本發明涉及細胞培養領域，具(ju)體地涉及一種活化和擴增自然(ran)殺傷(shang)細胞的方法及其用途。

背景技術：

1、現有(you)(you)的nk擴增(zeng)平(ping)臺(tai)，為了實(shi)現nk更好(hao)的擴增(zeng)，大(da)多采用(yong)了有(you)(you)血清、有(you)(you)滋養層細胞的擴增(zeng)方法(fa)。

2、對于加(jia)入血清(qing)的(de)(de)(de)(de)(de)方(fang)法，在(zai)培(pei)養(yang)體系里加(jia)入人源或動物源血清(qing)，存(cun)在(zai)血清(qing)的(de)(de)(de)(de)(de)來(lai)源受限、批次間的(de)(de)(de)(de)(de)穩定(ding)性較(jiao)差的(de)(de)(de)(de)(de)缺點，并且存(cun)在(zai)臨床安全(quan)性方(fang)面(mian)的(de)(de)(de)(de)(de)風險。從監管的(de)(de)(de)(de)(de)角度(du)，盡(jin)管沒有(you)明確(que)禁用血清(qing)用于細胞的(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)產工(gong)藝，但是(shi)其殘(can)留和安全(quan)性評估需要額外的(de)(de)(de)(de)(de)關注(zhu)。

3、而(er)對于(yu)采(cai)用(yong)滋養(yang)層細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)方(fang)法，需要在nk細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)擴增(zeng)中(zhong)加(jia)入滋養(yang)層細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，然(ran)而(er)滋養(yang)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)是來源于(yu)腫瘤細(xi)胞(bao)(bao)(bao)，雖然(ran)經(jing)過(guo)(guo)輻照等方(fang)式滅活后使用(yong)，腫瘤滋養(yang)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)殘(can)留包括其降解產(chan)物的(de)殘(can)留，在細(xi)胞(bao)(bao)(bao)治療產(chan)品開發過(guo)(guo)程(cheng)中(zhong)存(cun)在安(an)全風(feng)險。

4、已經報道(dao)的無(wu)滋養(yang)細胞(bao)擴(kuo)(kuo)增方(fang)法(fa)，通常采用不同(tong)的激(ji)活抗(kang)體(ti)(ti)或配體(ti)(ti)去(qu)激(ji)活nk細胞(bao)，比如(ru)抗(kang)cd2、nkp46抗(kang)體(ti)(ti)等，以及使用不同(tong)的細胞(bao)因子去(qu)擴(kuo)(kuo)增nk細胞(bao)，但報道(dao)的大部分方(fang)法(fa)均使用了有血清的方(fang)式(shi)，在nk擴(kuo)(kuo)增倍(bei)數方(fang)面表(biao)現(xian)也(ye)不甚理(li)想(xiang)，例如(ru)nk擴(kuo)(kuo)增倍(bei)數在2.5倍(bei)到200倍(bei)之間。

5、因此，本領域(yu)迫切需(xu)要開發無血清(qing)、無滋養細胞(bao)且能高效(xiao)擴增nk細胞(bao)的方(fang)法。

技術實現思路

1、本發(fa)明(ming)的目的就是(shi)提供一種無(wu)血清、無(wu)滋養細胞且能高(gao)效擴增nk細胞的方法。

2、在本(ben)發明的(de)第(di)一方(fang)面，提供了一種體外擴增自然殺傷(nk)細胞的(de)方(fang)法，包括步(bu)驟(zou)：

3、（a）提供一細胞培養(yang)容器(qi)，所述細胞培養(yang)容器(qi)中的固相(xiang)表面包(bao)被有(you)重組(zu)蛋白mica和micb；

4、（b）用(yong)步驟（a）中的(de)細胞培養(yang)(yang)容(rong)器(qi)對nk細胞進行(xing)培養(yang)(yang)。

5、在另(ling)一優選例中(zhong)，所(suo)述方法中(zhong)無血清、無滋(zi)養層(ceng)細胞的加入(ru)。

6、在另一優選例(li)中(zhong)，所(suo)述(shu)步驟（a）包(bao)(bao)括：制備包(bao)(bao)被液(ye)(ye)(ye)，所(suo)述(shu)包(bao)(bao)被液(ye)(ye)(ye)包(bao)(bao)含重組蛋(dan)白mica和(he)micb；用所(suo)述(shu)包(bao)(bao)被液(ye)(ye)(ye)對所(suo)述(shu)固相表面進行包(bao)(bao)被處(chu)理(li)。

7、在(zai)另(ling)一優選(xuan)例中，所述包被液中mica的濃度為0.1-15μg/ml；優選(xuan)地(di)為0.5-10μg/ml；更優選(xuan)地(di)為1-5μg/ml。

8、在另一優選(xuan)例中，所述包被(bei)液中micb的濃度為0.1-15μg/ml；優選(xuan)地為0.5-10μg/ml；更優選(xuan)地為1-5μg/ml。

9、在另一優選例中(zhong)，所述包被液中(zhong)mica與micb的(de)比例為（1:5）~（5:1）。

10、在(zai)另一(yi)優選例(li)(li)中(zhong)，所述包被液中(zhong)mica與micb的比例(li)(li)為（1:2）~（2:1）。

11、在另(ling)一優選例中，所述mica和micb溶解在緩沖液中從(cong)而(er)制備得到所述的包(bao)被液。

12、在另一優(you)選例中，所(suo)述緩沖(chong)液(ye)選自下組(zu)：磷酸(suan)鹽(yan)(yan)緩沖(chong)液(ye)、碳(tan)酸(suan)鹽(yan)(yan)緩沖(chong)液(ye)、或(huo)其組(zu)合。

13、在另(ling)一優選(xuan)例中(zhong)，所述緩沖液為dpbs溶液。

14、在另一優選例中，每(mei)平方厘米面(mian)(mian)積的(de)(de)固相表(biao)面(mian)(mian)中加入(ru)的(de)(de)所述包被液的(de)(de)體積為0.1~0.5?ml。

15、在另一優(you)選例中(zhong)，每(mei)平方厘米面(mian)積(ji)的固相表(biao)面(mian)中(zhong)加入的所述包被液的體(ti)積(ji)為0.15~0.35?ml。

16、在另一優(you)選例中，每(mei)平方厘米面積的(de)固相(xiang)表面中加入的(de)所述包被液(ye)的(de)體積為0.15~0.25?ml。

17、在另一優選例中，成功包(bao)被(bei)在固相(xiang)表面(mian)的(de)蛋(dan)白占(zhan)所述包(bao)被(bei)液中總蛋(dan)白含量的(de)至(zhi)少(shao)70%；優選地至(zhi)少(shao)80%；更優選地至(zhi)少(shao)90%。

18、在(zai)另一(yi)優(you)選(xuan)(xuan)例中，成功(gong)包被在(zai)所述固相(xiang)載體的(de)表面的(de)mica的(de)含(han)量為(wei)0.03-3μg/cm2，micb的(de)含(han)量為(wei)0.03-3μg/cm2；優(you)選(xuan)(xuan)地，mica的(de)含(han)量為(wei)0.05-2.5μg/cm2，micb的(de)含(han)量為(wei)0.05-2.5μg/cm2；更優(you)選(xuan)(xuan)地，mica的(de)含(han)量為(wei)0.1-2μg/cm2，micb的(de)含(han)量為(wei)0.1-2μg/cm2。

19、在另一優選例(li)中(zhong)，步驟（a）中(zhong)，所述(shu)固相表(biao)面(mian)(mian)是細(xi)胞(bao)培養容器的表(biao)面(mian)(mian)，所述(shu)細(xi)胞(bao)培養容器選自下組：培養皿、多孔細(xi)胞(bao)板、搖瓶、或其組合。

20、在另一優選例中，所述固相表(biao)(biao)面是細胞培(pei)養(yang)容器內的磁珠(zhu)表(biao)(biao)面。

21、在另一優(you)選例中(zhong)，所述包被處(chu)理的條件為：4℃±1℃孵育(yu)過夜，或37℃±3℃孵育(yu)2~4小時(shi)。

22、在另一優(you)選例中，所述包被處理的條(tiao)件為：4℃孵育過(guo)夜，或37℃孵育2小時。

23、在另一(yi)優選例(li)中，所述(shu)步驟（b）進一(yi)步包括：

24、（b1）步(bu)驟（a）中的細(xi)(xi)胞培(pei)養(yang)容器中加入培(pei)養(yang)基和待培(pei)養(yang)的nk細(xi)(xi)胞，進行激活培(pei)養(yang)，獲得(de)激活后的nk細(xi)(xi)胞；

25、（b2）將步(bu)驟（b1）中激活后的nk細(xi)胞轉移到培(pei)養基中，進(jin)行擴增培(pei)養，收獲擴增后的nk細(xi)胞。

26、在另一(yi)優選例中，步驟（b1）和(he)步驟（b2）中的培養基是相(xiang)同的或不同的。

27、在另一優選例中，所述(shu)培(pei)養(yang)基中包含(han)選自下組(zu)(zu)的nk細胞培(pei)養(yang)液：optivitro?nk、ctstmnk-xpander、irvinetmprmie-xv?nk?cell?cdm、或其組(zu)(zu)合。

28、在另一優(you)選例中(zhong)，所(suo)述培養基中(zhong)還(huan)加(jia)入了細(xi)胞因(yin)子。

29、在另一優選例中(zhong)，所述細胞因(yin)子選自下組：il-2、il-12、il-15、il-18、il-21、或其組合(he)。

30、在另一優選例中，所述細胞因子的濃度(du)為：il-2(100-2000iu/ml)、il-12(5-100ng/ml)、il-15(5-100ng/ml)、il-18(5-100ng/ml)和(he)/或il-21(10-200ng/ml)。

31、在另一優(you)選例中，所述細胞因(yin)子(zi)的濃度(du)為：il-2(150-1000iu/ml)、il-12(10-50ng/ml)、il-15(5-50ng/ml)、il-18(5-50ng/ml)和/或il-21(10-100ng/ml)。

32、在另一優選例(li)中，步(bu)驟（b1）中，激活培養(yang)為靜(jing)置培養(yang)。

33、在(zai)另(ling)一優選例中，激活培養的天數為2~10天；優選地，3~8天；更優選地，4~6天。

34、在另一優選例中，在步(bu)驟(zou)（b1）中，每隔2~3天(tian)向培養基中補加培養液和細胞因子。

35、在另一(yi)優選例中，步驟（b2）中，擴增培養(yang)為動態培養(yang)。

36、在(zai)(zai)另一(yi)優選例中，步驟(zou)（b2）中，所述擴增(zeng)培養為三維立體細胞培養、或在(zai)(zai)搖床上動態培養。

37、在另一優選例中，在步(bu)驟(zou)（b2）中，每隔1~3天向(xiang)培養(yang)基中補加培養(yang)液和細胞因子。

38、在(zai)另(ling)一優選例中，所述nk細胞(bao)是(shi)誘導多能干(gan)細胞(bao)（ipsc）分化而來(lai)的ink細胞(bao)。

39、在另一優選(xuan)例(li)中，所述方法培養得到的(de)nk細胞具有以下一個(ge)或(huo)多個(ge)特征：

40、（1）擴增(zeng)倍數≥300倍；優(you)選地(di)≥400倍；更優(you)選地(di)≥700倍；

41、（2）純度≥97%；優(you)(you)選地≥98%；更優(you)(you)選地≥99%；

42、（3）在效靶比e:t=(1:1)~(3:1)時，對(dui)靶細胞(bao)的殺傷活(huo)性≥50%；優(you)選地≥70%；更(geng)優(you)選地≥90%。

43、在另一(yi)優選例中，所述靶(ba)細(xi)胞(bao)為腫瘤細(xi)胞(bao)。

44、在另一優選例中，所述靶細(xi)胞為k562和/或(huo)raji細(xi)胞。

45、在本發明的第二方(fang)面，提供了一(yi)種重組(zu)蛋白組(zu)合(he)(he)的用途(tu)，所述重組(zu)蛋白組(zu)合(he)(he)為mica和micb的組(zu)合(he)(he)，用于制備一(yi)激活(huo)試劑(ji)，所述激活(huo)試劑(ji)包被到固相載體中，用于nk細胞的激活(huo)擴(kuo)增(zeng)。

46、在另一(yi)優選例中(zhong)，所述激(ji)活試劑中(zhong)包括：（i）有效量(liang)的mica和(he)micb；和(he)（ii）稀釋(shi)劑或載體(ti)。

47、在另(ling)一(yi)優(you)(you)選(xuan)例中，所(suo)述激(ji)活試劑中mica的濃(nong)度為0.1-15μg/ml；優(you)(you)選(xuan)地為0.5-10μg/ml；更優(you)(you)選(xuan)地為1-5μg/ml。

48、在另一優選(xuan)例中，所述激活試劑中micb的濃度(du)為0.1-15μg/ml；優選(xuan)地(di)為0.5-10μg/ml；更(geng)優選(xuan)地(di)為1-5μg/ml。

49、在另一優選例中(zhong)，所(suo)述激活試劑中(zhong)mica與micb的比例為（1:5）~（5:1）。

50、在另一優選例(li)中，所述激活試劑(ji)中mica與micb的比例(li)為（1:2）~（2:1）。

51、在(zai)另一優選例中，所(suo)述稀(xi)釋劑(ji)或(huo)載體選自下組：磷酸鹽緩沖液(ye)、碳酸鹽緩沖液(ye)、或(huo)其(qi)組合。

52、在另一(yi)優(you)選(xuan)例中，所述稀(xi)釋劑或載體為dpbs溶液。

53、在本發(fa)明的第三方面，提供了一種(zhong)重組蛋白(bai)包(bao)(bao)被(bei)的固相(xiang)載體，所(suo)述(shu)固相(xiang)載體的表面包(bao)(bao)被(bei)有重組蛋白(bai)mica和重組蛋白(bai)micb，所(suo)述(shu)固相(xiang)載體用于激(ji)活培養nk細胞(bao)。

54、在另一(yi)優選例(li)中，所述(shu)固相載(zai)體是(shi)細胞培養(yang)容(rong)或磁珠。

55、在另一優選(xuan)例(li)中，所(suo)述細胞培養容器選(xuan)自下組：培養皿(min)、多孔細胞板、搖瓶、或其組合。

56、在本發明的第四方(fang)面(mian)，提供了一種(zhong)激活培(pei)養nk細胞的試劑(ji)盒，所(suo)述(shu)試劑(ji)盒包含如本發明第三方(fang)面(mian)所(suo)述(shu)的重組蛋白包被(bei)的固相載體。

57、在(zai)另(ling)一優選例中(zhong)，所述試劑(ji)盒還包含一說明書，所述說明書中(zhong)記載了用所述重組蛋白包被的(de)固相載體激活培養(yang)nk細胞的(de)方法。

58、在另一優選例(li)中，所述方法包括以下步驟：

59、(s1)?提(ti)供待培養(yang)的nk細胞；

60、(s2)?用(yong)所述重組蛋白包被的固相載體激活(huo)培養所述的nk細(xi)胞。

61、在本(ben)發明的(de)第(di)五方面，提供了一種制備(bei)如本(ben)發明第(di)三方面所(suo)述(shu)的(de)重(zhong)組(zu)蛋(dan)白包被(bei)的(de)固(gu)相載體的(de)方法，所(suo)述(shu)方法包括步驟：

62、(y1)?制(zhi)備包被(bei)液(ye)，所述包被(bei)液(ye)包含重組(zu)蛋白mica和(he)micb；

63、(y2)?用所述包被液對(dui)所述固相表面(mian)進行包被處(chu)理。

64、在另一優選(xuan)例中，所述包被液中mica的濃度為0.1-15μg/ml；優選(xuan)地為0.5-10μg/ml；更優選(xuan)地為1-5μg/ml。

65、在另一優(you)選(xuan)(xuan)例中(zhong)，所述包被(bei)液中(zhong)micb的濃(nong)度為0.1-15μg/ml；優(you)選(xuan)(xuan)地(di)為0.5-10μg/ml；更優(you)選(xuan)(xuan)地(di)為1-5μg/ml。

66、在另一優選例(li)中，所述包(bao)被(bei)液中mica與micb的比例(li)為（1:5）~（5:1）。

67、在另一優選例中(zhong)，所(suo)述(shu)包(bao)被液中(zhong)mica與(yu)micb的比例為（1:2）~（2:1）。

68、在另一(yi)優選例中，每平(ping)方厘米(mi)面積的(de)固相載體表面中加入的(de)所述包被液的(de)含量為(wei)0.1~0.5?ml；優選地為(wei)0.15~0.35?ml；更優選地為(wei)0.15~0.25?ml。

69、在(zai)另一優(you)選(xuan)例中(zhong)，成功包被在(zai)固相載體表面的(de)蛋(dan)白占所(suo)述包被液中(zhong)總蛋(dan)白含量的(de)至少(shao)70%；優(you)選(xuan)地至少(shao)80%；更優(you)選(xuan)地至少(shao)90%。

70、應理解，在(zai)本發明(ming)范圍內(nei)中，本發明(ming)的(de)(de)上述(shu)各(ge)技(ji)術特征和(he)在(zai)下文(如(ru)實施例)中具體(ti)描述(shu)的(de)(de)各(ge)技(ji)術特征之間都可以互(hu)相組合(he)，從而構成新的(de)(de)或(huo)優選(xuan)的(de)(de)技(ji)術方案。限于篇幅，在(zai)此不再(zai)一一累述(shu)。