本(ben)發明專利申(shen)(shen)請(qing)(qing)是申(shen)(shen)請(qing)(qing)號為(wei)“20”的(de)發明專利的(de)分案申(shen)(shen)請(qing)(qing)，原申(shen)(shen)請(qing)(qing)的(de)申(shen)(shen)請(qing)(qing)日為(wei)“2014.09.03”，申(shen)(shen)請(qing)(qing)號為(wei)“20”，發明名稱為(wei)“鞘(qiao)(qiao)氨醇單(dan)胞菌的(de)蝦青素(su)合成酶及其編碼基因和鞘(qiao)(qiao)氨醇單(dan)胞菌遺傳操作(zuo)的(de)方法”。

本發明(ming)涉(she)及生(sheng)(sheng)物(wu)技(ji)術領域，具體(ti)涉(she)及鞘(qiao)氨醇(chun)單胞菌的β–胡蘿卜素羥化酶及其(qi)(qi)編碼基因與(yu)其(qi)(qi)在生(sheng)(sheng)產蝦青素中的應用。

背景技術：

蝦(xia)青素(su)(astaxanthin，又稱變(bian)(bian)胞藻(zao)(zao)黃素(su)或蝦(xia)紅素(su))，屬于(yu)酮式類(lei)胡蘿卜素(su)，是一種較強(qiang)的(de)(de)(de)天然抗氧化劑(ji)。其(qi)獨特(te)的(de)(de)(de)分子結構(gou)不(bu)但(dan)使其(qi)具有(you)(you)超強(qiang)的(de)(de)(de)抗氧化活性，還具有(you)(you)抗衰老、抗輻射、抗腫瘤(liu)及預(yu)防心腦血(xue)管疾病(bing)的(de)(de)(de)作用(yong)。目(mu)前，蝦(xia)青素(su)已(yi)在(zai)食品、飼(si)料、保健品市場等廣泛應用(yong)。然而(er)天然蝦(xia)青素(su)的(de)(de)(de)來(lai)源非常(chang)有(you)(you)限，目(mu)前，蝦(xia)青素(su)大多采(cai)用(yong)傳統突變(bian)(bian)技(ji)術產生(sheng)的(de)(de)(de)pfaffia菌株(zhu)和微藻(zao)(zao)生(sheng)產，但(dan)是，pfaffia發酵(jiao)存在(zai)發酵(jiao)周(zhou)期(qi)長的(de)(de)(de)缺點，而(er)從藻(zao)(zao)類(lei)中獲得產物的(de)(de)(de)生(sheng)產技(ji)術仍不(bu)成熟。因(yin)此，開發新的(de)(de)(de)天然蝦(xia)青素(su)資源具有(you)(you)重要意義。

鞘氨(an)醇(chun)單(dan)胞(bao)(bao)菌(jun)是革蘭(lan)氏陰(yin)性菌(jun)，1990年被鑒定，專(zhuan)性需氧(yang)，以(yi)單(dan)側生(sheng)極性鞭(bian)毛運動(dong)，多(duo)呈黃色(se)。其黃色(se)菌(jun)落多(duo)是由于產生(sheng)類胡蘿卜素導致。細胞(bao)(bao)膜與一般的(de)(de)(de)(de)革蘭(lan)氏陰(yin)性菌(jun)不同，為(wei)鞘糖脂，這也(ye)使(shi)得對其的(de)(de)(de)(de)遺傳(chuan)操作(zuo)還未(wei)成熟。目前，在sphingomonasatcc55669中(zhong)尚無任何基因方面(mian)的(de)(de)(de)(de)信息(xi)報道(dao)，也(ye)未(wei)有相關遺傳(chuan)操作(zuo)的(de)(de)(de)(de)文(wen)獻，即使(shi)是該菌(jun)株所在的(de)(de)(de)(de)屬也(ye)鮮(xian)有報道(dao)。目前，鞘氨(an)醇(chun)單(dan)胞(bao)(bao)菌(jun)多(duo)可降解(jie)多(duo)元(yuan)化的(de)(de)(de)(de)芳環化合物，是環境(jing)微(wei)生(sheng)物的(de)(de)(de)(de)研(yan)究熱點，其遺傳(chuan)操作(zuo)的(de)(de)(de)(de)建(jian)立為(wei)進一步利用其降解(jie)機制(zhi)建(jian)立了(le)基礎。

蝦(xia)(xia)青(qing)(qing)素(su)(su)(su)(su)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)合(he)成(cheng)(cheng)(cheng)途(tu)徑(jing)(jing)已被廣(guang)泛研(yan)究并取得(de)了巨大進展，大量關鍵酶基(ji)因得(de)到克隆。目(mu)前已知的(de)類(lei)胡(hu)(hu)蘿(luo)卜(bu)(bu)素(su)(su)(su)(su)均(jun)通過類(lei)異(yi)(yi)戊二(er)烯化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)或萜類(lei)化(hua)合(he)物(wu)(wu)(wu)途(tu)徑(jing)(jing)合(he)成(cheng)(cheng)(cheng)。其中(zhong)，非甲(jia)羥戊酸(suan)(suan)(suan)(suan)途(tu)徑(jing)(jing)mep(nonmevalonatepathway)途(tu)徑(jing)(jing)廣(guang)泛存在(zai)(zai)于細菌中(zhong)，它以糖(tang)酵解(jie)中(zhong)間代謝(xie)物(wu)(wu)(wu)丙(bing)酮(tong)(tong)酸(suan)(suan)(suan)(suan)和(he)(he)3-磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan)甘油(you)醛(quan)為(wei)前體，在(zai)(zai)脫氧(yang)(yang)木酮(tong)(tong)糖(tang)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan)合(he)酶作(zuo)(zuo)用(yong)下(xia)(xia)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)成(cheng)(cheng)(cheng)脫氧(yang)(yang)木酮(tong)(tong)糖(tang)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan)，然(ran)后(hou)受脫氧(yang)(yang)木酮(tong)(tong)糖(tang)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan)還(huan)原酶和(he)(he)異(yi)(yi)構(gou)酶催化(hua)，通過還(huan)原和(he)(he)異(yi)(yi)構(gou)反(fan)應將脫氧(yang)(yang)木酮(tong)(tong)糖(tang)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan)轉(zhuan)變(bian)成(cheng)(cheng)(cheng)2-甲(jia)基(ji)赤蘚(xian)(xian)糖(tang)醇(chun)-4-磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan)(mep)。經胞苷三磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan)活化(hua)，腺苷三磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan)化(hua)，從而形成(cheng)(cheng)(cheng)甲(jia)基(ji)赤蘚(xian)(xian)糖(tang)醇(chun)環化(hua)焦(jiao)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan)，然(ran)后(hou)轉(zhuan)變(bian)成(cheng)(cheng)(cheng)ipp(異(yi)(yi)戊烯焦(jiao)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan))，ipp異(yi)(yi)構(gou)化(hua)形成(cheng)(cheng)(cheng)dmapp(二(er)甲(jia)基(ji)丙(bing)烯基(ji)二(er)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan))。ipp和(he)(he)dmapp是合(he)成(cheng)(cheng)(cheng)蝦(xia)(xia)青(qing)(qing)素(su)(su)(su)(su)途(tu)徑(jing)(jing)的(de)前體物(wu)(wu)(wu)質。兩者在(zai)(zai)ipp異(yi)(yi)構(gou)酶作(zuo)(zuo)用(yong)下(xia)(xia)相(xiang)互轉(zhuan)換達(da)到平(ping)衡(heng)，在(zai)(zai)crte(牻(mang)牛兒(er)基(ji)牻(mang)牛兒(er)基(ji)焦(jiao)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan)合(he)成(cheng)(cheng)(cheng)酶)作(zuo)(zuo)用(yong)下(xia)(xia)，1個dmapp與3個ipp分(fen)子縮合(he)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)成(cheng)(cheng)(cheng)ggpp(牻(mang)牛兒(er)基(ji)牻(mang)牛兒(er)基(ji)焦(jiao)磷(lin)(lin)(lin)(lin)(lin)酸(suan)(suan)(suan)(suan))。2分(fen)子ggpp在(zai)(zai)crtb(八(ba)氫番(fan)(fan)茄(qie)(qie)(qie)紅素(su)(su)(su)(su)合(he)成(cheng)(cheng)(cheng)酶)作(zuo)(zuo)用(yong)下(xia)(xia)形成(cheng)(cheng)(cheng)第一個無色(se)的(de)類(lei)胡(hu)(hu)蘿(luo)卜(bu)(bu)素(su)(su)(su)(su)——八(ba)氫番(fan)(fan)茄(qie)(qie)(qie)紅素(su)(su)(su)(su)。八(ba)氫番(fan)(fan)茄(qie)(qie)(qie)紅素(su)(su)(su)(su)經過連續的(de)脫氫步驟(crti)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)成(cheng)(cheng)(cheng)番(fan)(fan)茄(qie)(qie)(qie)紅素(su)(su)(su)(su)。番(fan)(fan)茄(qie)(qie)(qie)紅素(su)(su)(su)(su)在(zai)(zai)crty(番(fan)(fan)茄(qie)(qie)(qie)紅素(su)(su)(su)(su)β-環化(hua)酶)的(de)作(zuo)(zuo)用(yong)下(xia)(xia)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)成(cheng)(cheng)(cheng)β-胡(hu)(hu)蘿(luo)卜(bu)(bu)素(su)(su)(su)(su)。β-胡(hu)(hu)蘿(luo)卜(bu)(bu)素(su)(su)(su)(su)在(zai)(zai)crtz(β-胡(hu)(hu)蘿(luo)卜(bu)(bu)素(su)(su)(su)(su)羥化(hua)酶)和(he)(he)crtw(β-胡(hu)(hu)蘿(luo)卜(bu)(bu)素(su)(su)(su)(su)酮(tong)(tong)酶)的(de)一系列作(zuo)(zuo)用(yong)下(xia)(xia)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)成(cheng)(cheng)(cheng)蝦(xia)(xia)青(qing)(qing)素(su)(su)(su)(su)(如圖1)。

通過豐富不同來源(yuan)的蝦青(qing)(qing)素(su)生(sheng)物(wu)(wu)合(he)(he)成(cheng)相(xiang)關(guan)基因，經重(zhong)組dna技術篩選，從而(er)增加蝦青(qing)(qing)素(su)生(sheng)物(wu)(wu)合(he)(he)成(cheng)的生(sheng)產能力，是縮短發酵周期，提高蝦青(qing)(qing)素(su)生(sheng)物(wu)(wu)合(he)(he)成(cheng)產率(lv)的重(zhong)要途徑，從而(er)為蝦青(qing)(qing)素(su)進一步工業化生(sheng)產打下基礎。

技術實現要素：

本發(fa)明的(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)在于(yu)提供鞘(qiao)氨醇(chun)單胞(bao)菌(jun)的(de)(de)(de)蝦青素(su)生物合成途徑中(zhong)的(de)(de)(de)β–胡(hu)(hu)蘿卜素(su)羥化酶(mei)，以及該酶(mei)的(de)(de)(de)編(bian)碼(ma)基(ji)因。本發(fa)明的(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)還在于(yu)提供所述(shu)β–胡(hu)(hu)蘿卜素(su)羥化酶(mei)或其(qi)編(bian)碼(ma)基(ji)因在生產蝦青素(su)中(zhong)的(de)(de)(de)應用。

本發(fa)明的目的通(tong)過下述技術方案實現：

本發明通(tong)過(guo)對鞘氨醇單(dan)胞菌(jun)的(de)(de)提取產物進行檢(jian)測，證實鞘氨醇單(dan)胞菌(jun)可以產生蝦青(qing)素(su)，含(han)有能夠產生蝦青(qing)素(su)的(de)(de)生物合成途徑。并進一(yi)步證實了在鞘氨醇單(dan)胞菌(jun)合成蝦青(qing)素(su)的(de)(de)這條線性通(tong)路中，與現有已知(zhi)基因(yin)(yin)同源性較低的(de)(de)crte、crtz基因(yin)(yin)具(ju)有相應的(de)(de)功能。

鞘氨醇單胞(bao)菌(jun)的(de)ggpp合成(cheng)酶(mei)(crte)，為296個氨基酸組成(cheng)的(de)蛋白(bai)質，其氨基酸序(xu)列(lie)如seqidno.1所(suo)示；該(gai)ggpp合成(cheng)酶(mei)的(de)編(bian)碼基因為gene3518，其核苷(gan)酸序(xu)列(lie)如seqidno.2所(suo)示。

鞘(qiao)氨醇(chun)單胞(bao)菌(jun)的(de)(de)(de)β–胡(hu)蘿卜(bu)素羥化(hua)(hua)酶(mei)(mei)(mei)(crtz)，為(wei)172個氨基(ji)酸(suan)組成(cheng)的(de)(de)(de)蛋(dan)白質，其(qi)(qi)(qi)氨基(ji)酸(suan)序列如(ru)(ru)seqidno.3所示；該(gai)β–胡(hu)蘿卜(bu)素羥化(hua)(hua)酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)編(bian)碼(ma)基(ji)因(yin)為(wei)gene2930，其(qi)(qi)(qi)核(he)苷酸(suan)序列如(ru)(ru)seqidno.4所示。或鞘(qiao)氨醇(chun)單胞(bao)菌(jun)的(de)(de)(de)β–胡(hu)蘿卜(bu)素羥化(hua)(hua)酶(mei)(mei)(mei)(crtz)，為(wei)155個氨基(ji)酸(suan)組成(cheng)的(de)(de)(de)蛋(dan)白質，其(qi)(qi)(qi)氨基(ji)酸(suan)序列如(ru)(ru)seqidno.5所示；該(gai)β–胡(hu)蘿卜(bu)素羥化(hua)(hua)酶(mei)(mei)(mei)的(de)(de)(de)編(bian)碼(ma)基(ji)因(yin)為(wei)gene1181，其(qi)(qi)(qi)核(he)苷酸(suan)序列如(ru)(ru)seqidno.6所示。

上(shang)述ggpp合成(cheng)酶(mei)、β–胡蘿(luo)卜(bu)素羥(qian)化酶(mei)或其編碼基因(yin)在生(sheng)產蝦青素中的應(ying)用。

一種生(sheng)產蝦青(qing)素的方法，包括如下步驟(zou)：將產蝦青(qing)素質(zhi)粒中的crte基(ji)(ji)因(yin)或(huo)crtz基(ji)(ji)因(yin)替換(huan)為上述ggpp合成酶(mei)或(huo)β–胡蘿卜素羥(qian)化酶(mei)的編(bian)碼基(ji)(ji)因(yin)；再(zai)將基(ji)(ji)因(yin)替換(huan)后的質(zhi)粒轉化到大腸桿菌中，通過(guo)誘(you)導表達(da)生(sheng)產蝦青(qing)素。

所述的產蝦(xia)青素質粒(li)為pfz153，其(qi)構建包括如(ru)下步驟：

(1)大(da)腸(chang)桿菌(jun)來源的idi基因通過pcr擴增克隆(long)到載體pet28a(+)上獲得(de)(de)質粒pgzi，將idi基因片段從(cong)pgzi中用(yong)ndei和xhoi切(qie)下插入到petduet-1相應位點獲得(de)(de)pfz87；

(2)以pfz87為模板用引物pagcrty-idi-r和(he)pagcrtw-petduet-f擴增質粒骨(gu)架；

從cgmcc1.2244基因組dna擴(kuo)增crty和crtz，引物分(fen)別為idi-pagcrty-f、crtz-pagcrty-r，crty-pagcrtz-f、crtw-pagcrtz-r；

合成seqidno.7所(suo)示(shi)的(de)crtw，以其為模板(ban)用引物crtz-brecrtw-f和brecrtw-r擴增crtw；

crty、crtz、crtw和質粒骨架四個片段用giboson方法(fa)連接(jie)獲得pfz152；

(3)合成(cheng)序(xu)列分(fen)別如seqidno.8、9、10所示的crte、crtb和(he)crti，將(jiang)crte、crtb和(he)crti分(fen)別克隆到pet28a(+)的ndei和(he)ecori位點獲得(de)pfz21、pfz22和(he)pfz23；

(4)以構建(jian)pfz152同樣的方法分(fen)別以pfz87、pfz21、pfz22、pfz23為模板用引(yin)物petduet-ncoi-r、petduet-ecori-t7-f，duet-pancrte-f、pancrti-crte-r，pancrte-crti-f、pancrtb-crti-r，pancrti-crtb-f、duet-ecori-pancrtb-r擴增質粒(li)骨架，crte，crti和crtb，用giboson方法連接(jie)獲得質粒(li)pfz112；

(5)將crte-crti-crtb用ndei和ecori從pfz112上切下(xia)插入到(dao)pfz152對應的位(wei)點獲(huo)得pfz153；

上述各(ge)引物序列如下：

pagcrty-idi-r:cagatcataccgcggcatagtgtaatcctcctttatttaagctgggtaaatg，

pagcrtw-petduet-f:cttatggcgtggtgagagctaactcgagtctggtaaagaaaccgc，

idi-pagcrty-f:acccagcttaaataaaggaggattacactatgccgcggtatgatctgattc，

crtz-pagcrty-r:gcattccaaatccacaacatatagtaatcctccttcattgcatcgcctgttgac，

crty-pagcrtz-f:caggcgatgcaatgaaggaggattactatatgttgtggatttggaatgccctga，

crtw-pagcrtz-r:ccactgcggcggtcattactcattcctcctttacttcccgggtggcgcgtc，

crtz-brecrtw-f:cgccacccgggaagtaaaggaggaatgagtaatgaccgccgcagtggcagag，

brecrtw-r:gcggtttctttaccagactcgagttagctctcaccacgccataag，

petduet-ncoi-r:catggtatatctccttcttaaagttaaac，

petduet-ecori-t7-f:taactagtgaattcgagctcggcgcgcctg，

duet-pancrte-f:gaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgaccgtgtgtgcgaaaaaac，

pancrti-crte-r:tcaccgtggtcggtttcatggttaattcctcctttacgacaccgctgccag，

pancrte-crti-f:ctggcagcggtgtcgtaaaggaggaattaaccatgaaaccgaccacggtga，

pancrtb-crti-r:tcagcagggacggattattcatgagtattacctcctttaaatcaggtcttccagcatc，

pancrti-crtb-f:gatgctggaagacctgatttaaaggaggtaatactcatgaataatccgtccctgctga，

duet-ecori-pancrtb-r:ttgtcgacctgcaggcgcgccgagctcgaattcactagttaaacggggcgctgccagag。

本(ben)發明具有如下優(you)點和效果：

本發明證(zheng)實(shi)鞘(qiao)氨醇單胞菌可以(yi)產生蝦(xia)青(qing)(qing)素，含有能(neng)夠產生蝦(xia)青(qing)(qing)素的生物合成(cheng)途徑；并進(jin)一步證(zheng)實(shi)了與(yu)現有已(yi)知基(ji)因(yin)同(tong)(tong)源性較(jiao)低(gene3518基(ji)因(yin)與(yu)目(mu)前(qian)已(yi)知crte基(ji)因(yin)的同(tong)(tong)源性低于30％，gene2930和(he)gene1181與(yu)目(mu)前(qian)已(yi)知crtz基(ji)因(yin)的同(tong)(tong)源性約為60％)的crte、crtz基(ji)因(yin)具(ju)有相應的功能(neng)。

本發明(ming)的(de)ggpp合(he)成酶、β–胡(hu)蘿(luo)卜素(su)羥化酶及其編碼基因，豐富了細菌生物合(he)成類胡(hu)蘿(luo)卜素(su)的(de)基因多樣性，并(bing)為生物合(he)成代謝改造類胡(hu)蘿(luo)卜素(su)提供了更(geng)多資源。

附圖說明

圖1是蝦青素合(he)成路線圖。

圖2是(shi)lc-ms檢測sphingomonasatcc55669中蝦青(qing)素(su)結果。

圖3是pfz153質粒圖譜。

圖(tu)4是ptm3518質粒(li)圖(tu)譜。

圖(tu)(tu)5是ptm2930質粒(li)圖(tu)(tu)譜。

圖6是ptm1181質粒圖譜。

圖7是hplc檢測轉(zhuan)(zhuan)化不同質粒的(de)mg1655菌株的(de)蝦青素(su)生成；2-5分別是轉(zhuan)(zhuan)化pfz153、ptm3518、ptm2930和ptm1181的(de)菌株，1是蝦青素(su)標準品(濃度為1ppm)。

圖8是轉化不(bu)同質(zhi)粒的mg1655菌株的蝦青(qing)素產量對比。

具體實施方式

以下(xia)實(shi)施例進(jin)一步說明本(ben)發明的(de)內容，但不(bu)應理(li)解為對本(ben)發明的(de)限制。在不(bu)背離(li)本(ben)發明精神(shen)和實(shi)質的(de)情況下(xia)，對本(ben)發明方法、步驟或條件所作的(de)修改或替換，均(jun)屬于(yu)本(ben)發明的(de)范圍。

除非有(you)特(te)殊(shu)說明(ming)，本發(fa)明(ming)中的寡核(he)(he)苷酸引物由(you)蘇(su)州金(jin)唯智(zhi)生物科技(ji)有(you)限(xian)公司合成；dna序列測定由(you)蘇(su)州金(jin)唯智(zhi)生物科技(ji)有(you)限(xian)公司完成；除非特(te)殊(shu)說明(ming)，本發(fa)明(ming)所(suo)用(yong)限(xian)制性內切酶、核(he)(he)酸外切酶、連接(jie)酶均(jun)購(gou)自neb，dna片段回收采用(yong)omegadna凝膠回收試劑(ji)盒，按說明(ming)書(shu)方(fang)法操作；pcr純化采用(yong)axygen試劑(ji)盒，按說明(ming)書(shu)方(fang)法操作。

下述實施例中所用(yong)引物見下表(biao)。

實施例1鞘氨醇單胞菌中蝦(xia)青(qing)素產物的檢測

提(ti)取鞘氨醇(chun)單胞(bao)菌sphingomonasatcc55669(從atcc購買(mai))代謝(xie)產(chan)物，方法如下：

將(jiang)菌(jun)種(zhong)在#272培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)平板(營養(yang)(yang)肉(rou)(rou)湯8g/l，葡萄糖5g/l，瓊(qiong)脂1.6％)上活化，于26℃培(pei)(pei)養(yang)(yang)。挑菌(jun)落至5ml#272培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)(營養(yang)(yang)肉(rou)(rou)湯8g/l，葡萄糖5g/l)中(zhong)(zhong)26℃、220rpm培(pei)(pei)養(yang)(yang)，24h后(hou)轉接(jie)至100ml#272培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)中(zhong)(zhong)26℃、220rpm培(pei)(pei)養(yang)(yang)，od600至0.8時(shi)，轉接(jie)至300ml#272培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)(ji)中(zhong)(zhong)26℃、220rpm培(pei)(pei)養(yang)(yang)，60h后(hou)收菌(jun)。

將菌液于8000rpm離心10min，收集菌體，加入10ml萃取劑(v丙酮:v甲醇＝4:1)，震蕩打散菌體后，萃取10min，8000rpm、4℃離心5min，移出上清，按上述步驟再萃取3次，收集上清，旋干，加入3ml丙酮溶解，13000rpm離心10min，取上清lc-ms檢測，提取過程避光。lc-ms檢測結果見圖2，蝦青素的分子量為596.39，經過質譜檢測器帶一個h⁺，為(wei)597.39，表明鞘氨醇單胞(bao)菌sphingomonasatcc55669可以(yi)產生蝦青素。

實施(shi)例2鞘(qiao)氨醇單胞菌中相關(guan)蝦(xia)青素生物合成基因的確定

由實(shi)施例(li)1可知，鞘氨醇單胞菌(jun)(jun)(jun)(jun)sphingomonasatcc55669可以產生(sheng)蝦(xia)(xia)青(qing)素，該菌(jun)(jun)(jun)(jun)株中(zhong)(zhong)含(han)有能夠產生(sheng)蝦(xia)(xia)青(qing)素的生(sheng)物合(he)成(cheng)(cheng)途(tu)(tu)徑(jing)。將鞘氨醇單胞菌(jun)(jun)(jun)(jun)基(ji)因組(zu)信息在(zai)ncbi(//www.ncbi.nlm.nih.gov/)blastp中(zhong)(zhong)進行比對，發(fa)現鞘氨醇單胞菌(jun)(jun)(jun)(jun)中(zhong)(zhong)存在(zai)mep途(tu)(tu)徑(jing)，該途(tu)(tu)徑(jing)從丙酮酸經dxs，dxr，ispe，ispdf，ispg，isph合(he)成(cheng)(cheng)ipp和dmapp。ipp和dmapp經類(lei)胡蘿卜(bu)素合(he)成(cheng)(cheng)途(tu)(tu)徑(jing)通過crte，crtb，crti，crty，crtz，crtw生(sheng)成(cheng)(cheng)蝦(xia)(xia)青(qing)素。在(zai)鞘氨醇單胞菌(jun)(jun)(jun)(jun)合(he)成(cheng)(cheng)蝦(xia)(xia)青(qing)素的這條線性(xing)通路中(zhong)(zhong)，所得基(ji)因除crte、crtz，其(qi)他基(ji)因均為唯(wei)一(yi)。

實施(shi)例3鞘氨(an)醇單胞菌crte基因和crtz基因的擴增

從鞘氨醇單胞菌sphingomonasatcc55669中提(ti)取基(ji)因(yin)組dna，提(ti)取方(fang)法如下：

(1)取50ml新鮮菌液至尖底(di)離心管，7000rpm×5min離心，棄上清(qing)。

(2)加(jia)10ml的(de)ddh2o，于(yu)振蕩器上打散，7000rpm×5min離心，棄(qi)上清。

(3)加10ml的(de)setbuffer(75mmnacl，25mmedta，20mmtris-cl)，于振蕩器上打(da)散，7000rpm×5min離心，棄(qi)上清(qing)。

(4)加5ml的setbuffer，于振蕩器上打散(san)，加150μl的溶(rong)菌酶(lysozyme，100mg/ml，-20℃)，37℃水浴30-60min，每隔5-10min緩(huan)慢搖勻一次，至(zhi)細(xi)胞(bao)壁完全裂(lie)解(jie)(鑒定細(xi)胞(bao)壁完全裂(lie)解(jie)：取少量菌液，加1滴10％sds，菌液清澈(che)，拉絲)。

(5)加10μlrnasea(10mg/ml)，37℃水浴10min。加250μl的蛋(dan)白酶k(proteinasek，20mg/ml，-20℃)，37℃水浴30min。

(6)加5ml10％sds，55℃水浴2h，每隔15min輕輕搖勻(yun)一次。

(7)加2ml5mnacl，輕輕搖勻，有白色沉(chen)淀析出。

(8)將(jiang)液(ye)體轉移至(zhi)50ml圓(yuan)底離(li)心(xin)(xin)(xin)管(beckman)，加10ml氯仿，緩慢搖勻30min(注(zhu)意放氣)，12000rpm×15min離(li)心(xin)(xin)(xin)(轉子ja25.50，beckman)，取(qu)上(shang)清液(ye)(大口槍頭)，重復(fu)步驟(8)2次(ci)，最后一(yi)次(ci)將(jiang)上(shang)清轉移至(zhi)50ml尖(jian)底離(li)心(xin)(xin)(xin)管。

(9)加(jia)0.8倍體積(ji)的(de)異丙醇(chun)，輕搖混(hun)勻至(zhi)出現(xian)絲狀dna。將dna挑(tiao)至(zhi)ep管中，加(jia)70％的(de)乙(yi)醇(chun)洗2次，倒掉乙(yi)醇(chun)，自然風干(gan)，室(shi)溫溶于一定量的(de)ddh2o中。

將提取的基(ji)因(yin)組dna作(zuo)為pcr模(mo)(mo)板(ban)，利用引物(wu)(wu)duet-pan3518-f2和pancrti-3518-r擴增出(chu)鞘氨醇單胞菌的crte(gene3518)基(ji)因(yin)。pcr反應(ying)體(ti)系(xi)為40μl：15.4μlh2o，8μl5×q5reactionbuffer，8μl5×highgcenhancer，3.2μl2.5mmdntps，2μl10mm正向(xiang)(xiang)引物(wu)(wu)，2μl10mm反向(xiang)(xiang)引物(wu)(wu)，1μl模(mo)(mo)板(ban)dna(1-100ng)，0.4μlq5high-fidelitydnapolymerase。pcr反應(ying)程序為：98℃預變性30s；98℃變性10s，58℃退火30s，72℃延(yan)伸(shen)30s，30個(ge)循環(huan)；最后以72℃延(yan)伸(shen)6min。

利(li)用引物(wu)crty-pag2930-f和crtw-pag2930-r擴(kuo)增出鞘氨(an)醇(chun)單(dan)胞菌的crtz(gene2930)基因(yin)，利(li)用引物(wu)crty-pag1181-f2和crtw-pag1181-r擴(kuo)增出鞘氨(an)醇(chun)單(dan)胞菌的crtz(gene1181)基因(yin)，兩個(ge)反(fan)應的pcr反(fan)應體系均為40μl：23.4μlh2o，8μl5×q5reactionbuffer，3.2μl2.5mmdntps，2μl10mm正向引物(wu)，2μl10mm反(fan)向引物(wu)，1μl模(mo)板dna(1-100ng)，0.4μlq5high-fidelitydnapolymerase。pcr反(fan)應程序為：98℃預變性30s；98℃變性10s，55℃退火30s，72℃延(yan)伸(shen)30s，30個(ge)循環；最后(hou)以72℃延(yan)伸(shen)5min。

實施例4crte基(ji)因(yin)和crtz基(ji)因(yin)的功能驗(yan)證

本實(shi)施例通過gibsonmethod構建有(you)關(guan)克(ke)隆質粒，驗(yan)證crte基(ji)因和crtz基(ji)因的功能。

圖3所(suo)示為已知蝦青素生物合成相關基因的(de)克(ke)隆質粒pfz153，其構(gou)建方法見下(xia)。

圖4所示(shi)為(wei)將pfz153中crte基因替(ti)換為(wei)gene3518后構(gou)建(jian)的質粒ptm3518。

圖5所(suo)示為(wei)將pfz153中crtz基因(yin)替換為(wei)gene2930后構(gou)建的質粒ptm2930。

圖(tu)6所示為將(jiang)pfz153中(zhong)crtz基因替(ti)換為gene1181后構建的質粒ptm1181。

1、產蝦青素(su)的(de)陽性克隆質粒pfz153的(de)構建：

質粒pfz153以petduet-1為骨架(jia)載(zai)體(ti)，插(cha)入片(pian)段crteib-idi-crtyzw完成，具體(ti)構建方法如下：

大腸桿菌來(lai)源(yuan)的(de)idi基(ji)因通過pcr擴增(zeng)克隆到(dao)載體pet28a(+)上獲(huo)得質粒pgzi(fayinzhu,invitroreconstitutionofmevalonatepathwayandtargetedengineeringoffarneseneoverproductioninescherichiacoli.biotechnol.bioeng.2014；111:1396–1405.)，將idi基(ji)因片段從pgzi中(zhong)用ndei和xhoi切下插入到(dao)petduet-1相(xiang)應位點(dian)獲(huo)得pfz87。

以pfz87為模(mo)板用引(yin)物pagcrty-idi-r和pagcrtw-petduet-f擴(kuo)(kuo)增(zeng)質(zhi)粒骨(gu)架(jia)。從cgmcc1.2244基(ji)因組(zu)dna擴(kuo)(kuo)增(zeng)crty和crtz，引(yin)物分別為idi-pagcrty-f，crtz-pagcrty-r；crty-pagcrtz-f，crtw-pagcrtz-r。來(lai)源(yuan)于brevundimonassp.sd212的(de)crtw經密碼子優化后合成，以優化的(de)crtw(seqidno.7)為模(mo)板，用引(yin)物crtz-brecrtw-f和brecrtw-r擴(kuo)(kuo)增(zeng)crtw。crty、crtz、crtw和質(zhi)粒骨(gu)架(jia)四(si)個片段用giboson方法(fa)連接(danielg.gibson,enzymaticassemblyofoverlappingdnafragments,methodsinenzymology,volume498,2011,pages349-361.)獲得pfz152。

將(jiang)經密碼子優化的(de)pantoeaananatis的(de)crte(seqidno.8)、crtb(seqidno.9)和crti(seqidno.10)基(ji)因合成(cheng)后(基(ji)因合成(cheng)時在序列兩端(duan)加ndei和ecori酶切位點)克隆到pet28a(+)的(de)ndei和ecori位點獲得pfz21、pfz22和pfz23。

以構建pfz152同樣的方法分別(bie)以pfz87，pfz21，pfz22，pfz23為模板用引物petduet-ncoi-r，petduet-ecori-t7-f；duet-pancrte-f，pancrti-crte-r；pancrte-crti-f，pancrtb-crti-r；pancrti-crtb-f，duet-ecori-pancrtb-r擴增(zeng)質粒骨(gu)架，crte，crti和crtb，用giboson方法連接獲得(de)質粒pfz112。

將crte-crti-crtb用ndei和ecori從pfz112上切下(xia)插(cha)入到(dao)pfz152對(dui)應的位點獲得pfz153。

2、含有目的片(pian)段(duan)的ptm3518，ptm2930，ptm1181質粒構建：

該步pcr擴(kuo)增模(mo)板均為質粒pfz153。

(1)質粒構建所需片段的(de)擴增(zeng)

質粒ptm3518由片段gene3518，petduet-1(3518)，crtib-idi-crtyzw(3518)構(gou)成。其中(zhong)，gene3518片段的擴(kuo)增見實施例3。petduet-1(3518)和(he)crtib-idi-crtyzw(3518)片段的擴(kuo)增如下：

利用(yong)引(yin)物(wu)pagcrtw-petduet-f和petduet-ncoi-r擴(kuo)增出petduet-1(3518)片段，利用(yong)引(yin)物(wu)pan3518-crti-f和brecrtw-r擴(kuo)增出crtib-idi-crtyzw(3518)片段，兩個(ge)反(fan)應的pcr反(fan)應體系均為40μl：23.4μlh2o，8μl5×q5reactionbuffer，3.2μl2.5mmdntps，2μl10mm正向(xiang)引(yin)物(wu)，2μl10mm反(fan)向(xiang)引(yin)物(wu)，1μl模板dna(1-100ng)，0.4μlq5high-fidelitydnapolymerase。pcr反(fan)應程序為：98℃預變(bian)性30s；98℃變(bian)性10s，55℃退火30s，72℃延伸(shen)3min，30個(ge)循環；最后(hou)以(yi)72℃延伸(shen)7min。

質粒ptm2930由(you)片(pian)段(duan)gene2930，crtw-petduet-1(2930)，crteib-idi-crty(2930)構成。其中，gene2930片(pian)段(duan)的(de)(de)擴增見實施例3。crtw-petduet-1(2930)和crteib-idi-crty(2930)片(pian)段(duan)的(de)(de)擴增如下：

利(li)用引(yin)(yin)物2930-brecrtw-f和(he)petduet-ncoi-r擴增(zeng)出crtw-petduet-1(2930)片段(duan)，利(li)用引(yin)(yin)物duet-pancrte-f和(he)2930-pagcrty-r擴增(zeng)出crteib-idi-crty(2930)片段(duan)，兩個反應(ying)的pcr反應(ying)體系(xi)均為40μl：23.4μlh2o，8μl5×q5reactionbuffer，3.2μl2.5mmdntps，2μl10mm正向(xiang)引(yin)(yin)物，2μl10mm反向(xiang)引(yin)(yin)物，1μl模板dna(1-100ng)，0.4μlq5high-fidelitydnapolymerase。pcr反應(ying)程(cheng)序為：98℃預變性(xing)30s；98℃變性(xing)10s，55℃退火30s，72℃延(yan)伸(shen)3min，30個循(xun)環；最后以72℃延(yan)伸(shen)7min。

質粒ptm1181由片段gene1181，crtw-petduet-1(1181)，crteib-idi-crty(1181)構成。其中，gene1181片段的(de)擴(kuo)增見實施例(li)3。crtw-petduet-1(1181)和(he)crteib-idi-crty(1181)片段的(de)擴(kuo)增如(ru)下：

利(li)(li)用引(yin)物(wu)1181-brecrtw-f和petduet-ncoi-r擴增出crtw-petduet-1(1181)片(pian)段，利(li)(li)用引(yin)物(wu)duet-pancrte-f和1181-pagcrty-r2擴增出crteib-idi-crty(1181)片(pian)段，兩個(ge)反(fan)應(ying)的pcr反(fan)應(ying)體(ti)系均為40μl：23.4μlh2o，8μl5×q5reactionbuffer，3.2μl2.5mmdntps，2μl10mm正向引(yin)物(wu)，2μl10mm反(fan)向引(yin)物(wu)，1μl模(mo)板(ban)dna(1-100ng)，0.4μlq5high-fidelitydnapolymerase。pcr反(fan)應(ying)程序為：98℃預變性(xing)30s；98℃變性(xing)10s，55℃退火30s，72℃延伸(shen)3min，30個(ge)循環；最后以72℃延伸(shen)7min。

(2)克(ke)隆(long)質粒的(de)獲得

電泳鑒定(ding)pcr擴增(zeng)產(chan)物(wu)正(zheng)確后，經過膠回收(shou)各pcr擴增(zeng)產(chan)物(wu)，用nanodrop測定(ding)各pcr產(chan)物(wu)濃度。片段petduet-1(3518)，crtib-idi-crtyzw(3518)，gene3518；crtw-petduet-1(2930)，crteib-idi-crty(2930)，gene2930；crtw-petduet-1(1181)，crteib-idi-crty(1181)，gene1181分別用giboson方法連接獲(huo)得質(zhi)粒ptm3518、ptm2930、ptm1181。

3、將質(zhi)粒(li)ptm3518、ptm2930、ptm1181、pfz153分別轉(zhuan)(zhuan)化感受態(tai)細胞mg1655(內含質(zhi)粒(li)pmh1、pfz81(fayinzhu,invitroreconstitutionofmevalonatepathwayandtargetedengineeringoffarneseneoverproductioninescherichiacoli,biotechnol.bioeng.2014；111:1396–1405.)。挑轉(zhuan)(zhuan)化子于含有(you)34μg/ml氯(lv)霉(mei)素(su)(su)、50μg/ml卡那(nei)霉(mei)素(su)(su)、100μg/ml氨(an)芐青霉(mei)素(su)(su)的lb培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)中于37℃、220rpm培(pei)(pei)養(yang)(yang)過(guo)夜。以1％接種量轉(zhuan)(zhuan)接200ml含有(you)34μg/ml氯(lv)霉(mei)素(su)(su)、50μg/ml卡那(nei)霉(mei)素(su)(su)、100μg/ml氨(an)芐青霉(mei)素(su)(su)的lb培(pei)(pei)養(yang)(yang)基(ji)30℃、200rpm培(pei)(pei)養(yang)(yang)，陰性對照(zhao)為內含質(zhi)粒(li)pmh1和質(zhi)粒(li)pfz81的mg1655菌株。od600達到0.7-0.9時加終濃度0.1mmiptg(異丙(bing)基(ji)-β-d-硫代半乳(ru)糖苷)誘導，培(pei)(pei)養(yang)(yang)15h后取(qu)樣2ml，12000rpm離(li)(li)心(xin)3min，去上(shang)清，加1ml萃取(qu)劑(v丙(bing)酮:v甲醇＝4:1)，震蕩打散(san)菌體(ti)后，超聲10min，13000rpm、4℃離(li)(li)心(xin)10min，取(qu)上(shang)清hplc檢測，提(ti)取(qu)過(guo)程避(bi)光。

4、產物(wu)高效液相(xiang)色譜(hplc)檢測

hplc分析條(tiao)件：色譜柱：4.6×250mm5μmdionexacclaim120c18。流動相：a：水，b：乙腈(0.1％甲酸)；0min：50％b，5min：100％b，20min：100％b，25min：50％b，27min：50％b。流速1ml/min。上樣量：20μl。柱溫：25℃。檢測器：紫(zi)外多波長(chang)(vwd)檢測器。標準品為(wei)1mg/l蝦青素。

經hplc檢測結果(guo)(圖7)可知(zhi)，分別轉化了(le)pfz153、ptm3518、ptm2930、ptm1181質(zhi)粒(li)(li)的(de)mg1655(內含(han)質(zhi)粒(li)(li)pmh1、pfz81)的(de)各個(ge)菌株的(de)提取產(chan)物，在與蝦(xia)青素標準(zhun)品(pin)的(de)同一保留時間下，均可檢測到蝦(xia)青素的(de)生成(cheng)，但(dan)含(han)量有高低(di)差別。其中(zhong)，轉化質(zhi)粒(li)(li)ptm3518的(de)mg1655菌株(內含(han)質(zhi)粒(li)(li)pmh1、pfz81)蝦(xia)青素產(chan)量可達2.5mg/l(如圖8)。上(shang)述結果(guo)說明(ming)鞘氨醇單(dan)胞(bao)菌的(de)crte(gene3518)基(ji)因、crtz(gene2930)基(ji)因和(he)crtz(gene1181)基(ji)因具有相應的(de)功(gong)能。

sequencelisting

<110>武漢生物技術研(yan)究(jiu)院，武漢大(da)學(xue)

&lt;120>鞘氨(an)醇單胞菌的(de)β–胡蘿卜素(su)羥化酶(mei)及其(qi)(qi)編碼基(ji)因與其(qi)(qi)在生產蝦青素(su)中的(de)應用(yong)

<130>1

<160>10

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>296

<212>prt

<213>sphingomonasatcc55669

<400>1

metthrthrthrleuaspalaalaleualaargmetseralaaspile

151015

aspalaargphealaargleuleualaileproaspaspproargala

202530

aspleutyrargalametarghisalaalaileglyglyglylysarg

354045

leuargproleuleuvalglyalathralaaspleupheglyvalasp

505560

argaspcysserglyaspvalalaleualavalglualailehisval

65707580

tyrserleuilehisaspaspleuproalametaspaspaspaspleu

859095

argargglylysprothrvalhislysalapheaspglualathrala

100105110

ileleualaglyaspcysleuhisalaleualaphegluileleuala

115120125

aspproargthrhisalaaspprophevalargalagluleuvalmet

130135140

gluleualaargalaserglyproglyglymetalaglyglyglnmet

0

metaspleuvalalagluargserargpheaspleualathrvalthr

165170175

argleuglnglnmetlysthrglyalaleuileservalservalglu

180185190

leuglyalaileleuglyargvalproprogluglyargargserleu

195200205

hisglytyralahisaspleuglyleualapheglnilealaaspasp

210215220

leuleuaspalagluglyaspglualavalvalglylysalaleuarg

225230235240

lysaspglyglualaglylysgluthrpheleuserleuleuglyval

245250255

aspargalaarggluglncysargmetleuvalaspglnalavalarg

260265270

hisleuhisglytyrglyalaglualaaspvalleuarggluvalala

275280285

argtyrvalvalgluargasparg

290295

<210>2

<211>891

<212>dna

<213>sphingomonasatcc55669

<400>2

atgacgacgacgctcgatgcggcactggcgcgcatgtccgcggacatcgacgcgcggttc60

gcccggctgctggcgatccccgacgatccccgcgccgatctgtatcgcgcgatgcggcat120

gcggcgatcggcggcggcaagcggctgcggccgctgctggtcggcgcgaccgccgatctg180

ttcggcgtcgaccgcgactgttcgggcgacgtcgcgctcgcggtggaggcgatccacgtc240

tattcgctgatccacgacgatctgccggcgatggacgacgacgacctgcgccgcggcaag300

ccgaccgtccacaaggcatttgacgaggcgaccgcgatcctcgccggcgactgcctgcac360

gcgctggcgttcgagatcctcgccgatcccaggacgcacgccgatcccttcgtccgcgcc420

gagctggtgatggaactggcgcgcgcctccgggccgggcggcatggccggcgggcagatg480

atggacctcgtcgccgaacgctcgcgcttcgatctcgccaccgtcacccggctgcagcag540

atgaagaccggcgcgctgatctccgtttcggtggagctgggtgcgatcctcggccgcgtg600

ccgccggaggggcggcgcagcctgcacggctatgcgcacgacctcggcctcgccttccag660

atcgccgacgacctgctcgatgccgagggcgacgaggcggtggtcggcaaggcgctgcgc720

aaggacggcgaggcgggcaaggagacgttcctctcgctgctcggcgtcgaccgggcgcgc780

gagcaatgccgcatgctcgtcgaccaggcggtacggcacctccacgggtacggcgccgaa840

gccgacgtgctgcgcgaggtcgcgcgctacgtcgtcgaacgcgatcgctga891

<210>3

<211>172

<212>prt

<213>sphingomonasatcc55669

<400>3

metprotrpleuhisglyileproleupheleuvalthrvalilegly

151015

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202530

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354045

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505560

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65707580

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progluaspleulysalagluleulysargargglyargglnglyval

0

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165170

<210>4

<211>519

<212>dna

<213>sphingomonasatcc55669

<400>4

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catcgcaaacggacaggcgcatgggagctcaacgacctctatgccgcgatcttcgcggtg180

ccgtcgttcgttctgctgctcggcgggctgcaatggggctggtggccgggattcgtctgg240

atcggcgcggggatcgccgcctacggcgcgatctacttcggttttcacgacatcatcgtt300

caccagcggatcccaacgcgctatctcccgagatcggcgtacatgcgtcgcatcgtccag360

gcgcatcggctgcatcacgtcgtcgagacgcgcgagggcaacgtcagcttcggcttcctc420

gtcgcgccgcgacccgaagacctcaaggccgaactcaaacgacgcggccggcagggggtg480

cgcgcaccggccgcggagcagacgttggcagaaaagtaa519

<210>5

<211>155

<212>prt

<213>sphingomonasatcc55669

<400>5

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151015

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<210>6

<211>468

<212>dna

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<400>6

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<211>735

<212>dna

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