)養至穩(wen)定(ding)期(qi)的(de)操(cao)作可以(yi)按照所屬領域的(de)常規(gui)操(cao)作進行。本發明中檢測菌(jun)株頂(ding)蓋及測定(ding)ph值(zhi)的(de)時間需要(yao)避免菌(jun)株生長特性(xing)的(de)干擾，選擇在菌(jun)株生長的(de)穩(wen)定(ding)中后期(qi)進行測定(ding)。通常情況下，植物(wu)乳(ru)桿(gan)(gan)菌(jun)通常會比短(duan)乳(ru)桿(gan)(gan)菌(jun)更早(zao)進入穩(wen)定(ding)期(qi)，其菌(jun)液ph會早(zao)于短(duan)乳(ru)桿(gan)(gan)菌(jun)下降并趨于穩(wen)定(ding)。

14、根據本(ben)發明的具體實施(shi)方(fang)案(an)，本(ben)發明的篩選方(fang)法包括：

15、待(dai)選(xuan)乳(ru)桿菌(jun)(jun)菌(jun)(jun)種(zhong)(zhong)進行活化(hua)傳(chuan)代(dai)制(zhi)(zhi)成種(zhong)(zhong)子(zi)(zi)培(pei)養菌(jun)(jun)液，接(jie)種(zhong)(zhong)到篩選(xuan)用培(pei)養基(ji)中(zhong)進行培(pei)養；優(you)選(xuan)地，種(zhong)(zhong)子(zi)(zi)培(pei)養菌(jun)(jun)液的接(jie)種(zhong)(zhong)量為0.5％-3％；優(you)選(xuan)地，活化(hua)傳(chuan)代(dai)、制(zhi)(zhi)備種(zhong)(zhong)子(zi)(zi)培(pei)養菌(jun)(jun)液采用的培(pei)養基(ji)各自獨立地為mrs液體培(pei)養基(ji)；

16、待(dai)選(xuan)乳桿(gan)菌在(zai)篩選(xuan)用(yong)培(pei)養基中(zhong)培(pei)養至24h-72h優(you)選(xuan)36h-48h時，觀(guan)察培(pei)養過程中(zhong)的(de)產氣情況(kuang)，并測(ce)定培(pei)養液ph值，評估(gu)待(dai)選(xuan)乳桿(gan)菌產γ-氨基丁酸的(de)能力。

17、根據本(ben)發(fa)(fa)明(ming)的具(ju)體實施方案，本(ben)發(fa)(fa)明(ming)的篩選(xuan)方法中(zhong)(zhong)，待選(xuan)乳桿菌(jun)為短(duan)乳桿菌(jun)，其在培養至24h-72h優選(xuan)36h-48h時產氣，并(bing)且培養過程中(zhong)(zhong)ph值先降(jiang)低(di)再升高，評(ping)估其具(ju)備產γ-氨基丁(ding)酸的能力。在本(ben)發(fa)(fa)明(ming)的一(yi)些優選(xuan)實施方案中(zhong)(zhong)，待選(xuan)乳桿菌(jun)在培養至48h時ph值升高至5.0以上優選(xuan)5.3以上，評(ping)估其具(ju)備產γ-氨基丁(ding)酸的能力。

18、根(gen)據本發明(ming)的(de)(de)具體實施方案，本發明(ming)的(de)(de)篩選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)方法中，待(dai)(dai)選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)乳桿菌(jun)為植(zhi)物(wu)乳桿菌(jun)，其(qi)在(zai)(zai)培養(yang)至24h-72h優(you)選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)36h-48h時(shi)產(chan)氣且(qie)具有較高ph值，評(ping)估(gu)其(qi)具備(bei)產(chan)γ-氨基丁酸的(de)(de)能(neng)力。在(zai)(zai)本發明(ming)的(de)(de)一(yi)些優(you)選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)實施方案中，待(dai)(dai)選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)乳桿菌(jun)在(zai)(zai)培養(yang)至48h時(shi)ph值在(zai)(zai)4.2以上(shang)優(you)選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)4.3以上(shang)更優(you)選(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)(xuan)4.4以上(shang)，評(ping)估(gu)其(qi)具備(bei)產(chan)γ-氨基丁酸的(de)(de)能(neng)力。

19、本發(fa)(fa)明的(de)篩選方法(fa)，主要(yao)是根據gaba的(de)生物(wu)(wu)合(he)成(cheng)(cheng)原理，圍(wei)繞其合(he)成(cheng)(cheng)底物(wu)(wu)和產物(wu)(wu)的(de)特性(xing)，運用產氣法(fa)和菌(jun)液(ye)(ye)ph值法(fa)，分別對其反應產物(wu)(wu)和底物(wu)(wu)進行鑒定(ding)，再(zai)將(jiang)兩種方法(fa)的(de)結(jie)果(guo)相結(jie)合(he)，即是否同(tong)時(shi)具有產氣現象(xiang)(xiang)和高ph值現象(xiang)(xiang)，共同(tong)判斷一(yi)株乳桿菌(jun)的(de)產gaba能力。在本發(fa)(fa)明的(de)一(yi)些具體實施方案中(zhong)，經過薄層色譜法(fa)和高效液(ye)(ye)相色譜法(fa)的(de)驗證，本發(fa)(fa)明的(de)篩選方法(fa)的(de)準確性(xing)得以驗證，準確率(lv)可達100％。并且(qie)，本發(fa)(fa)明的(de)篩選方法(fa)與(yu)傳統(tong)篩選該方法(fa)相比，還具有簡單易操作、成(cheng)(cheng)本低且(qie)高通量的(de)優點。

技術特征：

1.一(yi)種篩選(xuan)產γ-氨基(ji)丁酸的乳桿菌的方法，該方法包括(kuo)：

2.根據權利要(yao)求1所述(shu)的方法，其中，所述(shu)篩選用培養(yang)基為液體(ti)培養(yang)基；

3.根據權利要求1所述(shu)(shu)的方法，其中，所述(shu)(shu)篩選用培(pei)(pei)養(yang)基為含0.3％-3％msg的mrs液體培(pei)(pei)養(yang)基。

4.根據權利要求1-3任一項所(suo)述的(de)(de)方(fang)法，其中(zhong)，所(suo)述篩選(xuan)用(yong)培養(yang)基為經(jing)過除氣的(de)(de)培養(yang)基；

5.根(gen)據權利要求2-4任(ren)一(yi)項所述的(de)方(fang)法(fa)，其中，采用震蕩觀察(cha)培(pei)養(yang)基菌(jun)液氣泡以判(pan)斷是否產(chan)氣，或者采用扣蓋(gai)型試管進行(xing)乳桿菌(jun)的(de)培(pei)養(yang)通過觀察(cha)培(pei)養(yang)過程中是否頂蓋(gai)以判(pan)斷是否產(chan)氣。

6.根據權利要求1所述(shu)的方(fang)法，其中，采(cai)用以下(xia)方(fang)式評估(gu)待選乳桿菌產γ-氨基丁(ding)酸的能力：

7.根(gen)據權利要求1所述的(de)方法(fa)，其包括：

8.根據權(quan)利要求1-7任一項所述(shu)的(de)方法，其中，所述(shu)待選乳(ru)(ru)桿(gan)菌為短乳(ru)(ru)桿(gan)菌、植物(wu)乳(ru)(ru)桿(gan)菌或發酵乳(ru)(ru)桿(gan)菌。

9.根據權(quan)利要(yao)求1-7任一項(xiang)所(suo)述(shu)的(de)方(fang)法，其中，待選乳桿(gan)菌(jun)(jun)為短乳桿(gan)菌(jun)(jun)，其在培養至24h-72h優選36h-48h時產氣，并且培養過(guo)程中ph值(zhi)先降(jiang)低(di)再升(sheng)高，評(ping)估其具備產γ-氨基丁酸(suan)的(de)能力；

10.根據權(quan)利要求1-7任一(yi)項所述的(de)方法，其中，待(dai)選乳(ru)桿(gan)菌為植(zhi)物乳(ru)桿(gan)菌，其在培養(yang)至(zhi)24h-72h優選36h-48h時(shi)產氣且具有(you)較高ph值，評估其具備(bei)產γ-氨基丁酸(suan)的(de)能力；

技術總結
本發明提供了一種產γ?氨基丁酸的乳桿菌的高通量篩選方法。具體地，本發明提供了一種篩選產γ?氨基丁酸的乳桿菌的方法，該方法包括：將待選乳桿菌在篩選用培養基中進行培養；其中，所述篩選用培養基為含有谷氨酸和/谷氨酸鈉的培養基；根據培養過程中的產氣情況和培養基pH值，評估待選乳桿菌產γ?氨基丁酸的能力。本發明的方法具有簡單快速、低成本高通量的特點，能夠快速從大量乳桿菌中篩選出產GABA的菌株。

技術研發人員：孫婷,馬霞,洪維鍊,劉福東,趙雯,劉偉賢
受保護的技術使用者：內蒙古伊利實業集團股份有限公司
技術研發日：
技術公布日：2024/9/29