本發明涉及一種芽孢桿菌以及利用芽孢桿菌發酵生產5-羥色氨酸的方法，屬于生物
技術領域：
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背景技術：
：5-羥色氨酸(5-htp)是人體內激素serotonin的前驅物質，有鎮靜作用，可以幫助人體內這種激素的生產，使自己體內達到平衡。5-htp是色氨酸、5-羥色胺(復合胺)的反應媒介，也就是說，5-羥色氨酸是重要的抑制神經傳遞素復合胺(5-ht)的前體。在腦部、血小板、腸胃、中樞神經系統中均有復合胺。在情緒變化時，會相應分泌復合胺，它是腦部控制情緒、行為、胃口、睡眠、沖動的重要化學物質。5-羥色氨酸能有效幫助產生復合胺，因此可促進情緒、神經系統的健康。研究表明，5-羥色氨酸可抑制食欲，減少脂肪攝取，減少焦慮，控制情緒，促進睡眠。目前國內可穩定生產的有優速達生物，產品質量已經得到歐美等國家的認可。5-htp作為食品成分是天然提取來自于griffoniasimplicifolia，一個西非藥物植物的種子中得到的。5-羥色氨酸是一個自然氨基的酸性物質，在許多飲食所含的蛋白質中可以找到。5-羥色氨酸是處方藥-百憂解(prozac)的天然替代品。正如百憂解一樣，5-羥色氨酸可增強5-羥色胺的活動力。5-羥色胺是腦部分泌的一種激素，會影響我們的情緒、睡眠和食欲，造成腦中的血清素不平衡時需5-羥色氨酸來維持身體處于正常狀態。因此含量太低則容易憂郁、焦慮及睡眠失調。百憂解這類的藥物，可防腦細胞太快耗盡血清素，而導致5-羥色胺不足。而5-羥色氨酸的功效稍有不同：它可增加腦細胞的血清素制造量，進而提升5-羥色胺的含量。5-羥色氨酸在人體中會制造出血清素，對于正常的神經的重要物質和腦的功能有幫助。血清素可以幫助睡眠，也可有效的控制疼痛。因此5-羥色氨酸也成功地被拿來治療睡眠失調。由于血清素是褪黑激素(一種調節睡眠和清醒周期的天然荷爾蒙)的前身，因此當血清素的含量提高時，褪黑激素的含量也就增加。既然5-羥色氨酸和ssri的作用類似，何不服用后者就好。原因之一是抗憂郁處方藥貴；二是處方藥常會引起一些不良的副作用，包括口干、焦慮及喪失性欲。此外，使用5-htp能幫助抑制食欲，它能使人體所攝取的碳水化合物更少且更快感到飽足，每天攝取750毫克的5-htp可以減少碳水化合物的吸收，并且不使體重增加，進而達到減輕體重的效果。5-羥色氨酸的臨床應用：1、抗憂郁、鎮定劑：5-htp可增加腦細胞的血清素制造量，進而提升5-羥色胺的含量。5-羥色氨酸在人體中會制造出血清素，對于正常的神經的重要物質和腦的功能有幫助。血清素可以幫助睡眠，也可有效的控制疼痛，可以治療憂郁癥；2、減緩壓力和改善睡眠方面：當血清素的含量提高時，褪黑激素的含量也就增加，使得睡眠更為香甜；3、減肥：可以有效控制食欲，提高飽食中樞的敏感性，在減肥過程的飲食控制中，降低饑餓感，使減肥過程更輕松容易達成，是當前流行的減肥食品輔助劑。對想減肥的人是一大福音；4、其他：除具有傳統的醫藥功能和抗憂郁癥外，還具有減肥、戒癮、改善睡眠、緩和經前綜合癥，治療偏頭疼等功能；5-羥色氨酸現已被歐美各大保健品公司廣泛應用。用于通過自然地提高血清素的水平，增加人體血液中復合胺的生成。目前，5-羥色氨酸的制備主要由植物來源，提取于非洲的植物加納種子。但產量受資源限制，并且提取成本高。顯然，微生物轉化和發酵法生產是一條良好的途徑。技術實現要素：為解決現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種芽孢桿菌以及利用該芽孢桿菌發酵生產5-羥色氨酸的方法。一種生產5-羥色氨酸的地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)jsc-69，其已在中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏，編號為cgmccno：13533，保藏日期為2017年01月05日。所述地衣芽孢桿菌jsc-69的鑒定：1、菌體的形態特征：單個細菌0.6×2.0微米。無莢膜，不成鏈，能運動。革蘭氏陽性菌，需氧菌。芽孢橢圓形至柱狀，中間膨大，芽孢在中間或偏一端，0.9×1.5微米。當培養于肉湯瓊脂平板上時，菌落近似圓形，乳白色，表面暗，不透明，邊緣不整齊，菌落粗糙，粘著，擴展。菌落與培養基緊貼，不易挑取；液體培養有菌膜，無渾濁，無沉淀。2、菌體的生理生化鑒定：將地衣芽孢桿菌jsc-69進行生理生化性狀檢測，結果：該菌株接觸酶試驗呈陽性。明膠液化，淀粉水解，v.p試驗陽性，檸檬酸鹽利用。甲基紅試驗呈陰性，卵磷脂酶試驗陰性，可利用硝酸鹽，可利用d-葡萄糖、l-阿拉伯糖、d-木糖和d-甘露醇產酸。本發明進一步提供應用所述的地衣芽孢桿菌jsc-69生產5-羥色氨酸的方法，該方法具體包括如下步驟：步驟a，對地衣芽孢桿菌jsc-69進行擴大培養；步驟b，用步驟a擴大培養獲得到的地衣芽孢桿菌jsc-69轉化色氨酸；和步驟c，收集5-羥色氨酸。進一步，步驟a所述擴大培養包括斜面培養、搖瓶培養、種子罐培養和發酵罐培養中的任意一種或幾種的組合。所述擴大培養過程所用培養基是含有可吸收的碳、氮和磷源的含水培養基。所述培養基還可包括適宜的鹽、礦物質、金屬和其他營養成分；所述碳源選自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖漿和糖蜜中的一種或多種；氮源選自氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀中的一種或多種。其中，所述搖瓶培養和種子罐培養階段所用培養基是含有可吸收的碳、氮和磷源的含水培養基；所述培養基還可包括適宜的鹽、礦物質、金屬和其他營養成分；所述碳源選自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖漿和糖蜜中的一種或多種；氮源選自氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀中的一種或多種。優選所述培養基組分包括胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏、葡萄糖、玉米漿、氯化鈉。所述發酵罐培養階段所用發酵培養基是含有可吸收的碳、氮和磷源的含水培養基。所述培養基還可包括適宜的鹽、礦物質、金屬和其他營養成分；所述碳源選自葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、糊精、甘油、淀粉、糖漿和糖蜜中的一種或多種；氮源選自氯化銨、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀中的一種或多種。優選所述發酵培養基組分包括：蔗糖、豆粕、(nh4)2so4、k2hpo4·3h2o、kh2po4；進一步優選所述發酵培養基組成為：蔗糖40g/l，豆粕40g/l，(nh4)2so45g/l，k2hpo4·3h2o8g/l，kh2po41.8g/l；初始ph6.5～7.0。進一步，步驟a所述擴大培養條件為：溫度25-45℃，ph6.5-7.0，時間20-50小時。其中，所述搖瓶和種子罐培養階段培養條件為：溫度25-45℃，ph6.5-7.0，時間20-30小時。所述發酵罐培養階段培養條件為：發酵溫度30-35℃，ph為6.5-7.0，發酵時間30-50小時。優選，發酵溫度32℃，ph6.8，發酵時間45小時。進一步，步驟b所述色氨酸濃度為0.2-10g/l；轉化條件為：25-45℃下轉化40-60小時，ph為6-8。進一步，步驟c所述“收集5-羥色氨酸”包括如下方法：對步驟b得到的轉化產物進行離心處理，取上清液部分即為產物5-羥色氨酸。進一步，本發明方法還包括：步驟d，對產物5-羥色氨酸進行純化。所述“純化”過程依次包括固液分離、陽離子交換樹脂吸附分離、濃縮、乙醇溶解、蒸餾的步驟。本發明所述“擴大培養”以菌種擴增為目的，將處于休眠狀態的菌種活化后，再經過逐級擴大培養，最終獲得一定數量和質量的菌種的過程。所述擴大培養的一般過程為：斜面培養、搖瓶培養、種子罐逐級培養、發酵罐培養，在實際操作中，種子罐培養級數可按照發酵規模、菌體生長特性、接種量等因素而確定。本發明所述“底物”是指待轉化的反應物，所述“轉化”是指利用微生物，在適宜的條件下，將待轉化的反應物經過特定的代謝途徑轉化為人類所需要的產物的過程。本發明以“色氨酸”為底物，經過特定菌種地衣芽孢桿菌jsc-69的轉化，得到終產物“5-羥色氨酸”。本發明所述地衣芽孢桿菌jsc-69(bacilluslicheniformisjsc-69)，與一般的芽孢桿菌相比，具有更廣泛的發酵溫度(30℃～37℃)，可以利用復雜氮源，短時間內生長達到較高的生物量，可生物轉化色氨酸生產5-羥色氨酸。通過對發酵條件的優化，地衣芽孢桿菌jsc-69以色氨酸為底物生產5-羥色氨酸，轉化效率達95％～100％，可將轉化液經進一步純化及能得到高純度的5-羥色氨酸。具體實施方式實施例1菌株篩選平板篩選培養基：牛肉膏5g/l，大豆蛋白胨10g/l，nacl5g/l，瓊脂15g/l。篩選時所用液體培養基：蔗糖20g/l，豆粕20g/l，(nh4)2so43g/l，k2hpo4·3h2o5g/l，kh2po41g/l，牛肉膏2g/l，大豆蛋白胨4g/l，nacl5g/l，色氨酸8g/l；ph值7.0。從南京及周邊地區共采集100多份土樣或水樣，并制成適當濃度的稀釋液，直接涂布于篩選培養基平板，37℃培養1天，分別挑取不同形態的單菌落接種于裝有液體培養基的試管，30℃、200rpm震蕩培養2天，離心取發酵上清液。測定上清中5-羥色氨酸含量。從500多個菌落中檢測到4株可以產生5-羥色氨酸。取初篩得到的菌株分別接種于裝有5ml液體培養基的試管中，30℃震蕩培養2天。然后轉接到裝有50ml液體培養基的三角瓶，30℃、200rpm發酵2天。用hplc法精確測定發酵上清中5-羥色氨酸的含量。結果見表1。表1部分篩菌株的產5-羥色氨酸情況菌株編號5-羥色氨酸的含量(g/l)jsc-241.2jsc-697.7jsc-1376.8jsc-4030.4結果表明，菌株jsc-69和jsc-137發酵液中5-羥色氨酸含量明顯高于另外兩種菌株。實施例2菌株jsc-69的鑒定對jsc-69按《伯杰氏系統細菌學手冊》(第二版，2004)進行形態特征及生理生化特征的鑒定。在平板培養基上劃線培養1天，菌落近似圓形，乳白色，表面暗，不透明，邊緣不整齊，菌落粗糙，粘著，擴展。菌落與培養基緊貼，不易挑取；液體培養有菌膜，無渾濁，無沉淀。單個細菌0.6×2.0微米。無莢膜，不成鏈，能運動。革蘭氏陽性菌，需氧菌。芽孢橢圓形至柱狀，中間膨大，芽孢在中間或偏一端，0.9×1.5微米。將jsc-69進行生理生化性狀檢測，結果：該菌株接觸酶試驗呈陽性。明膠液化，淀粉水解，v.p試驗陽性，檸檬酸鹽利用。甲基紅試驗呈陰性，卵磷脂酶試驗陰性，可利用硝酸鹽，可利用d-葡萄糖、l-阿拉伯糖、d-木糖和d-甘露醇產酸。基于形態特征、生理生化特性分析，認為jsc-69屬于bacilluslicheniformis新菌株，以命名為bacilluslicheniformisjsc-69。此菌株已于2017年01月05日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，編號為cgmccno：13533。實施例3菌株jsc-69的發酵培養與目標產物轉化1、擴大培養(1)一級種子培養：取新鮮培養約18小時的平板種子培養基上單克隆菌株，接種于6ml的液體種子培養基中，37℃、225rpm培養約24小時。平板種子培養基成分(/l)：牛肉膏5g，大豆蛋白胨10g，nacl5g，水1l，15g瓊脂。液體種子培養基成分(/l)：牛肉膏5g，大豆蛋白胨10g，nacl5g，水1l，ph值7.0。0.1mpa滅菌20min。(2)二級種子培養：取6ml一級種子培養液，接種于含200ml的二級種子培養液的1000ml搖瓶中，30℃、225rpm培養約24小時。至od600值為6.0-10。二級種子培養液基成分：0.1％蛋白胨，0.2％玉米漿，0.5％葡萄糖，0.5％酵母膏，ph8.0。(3)發酵罐發酵培養1)發酵培養基成分：見表2。初始ph6.5～7.0。表2發酵培養基成分名稱用量(g/l)蔗糖40豆粕40(nh4)2so45k2hpo4·3h2o8kh2po41.82)主要技術參數及優化篩選基本技術參數：接種量1％；發酵溫度31℃；ph6.7；發酵時間40h。在此基本技術參數基礎上，進行搖瓶試驗，對接種量、發酵溫度、ph、發酵時間等因素分別進行了優化篩選。搖瓶試驗方法：取菌株接種于裝有5ml種子培養基的試管中，30℃震蕩培養2天。然后轉接到裝有50ml發酵培養基的搖瓶中，發酵。發酵培養基中加入8g/l色氨酸底物。用hplc法精確測定發酵上清中5-羥色氨酸的含量。a)接種量的影響考察了不同接種量對5-羥色氨酸催化合成的影響。其它技術參數條件：發酵溫度31℃；ph6.7；發酵時間40h。結果見表3。表3不同接種量對5-羥色氨酸催化合成的影響接種量(％)5-羥色氨酸的含量(g/l)0.57.31.07.81.57.72.07.6從表3可以看出，接種量過低(0.5％)，或過高(2.0％)對色氨酸催化合成5-羥色氨酸均不利，以1.0％接種量為佳。可能接種量過低，不利于菌體生長；接種量過高，菌體生長過快容易衰老進而催化效果。b)發酵溫度的影響考察了不同發酵溫度對5-羥色氨酸催化合成的影響。其它技術參數條件：接種量1.0％；ph6.7；發酵時間40h。結果見表4。表4不同發酵溫度對5-羥色氨酸催化合成的影響發酵溫度(℃)5-羥色氨酸的含量(g/l)307.6317.7327.8337.6347.4357.3從表4可以看出，發酵溫度對色氨酸催化合成5-羥色氨酸有一定的影響，32℃以下較32℃催化效果差，但32℃以上也較32℃催化效果差，而且隨溫度升高，效果越來越差。以32℃發酵最佳。c)ph的影響考察了不同ph對5-羥色氨酸催化合成的影響。其它技術參數條件：接種量1.0％；發酵溫度32℃；發酵時間40h。結果見表5。表5不同ph對5-羥色氨酸催化合成的影響ph5-羥色氨酸的含量(g/l)6.57.26.67.36.77.76.87.96.97.77.07.3從表5可以看出，ph對色氨酸催化合成5-羥色氨酸有一定的影響，ph6.8以下或ph6.8以上均較ph6.8催化效果差，以ph6.8發酵時催化效果最佳。d)發酵時間的影響考察了不同發酵時間對5-羥色氨酸催化合成的影響。其它技術參數條件：接種量1.0％；發酵溫度32℃；ph6.8。結果見表6。表6不同ph對5-羥色氨酸催化合成的影響發酵時間(h)5-羥色氨酸的含量(g/l)306.7357.0407.8457.9507.8557.8從表6可以看出，不同發酵時間下色氨酸催化合成5-羥色氨酸有一定的差別，隨發酵時間延長，催化效果逐漸增加。但45h以后，催化效果已達到頂峰，之后不再增加。因此發酵時間以45h為佳。因此，經優化篩選，優化后技術參數：接種量1％；發酵溫度32℃；ph6.8；發酵時間45h。3)工藝操作種子制備要求：菌種鑒定符合特性，無變異，無雜菌。培養基配置：按配方準確稱量。蔗糖加適量水充分溶解；(nh4)2so4，k2hpo4·3h2o，kh2po4，加適量水充分溶解。消泡劑適量。發酵空罐滅菌：溫度121～130℃，保持流通蒸汽，罐壓0.09～0.15mpa，維持時間30分鐘。進料加水：調整總體積。發酵實罐滅菌：溫度121℃，罐壓0.08～0.15mpa，通氣量0.8～1.0vvm，維持時間30分鐘，保持流通蒸汽；最后降溫至30℃。接種：接種量1％。培養：溫度32℃，時間45小時，罐壓0.05～0.08mpa，ph6.8，do25％以上。芽孢形成率98％，培養終止，得到jsc-69轉化用菌液，液體菌數≥2.0×109cfu/ml。降溫保壓。2、目的產物轉化與生產(1)收集菌體細胞：取所述地衣芽孢桿菌jsc-69轉化用菌液在離心機上以4000r/min的轉速高心10min，收集菌體細胞沉淀。(2)轉化：將0.2m的磷酸鹽緩沖液(ph7.4)加到所述菌體細胞沉淀中，形成菌體濃度為3.0×107～8.0×107個/ml的菌懸液；然后加入濃度為8.0g/l的色氨酸，在32℃溫度下、通氣量為1.0l/min、以225r/min的轉速進行轉化，45h后，得到轉化液。所述0.2m的磷酸鹽緩沖液(ph7.4)的配制：將71.6gna2hpo4·12h2o溶于1000ml水，得到0.2mna2hpo4；然后將31.2gnah2po4·2h2o溶于1000ml水，得到0.2mnah2po4；最后，將19ml0.2m的nah2po4和81ml0.2m的na2hpo4混合均勻后即得。(3)固液分離：將所述轉化液在離心機上以4000r/min的轉速高心10min，得到含5-羥色氨酸上清液。地衣芽孢桿菌jsc-69以色氨酸為底物轉化生產5-羥色氨酸，24h轉化率達95％～100％。實施例4產物的純化與提取1、發酵液固液分離：采用離心或陶瓷膜分離法收集菌體。2、001×7陽離子交換樹脂(732)吸附分離，氨水洗脫。經篩選，001×7陽離子交換樹脂吸附分離效果最佳，適合于99％規格5-羥色氨酸的規模化生產。001×7樹脂吸附分離的條件為：在常溫下，上樣液5-羥色氨酸質量濃度為10.8mg/ml，調ph為3.5，以4.0ml/min的上樣速度上樣，以3倍樹脂體積的7.0％氨水以3.0ml/min的洗脫速度進行洗脫，洗脫液濃縮結晶后獲得的產品中5-羥色氨酸質量分數大于99.0％，灰分小于1.0％。3、濃縮成固體將洗脫液劑型雙效或多效蒸發濃縮成固體。烘干去除水分。4、熱水溶解，高選擇性的樹脂吸附分離將濃縮固體用熱水溶解，進一步用對5-羥色氨酸高度選擇性的樹脂吸附分離，去除雜質。氨水洗脫后，濃縮，結晶。得高純度5-羥色氨酸。實施例5產物分析方法產物分析方法為hplc檢測方法。采用shimadzuc18反相柱，0.05％的三氯乙酸(tca)-甲醇(68.75∶31.25，v/v)為流動相，對色氨酸和5-羥色氨酸的標準溶液和樣品進行色譜測定。進樣量：10μl，流動相流速：1.5ml/min等梯度洗脫，紫外分光光度檢測器的波長為275nm。所有溶液在使用前均用0.45μm濾膜過濾。用外標法進行計算。當前第1頁12