一種煙草甾醇合成相關轉錄因子bHLH93基因及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物基因工程技術領域，具體涉及一個煙草留醇合成相關轉錄因子 bHLH93基因及應用。
【背景技術】
[0002] 植物留醇是生物膜系統的重要組成成分，其除了調控植物的生長發育，還能響應 多種生物和非生物脅迫。煙草中常見的留醇類物質主要有膽留醇、菜油留醇、豆留醇和 谷留醇等。植物留醇經由異戊二烯代謝途徑合成，目前煙草中對于留醇調控的研究主要 集中在異戊二烯代謝途徑中編碼關鍵酶的基因上，對于調控留醇合成相關的轉錄因子研究 的較少。所以探尋煙草中留醇合成相關轉錄因子，對于進一步研究留醇合成的轉錄調控有 著重要的意義。
[0003] 目前研究植物功能基因主要方法有通過根癌農桿菌穩定的遺傳轉化和通過RNA 病毒介導瞬時基因沉默系統（VIGS)。由于穩定表達系統周期較長，并且獲得的轉基因植株 往往含有一個或多個的外源基因拷貝，所以通過農桿菌介導的穩定遺傳的方法獲得的轉基 因植株外源基因的表達往往不穩定。利用病毒介導VIGS技術是近年來發現的轉錄后基因 沉默技術，其可以快速高效的對目的基因進行沉默。目前由煙草脆裂病毒（Tobacco rattle virus，TRV)介導的VIGS在馬鈴薯、棉花及煙草等草本植物中都有廣泛的應用。煙草作為 重要的模式植物，留醇合成的研究對于其他植物也具有重要的借鑒意義。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種煙草留醇合成相關轉錄因子bHLH93基因及其在調控葉 片中甾醇含量的應用。
[0005] 為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：
[0006] -種煙草留醇合成相關轉錄因子bHLH93基因，所述bHLH93基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO :1 所示。
[0007] 所述bHLH93基因是通過同源克隆的方法得到的。
[0008] -種煙草留醇合成相關轉錄因子bHLH93基因在調控煙草留醇含量中的應用，基 于bHLH93基因序列，根據干擾載體引物設計原則設計引物，構建煙草bHLH93基因干擾載 體，并通過VIGS (virus induced gene silencing)實驗鑒定該轉錄因子的功能，發現其可 以調控葉片中甾醇的含量。
[0009] 所述煙草NtbHLH93基因干擾載體是由酶切后的bHLH93基因 PCR片段和TRV2病 毒空載體連接，轉化感受態，并測序驗證而得。
[0010] 所述PCR所用引物為：
[0011] NtbHLH93-VIGS 上游引物如 SEQ ID NO :2 所示；
[0012] NtbHLH93-VIGS 下游引物如 SEQ ID NO :3 所示。
[0013] 所述酶為兩種限制性內切酶Nco I和Sac I。
[0014] 所述VIGS實驗是通過農桿菌介導的病毒侵染實現。
[0015] 本發明的有益效果是：本發明所述的基因 NtbHLH93被沉默后，煙草葉片中留醇特 別是豆留醇的含量明顯降低，其含量的降低，可作為煙草留醇調控領域的應用。
【附圖說明】
[0016] 圖1為基因 NtbHLH93沉默表型圖，其中Con為注射侵染緩沖液的對照，TRV為注 射攜帶TRV2空載體菌液的對照；NtbHLH93為攜帶NtbHLH93基因 TRV2載體菌液的試驗組。
[0017] 圖2為基因 NtbHLH93在VIGS體系中基因表達量，其中Con為注射侵染緩沖液的 對照；TRV為注射攜帶空載體菌液的對照；NtbHLH93為注射攜帶目的基因菌液的試驗組。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明，這些實施例僅用于說明本發明而不用 于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件。
[0019] -、煙草總RNA提取和反轉錄合成cDNA
[0020] 1.提取移栽后4周的紅花大金元葉樣品的總RNA用于基因克隆，提取RNA所用的 研缽、藥勺等均用95%酒精灼燒后使用。提取RNA所用的離心管和槍頭等均是無 RNase產 品（AXYGEN)〇
[0021] 總RNA的提取按照Gene Answer RNA提取試劑盒說明書的提取步驟進行。
[0022] (1)取準備好的煙草幼葉樣品（IOOmg)，在預冷的研缽中用液氮研磨徹底，轉移到 I. 5ml離心管中；
[0023] (2)待液氮剛揮發完后，加入500 μ I RLT和50 μ I PLANTaid，劇烈渦旋混勾，并在 56°C 溫育 3min ;
[0024] (3)將裂解液13000rpm離心5-10min，取上清380 μ L，加入190 μ L無水乙醇，吹打 混合均勻；將混合液全部轉移到吸附柱RA上，13000rpm離心2min ;
[0025] (4)加入350 μ L RWl洗脫液，室溫放置lmin，13000rpm離心lmin，棄濾液；
[0026] (5)加 DNase I 工作液 80 μ L 于膜中央，22°C，酶解 15min ;
[0027] (6)加入350 μ L RWl洗脫液，13000rpm離心lmin，棄去收集管；
[0028] (7)將離心柱轉移到新的21111收集管上，加入50(^1^1^液，13000印111離心308，棄 濾液；
[0029] (8)加入500 μ L RW液到離心柱上，最大轉速離心2min，13000rpm離心lmin，棄濾 液，空管13000rpm離心2min ;
[0030] (9)小心移去離心管，把離心柱連接到新的I. 5ml收集管上，加入30 μ L無 RNase 水（70°C )，室溫靜置2min，1000 Orpm離心lmin，洗脫RNA ;-80°C保存提取的RNA。
[0031] 2.煙草總RNA反轉錄合成cDNA
[0032] 使用寶生物 Prime ScripiiC 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒反轉錄合成 cDNA第二鏈，反應體系如表1所示：
[0033] 表1反轉錄體系
[0034]
[0035] 模板RNA與01 igo dT充分混合70 °C變性5分鐘，后迅速置于冰上冷卻5分鐘，并 加入一定體積的5XRT buffer、dNTP、雙蒸H2O和AMV，反應條件：42°C保溫lh，放入75°C溫 育15分鐘滅活AMV逆轉錄酶，迅速取出置于冰上驟冷，終止cDNA第一鏈的合成，用于下一 步的PCR反應，剩余的cDNA保存于-20°C備用。
[0036] 二、bHLH93基因的同源克隆
[0037] 通過 Blast 分析（//www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)得到兩條與擬南芥及番 茄bHLH93相似的煙草EST序列（GenBank登錄號：FS420134和AM805227)，并對兩條EST序 列進行拼接。根據基因的序列設計3對長度為20bp左右的特異引物（?1、？213)，分別為：
[0038] Pl 上游引物：5' -GATAGAGCCATTGTGGAGGA-3'，
[0039] Pl 下游引物：5,-CTACATCAAACTTTGGAGGG-3' ；
[0040] P2 上游引物：5, -TCTATTCACTTTTTGACGTT-3'，
[0041] P2 下游引物：5' -GATCTTCACGCAACCTGTG-3' ；
[0042] P3 上游引物：5, -ATGGAGCTCACTCAACAGG-3'，
[0043] P3 下游引物：5' -GCTCATGCGGCCGCTACAG-3'。
[0044] PCR反應體系25 μ L，包括一定體積的雙蒸H20 9. 7 μ UPremixTaq 12. 5 μ L、上游 引物0. 4 μ L、下游引物0. 4 μ L和cDNA 2 μ L。反應程序：94°C預變性5min ;94°C變性30s， 58°(：退火3〇8,72°(：延伸60~9〇8,30個循環；72°(：延伸1〇1^11，4°(：保溫。
[0045] 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，DNA回收試劑盒（TaKaRa公司）回收目的基因。將 回收產物連接到克隆載體PMD19-T (TaKaRa公司）上；轉化大腸桿菌（DH5a)感受態細胞 中，37°C培養，菌落PCR鑒定得到陽性克隆。利用小量質粒快速提取試劑盒（