本發明屬于植物學
技術領域：
，具體涉及一種提高植物耐鹽能力的GmSLT蛋白及核酸和應用。
背景技術：
：鹽漬是造成農作物減產、耕作面積減少的主要原因之一。因此，提高作物的耐鹽能力，將對我國農業經濟可持續性發展做出積極貢獻。而解決這個問題重要方法就是通過生物技術培育出優良的耐鹽新品種，其中不可或缺的是利用植物的耐鹽基因資源。植物在應對逆境脅迫時,從時間、空間上構成了嚴密的結構，基因表達的轉錄水平、轉錄后水平以及蛋白質水平等調控手段構成了協調復雜的網絡。這些基因并非孤立地在鹽脅迫應答中起作用,而是通過信號網絡的整合作用,協調一致地發揮作用,使植物在鹽漬脅迫下,保持細胞和整個植物體內的離子平衡；保持細胞與環境及細胞間的水分和滲透平衡；維護蛋白質、核酸生物大分子的結構和生物學功能；保持生理代謝、能量代謝平衡。研究表明，植物的耐鹽性是一個受多基因控制的數量性狀，十分復雜。植物通過植株整體生理、代謝的調節、基因表達等的調控抵御不利的鹽漬環境。有報道稱，當一些鈉/氫陽離子轉運體、轉錄因子、滲透物質合成物等的基因被轉入植物，并過量表達后，這些轉基因植物的耐鹽能力都有了不同程度的提高。說明相關基因在植物耐鹽性方面起著關鍵的作用。為此，有必要研究與植物耐鹽密切相關的基因轉入植物，以期望提高植物的耐鹽能力。技術實現要素：本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種提高植物耐鹽能力的GmSLT蛋白及核酸和應用。本發明的基因能夠用于改良植物，提高其耐鹽能力。第一方面，本發明涉及一種提高植物耐鹽能力的GmSLT蛋白，所述蛋白包含如下氨基酸序列中的一種或多種：如SEQIDNO.3所示的結構域ABS序列，如SEQIDNO.4所示的TM序列，以及如SEQIDNO.5所示的ZBS序列。優選地，所述蛋白包含如SEQIDNO:2所示氨基酸序列。優選地，所述蛋白的序列如SEQIDNO:2所示。第二方面，本發明涉及一種編碼前述GmSLT蛋白的核酸序列。優選地，所述核酸序列如SEQIDNO:1所示。第三方面，本發明還涉及一種前述核酸序列在增強植物耐鹽能力中的應用。第四方面，本發明涉及一種含有前述核酸序列的重組表達載體。第五方面，本發明涉及一種含有前述核酸序列的轉基因細胞系。第五方面，本發明涉及一種含有前述核酸序列的重組菌株。第七方面，本發明還涉及一種提高植物耐鹽能力的方法，包括如下步驟：將權前述的核酸序列導入植物中，培育，獲得耐鹽能力的轉基因植物。優選地，所述植物為單子葉植物、雙子葉植物、或裸子植物。優選地，所述植物為農作物、花卉植物、或林業植物。優選地，所述植物為大豆、水稻、擬南芥、小麥、玉米、棉花、油菜、高粱、或馬鈴薯。第八方面，本發明還涉及一種培育耐鹽植物的方法，其特征在于，包括如下步驟：將前述方法獲得的轉基因植物與目標植物雜交，進而獲得耐鹽植物以及雜交后代。第九方面，本發明還涉及一種提高植物耐鹽能力結構域序列，，所述結構域序列為如SEQIDNO.3所示的結構域ABS序列，如SEQIDNO.4所示的TM序列，或者如SEQIDNO.5所示的ZBS序列。本發明具有如下的有益效果：本發明通過生物信息學及基因時空表達分析，獲得了一種耐鹽基因，命名為GmSLT；將該基因轉化酵母，可以明顯提高酵母的耐鹽能力；轉化擬南芥和水稻，也能夠增強相應植物的耐鹽性；本發明的基因能夠用于改良植物，提高其耐鹽能力。附圖說明通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、目的和優點將會變得更明顯：圖1：GmSLT功能結構域示意圖；圖2：GmSLT表達對酵母W303-1a耐鹽性點滴試驗；圖3：在鹽脅迫條件下過表達GmSLT具有酵母基因與野生型酵母對比；圖4：GmSLT基因關鍵結構域在耐鹽中的作用；圖5：轉GmSLT水稻To代幼苗GmSLT基因檢測；其中WT為親本，NTC1、NTC2為空白對照，P1，P2為陽性對照；圖6：部分轉GmSLT基因水稻植株GmSLT基因的表達檢測；圖7：轉GmSLT基因水稻的1#株系T1代幼苗耐鹽試驗結果圖。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆：實驗室手冊(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。本發明實施例中，所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。本發明實施例中所用的材料、試劑、耗材等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。本發明對于適用于本發明的植物沒有特別的限制，只要其適合進行基因的轉化操作，如各種農作物、花卉植物、或林業植物等。所述的植物比如可以是(不限于):雙子葉植物、單子葉植物、或裸子植物。更具體地，所述的植物包括(但不限于)：水稻、擬南芥、小麥、玉米、大豆、棉花、馬鈴薯、油菜等。實施例1、大豆候選基因的克隆通過生物信息學分析，預測得到一些大豆耐鹽候選基因。大豆合豐39幼苗(參考文獻--司振峰，夏大亮，王寶峰，柏合蔭，師轉哲，2001。大豆品種-合豐39號。《中國農技推廣》,2001(4):33-33)經150mM氯化鈉溶液處理后，利用實時熒光定量PCR對這些候選基因進行時空表達模式分析，發現鹽脅迫后有多個候選基因變化明顯。其中，GmSLT是上述方法預測獲得一個大豆耐鹽基因，并進行了大豆幼苗根葉基因時空表達模式分析，在150mM鹽脅迫后表達上調明顯，推測為大豆耐鹽相關的基因，并對該基因進行了克隆；根據預測基因GmSLT的序列，利用軟件PrimerPremier5設計一對引物，利用高保真酶KOD擴增。擴增模板是獲得大豆的cDNA(利用鹽脅迫后的大豆幼苗根葉提取RNA再反轉錄為cDNA)。1、引物設計如下:GmSLT-F5’-TCTAGAATGGGCGATACTT-3(SEQIDNO.6)；GmSLT-R5’-GAGCTCTCAAGTCAACATAAGAT-3(SEQIDNO.7)；反應體系：反應條件：2、PCR產物純化回收，使用PCR產物純化試劑盒(上海捷瑞)。3、純化產物加A反應50μl反應體系：72℃連接30min；4、大腸桿菌感受態細胞的制備1)接種大腸桿菌DH5α，挑取單菌落于LB培養基中37℃搖床培養過夜(約16小時)；2)取1ml過夜培養物轉接于100mlLB培養基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養約2-3小時(250-300rpm),至OD600為0.4-0.6；3)將0.1MCaCl2溶液置于冰上預冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作；4)吸取1ml培養好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；5)4℃下3000g冷凍離心5分鐘；6)棄去上清，加入100μl預冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；7)4℃下3000g冷凍離心5分鐘；8)棄去上清，加入100μl預冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；9)細胞懸浮液可立即用于轉化實驗或添加冷凍保護劑(15％-40％甘油)后超低溫冷凍貯存備用(－70℃)。5、連接反應使用TaKaRapMD18-Tsimplevector，參照說明書操作。目的片段和載體控制摩爾比約為6：1，加樣混勻。加等體積的solutionI5μl，輕混勻，稍離心，16℃連接數小時。6、轉化取連接反應液5μl熱擊法轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。1)將感受態細胞從-70℃取出，冰中融化，然后加入5μl連接反應液，輕混勻，放于冰中30min；2)42℃水浴中熱擊45秒，迅速放入冰中2min；3)加入890μlLB液體培養基，180rpm，搖床中培養1小時；4)取下層100μl菌液，涂布于LB(Amp/X-gal/IPTG)平板上，37℃倒置培養過夜。7、菌落PCR鑒定用牙簽挑取一點白色單菌落，放入100μl無菌水中攪勻，然后用1μl菌液作為模板進行菌落PCR。25μl反應體系如下，反應條件同本例(1)：8、大腸桿菌質粒提取1)挑取單菌落接種于3-5ml含抗生素的LB液體培養基中，37℃搖培過夜。2)取1-3ml菌液于干凈離心管中，12000r/min離心5min，棄盡上清，收集菌體。3)向沉淀加入200μl預冷的SolutionI溶液，振蕩混勻，懸浮菌體。4)加入200μlSolutionII，迅速且柔和顛倒離心管數下混勻(不超過5min)。5)加入200μl預冷的SolutionIII溶液，顛倒離心管數下輕混勻，冰上放置5min。6)12000r/min，離心10min。7)小心吸取上清液轉入另一個干凈的離心管中，加入400μl(或等體積)Tris飽和酚：氯仿(1∶1)溶液，反復輕振蕩，混勻，12000r/min離心5min。8)吸取上清液至另一個離心管中(避免吸附蛋白)，加入400μl氯仿，反復振蕩混勻，12000r/min離心5min。9)小心吸取上清液至另一個離心管中，加入預冷的2倍體積無水乙醇和1/10體積的3M醋酸鈉溶液，混勻后，-20℃放置10min。10)然后，12000r/min離心5-10min，棄盡上清。加入70％乙醇0.5ml洗滌2次，真空干燥或風干，沉淀用50μlTE+RNase(20μg/ml)溶解，然后-20℃保存。9、質粒酶切鑒定用NEB限制性內切酶BamHI、SalI,20μl體系37℃酶切數小時。10、測序與分析將菌落PCR和酶切鑒定為陽性的菌落，用單菌落LB+Amp小養過夜，取少量菌液送公司測序，使用通用引物測序，得到序列如SEQIDNO:1所示；將測序結果與申請人前期預測的GmSLT序列進行比較，并利用DNAMAN、NCBI、softberry和Phytozome等生物信息學工具進行分析。實施例2、酵母耐鹽試驗設計引物擴增耐鹽基因ORF的全長，使其帶有雙酶切位點可以和酵母載體pRUL129相連，構建重組質粒。KOD擴增后，連接到pMD-18T，轉化DH5α，抽質粒雙酶切過夜，膠回收純化后，連接到經同樣酶酶切的pRUL129載體。利用化學轉化法或者電轉化法將構建的轉基因載體轉化釀酒酵母W303-1A，28℃培養3天，可以見到白色的酵母菌落。挑取單菌落，小養后進行測序驗證正確。1、電轉化法釀酒酵母W303-1A感受態制備和轉化本步驟的實施可參考文獻--秦玉靜金建玲鮑曉明高東,1999。影響釀酒酵母電擊轉化率的條件。山東大學學報(自然科學版)Vol.34No.2。1)將轉化用酵母菌株的單菌落接種于5mlYPD培養基中，30℃過夜培養至飽和；2)轉化前一天晚上，在裝有500mlYPD培養基的2L無菌燒瓶中接種適量的過夜培養液，于30℃劇烈振搖，直到細胞密度達1×108(OD600約為1.3-1.5，1：10稀釋約為0.3-0.35)；3)于4℃，4000g離心5min收獲培養細胞，細胞用80ml無菌水重懸。為了增加細胞對電擊的感受性，繼續步驟4。如果不需要可接步驟6；4)加入10ml，pH7.5，10×TE緩沖液，搖晃均勻，再加入10ml1M乙酸鋰，旋轉搖勻，于30℃，85rpm搖動45min；5)加入2.5ml1mol/LDTT,并同時旋轉搖動，于30℃85rpm搖動15min；6)將酵母菌懸液洗滌3次，每次以4000-6000g于4℃離心沉淀細胞，依次重懸細胞所用的溶液如下：第一次沉淀：250ml冰冷的水第二次沉淀：20-30ml冰冷的1mol/L山梨醇第三次沉淀：0.5ml冰冷的1mol/L山梨醇最終菌液體積應為1.3-1.5ml，此時菌密度為1×1010。7)電轉化前，在無菌冰冷的微量離心管中加入40μl酵母菌細胞和小于等于100ng待轉化的DNA(體積小于5μl)，混勻。轉移至冰冷的電轉槽中，接下來按照Bio-Rad電穿孔儀的說明操作。8)脈沖后往電擊槽中加入1ml預冷的1mol/L山梨醇，輕輕吹吸混勻；9)梯度涂布在山梨醇選擇培養基平板上，于30℃培養3-6天，直到平板上出現菌落。2、釀酒酵母W303-1A總DNA和質粒的提取1)取培養30h的酵母菌液1-2ml，12000rpm,1min離心；2)用STE洗滌2次；3)用100μlTE緩沖液重懸，加入50μl玻璃珠(sigama公司)，加入100μl酚氯仿，劇烈震蕩1h,；4)4℃，12000rpm離心10min；5)取上清，加等體積氯仿，抽提蛋白和酚；6)重復步驟5直至液面分界處沒有蛋白殘留；7)取上清，加入兩倍體積冰無水乙醇，-20℃靜置20min,12000rpm離心10min；8)棄上清，70％乙醇洗滌一次，自然干燥；9)溶于50-100μlTE中，加入RNaseA(終濃度為20μg/ml),37℃反應30min后保存于-20℃；10)PCR檢測，因為裂解效率低，質粒含量不高，建議模板量為1～2μl/25μl反應體系。3、過表達GmSLT基因對酵母鹽脅迫下生長能力影響實驗采用點滴試驗(Yeastdroptestassay)與生長曲線法檢測GmSLT基因對酵母鹽脅迫下生長能力的影響(可參考文獻--陳宏運，葉燕銳，朱怡，鄭穗平，林影，2008。酵母耐性評價方法的比較。食品與發酵工業,2008,34(12):51-57)。點滴法為將相同濃度的野生型與轉化GmSLT的酵母點種于添加0,300mM，500mMNaCl的酵母基本培養基上，28度培養2-3天，觀察酵母生長情況，拍照記錄。生長曲線法為：將酵母接種至基本培養基，28℃過夜培養，調整OD600到0.5，以1ml培養基懸浮接入100ml新的豐富培養基液體YPD(含300mMNaCl)，使初始OD600為0.005，28℃,150rpm，培養3d，間隔6小時檢測一次OD值。由附圖2中可以看到，當培養基中NaCl濃度達到在300mM時，W303-1A以及轉化pRUL129空質粒的W303-1A生長均減慢，但過表達GmSLT的W303-1A酵母在培養基中NaCl濃度達到在500mM時，仍能生長。從附圖3中可以看到，當培養基中NaCl濃度達到在300mM時，從30小時開始，過表達GmSLT的W303-1A酵母生長速度顯著高于W303-1A以及轉化pRUL129空質粒的W303-1A。到第72h時，帶有GmSLT轉基因的酵母OD600已達到8.85，而帶有空質粒的對照僅達到4.05，野生型W303-1A為3.02。上述實驗證明，過表達GmSLT基因，可顯著提高酵母對鹽脅迫適應能力。證明GmSLT基因功能與耐鹽密切相關。4、GmSLT各結構域與耐鹽功能相關性1)Over-LappingPCR：為驗證GmSLT各結構域功能，采用Over-LappingPCR的方法，分別進行了ABS、TM、TM303、TH178以及ZBS結構域的缺失，詳見圖1。根據此方法分別設計引物P2，P3以及共用引物P1，P4，分別進行2輪各20-cycle的PCR。所設計的引物序列是：GmSLTΔABS-P25‘-CTCATGCAA-CCAAGCACCCCAAATG-3‘(SEQIDNO.8)GmSLTΔABS-P35‘-GGGGTGCTTGG-TTGCATGAGAAATCTAAG-3‘(SEQIDNO.9)GmSLTΔTM-P25‘-GATTTCTCATG-TTGGTGCACTTCCTTCCAG-3‘(SEQIDNO.10)GmSLTΔTM-P35‘-GTGCACCAA-CATGAGAAATCTAAGACC-3‘(SEQIDNO.11)GmSLTM303-F5‘-GGATCCATTGATCTATCTCCTGT-3‘(SEQIDNO.12)GmSLTM303-R5‘-GTCGAC-TCAAGTCAACATAAGATCA-3‘(SEQIDNO.13)GmSLTH178F-F5‘-ACATGAACGGGCTCTCTCGCCAAGG-3‘(SEQIDNO.14)GmSLTH178F-R5‘-CCTTGGCGAGAGAGCCCGTTCATGT-3‘(SEQIDNO.15)GmSLTΔZBS-P25‘-TCTCGGCACT-CCCGTTCATGTAACTCCTC-3‘(SEQIDNO.16)GmSLTΔZBS-P35‘-CATGAACGGG-AGTGCCGAGAAGGGTTTTG-3‘(SEQIDNO.17)P15‘-GGATCC-ATGGGCGATACTTCTC-3‘(SEQIDNO.18)P45‘-GTCGAC-TCAAGTCAACATAAGATCA-3‘(SEQIDNO.19)2)構建酵母轉化載體重組pRUL129經測序驗證的帶有BamHⅠ和SalⅠ酶切位點的突變基因與帶有同樣酶切位點的酵母載體pRUL129相連，用電轉化法轉化釀酒酵母，在含1M山梨醇的選擇平板上28℃培養3天。挑取單菌落做PCR驗證，證明四種突變基因均已轉入了酵母。3)GmSLT結構域與耐鹽功能試驗用點滴實驗(Yeastdroptestassay)的方法對多種轉化酵母進行耐鹽試驗。結果見圖4。從圖4中可以觀察到，當培養基中的NaCl濃度達到300mM、500mM時，過表達完整GmSLT基因或缺失ZBS的酵母生長明顯比其他酵母。該實驗結果表明，在各結構域中，ABS，TM等結構域一旦缺失，GmSLT基因功能幾乎完全喪失，及這兩個結構域對于GmSLT的耐鹽功能是必不可少的。相對而言，ZBS結構缺失后，對GmSLT基因功能功能影響較小。實施例3、轉GmSLT水稻耐鹽試驗1、植物轉化載體構建以經改造的雙元載體pCAMBIA1301(參考文獻陳宏運，葉燕銳，朱怡，鄭穗平，林影，2008。酵母耐性評價方法的比較。食品與發酵工業,2008,34(12):51-57)作為植物表達載體(多克隆位點前增加有35S啟動子)，參見實施例2，將基因GmSLT利用BamHⅠ和SalⅠ兩個酶切位點從載體pMD-18TSimpleVector上雙酶切下來，回收純化，然后克隆到pCAMBIA1301的多克隆位點BamHⅠ和SalⅠ之間，稱為35S：：GmSLT。2、農桿菌準備1)將35S：：GmSLT轉化農桿菌LBR4404(參考文獻--何迎春，高必達,2002。含煙草幾丁質酶基因的質粒pBG1121的構建及水稻轉化《湖南農業大學學報:自然科學版》,2002,28(2):93-96)，然后進行菌落PCR鑒定驗證正確，并將陽性菌落加保護劑凍存于-70℃。2)轉化前從-70℃冰箱中取出保種的農桿菌，接種于含相應抗生素的YEP固體培養基上，28℃培養箱培養2-3d。3)挑取農桿菌單菌落接入3mL無菌YEP液體培養基中(含25mg/L利福平+25mg/L鏈霉素+50mg/L卡那霉素)，28℃、200rpm培養約20h。4)再將所得到的菌液接入200mL含同樣抗生素YEP液體培養基中，28℃、200rpm再培養約20h，待農桿菌的濃度達到OD600＝0.5左右。5)4℃、3000rpm離心15min，棄上清，用轉化液重新懸浮，待用。3、轉GmSLT基因水稻的獲得(參考文獻：張雪梅，袁濤，徐秀珍，王智杰，李春陽等，2000。植物表達質粒pBin438-IFN-γ的構建及向農桿菌LBA4404的高效轉化。《四川大學學報(自然科學版)》,2000(s1)；易自力，曹守云，王力，儲成才，李祥等，2001。提高農桿菌轉化水稻頻率的研究，遺傳學報,2001,28(4):352-358)。有多種方法獲得轉基因水稻，本例以粳稻日本晴作為材料，通過成熟胚誘導愈傷組織，然后用含有GmSLT基因的農桿菌EHA105侵染愈傷組織，最后分化得到轉基因植株。具體步驟如下：1)誘導愈傷及繼代誘導培養基—MS混合粉末4.4g/L；2,4-D：4mg/L；蔗糖：30g/L；脯氨酸：2.8g/L；水解酪蛋白：0.3g/L；植物凝膠：3g/L(PH5.8)繼代培養基—MS混合粉末4.4g/L；2,4-D：2mg/L；Fe-EDTA：5ml/L；蔗糖：30g/L；水解酪蛋白：0.3g/L；植物凝膠：3g/L(PH5.8)將水稻成熟種子，去殼后用次氯酸鈉溶液消毒，再用滅菌去離子水洗滌多次，之后放到無菌濾紙上吸干，將種子平放于誘導培養基上，28℃黑暗下培養一個月左右；當胚性愈傷組織生長出來后，選擇球型愈傷組織，置于繼代培養基上，28℃黑暗下繼代培養1周左右。2)農桿菌轉化和共培養，共培養基—N6大量：50ml/L；B5微量：10ml/L；B5有機：1ml/L；肌醇：0.1g/L；2,4-D：2mg/L；Fe-EDTA：5ml/L；蔗糖：30g/L；葡萄糖：10g/L；植物凝膠：3g/L；滅菌后加AS:150μM(PH5.2)；參見實施例3將載體35S：：GmSLT轉化農桿菌EHA105，并檢驗得到陽性菌落。再將陽性農桿菌用含抗生素的YEP平板活化培養28℃，2d，然后在平板上刮下菌，重新懸浮于含有適量AAM培養液中，在28℃，搖床上劇烈振蕩培養2個小時，調整菌液OD600值約0.15。緊接著，將繼代后的愈傷組織浸泡在農桿菌菌液中，約25min。之后，用無菌濾紙吸干菌液，將愈傷組織轉接到含有一張無菌濾紙的共培養基上，暗20℃共培養3d。3)選擇及分化培養選擇培養基—N6大量：50ml/L；B5微量：10ml/L；B5有機：1ml/L；2,4-D：2mg/L；Fe-EDTA：5ml/L；蔗糖：30g/L；脯氨酸：0.5g/L；水解酪蛋白：0.3g/L；肌醇：0.1g/L；Phytagel：3g/L，滅菌后加頭孢霉素：500mg/L；加潮霉素50mg/L(PH5.8)預分化培養基—N6大量：50ml/L；B5微量：10ml/L；B5有機：1ml/L；NAA：1mg/L；Fe-EDTA：5ml/L；蔗糖：30g/L；脯氨酸：0.5g/L；水解酪蛋白：0.3g/L；肌醇：0.1g/L；植物凝膠：3g/L，滅菌后加頭孢霉素：250mg/L；ABA：5mg/L；6-BA：2.5mg/L；加潮霉素50mg/L；(PH5.8)分化培養基—N6大量：50ml/L；B5微量：10ml/L；B5有機：1ml/L；NAA：0.5mg/L；Fe-EDTA：5ml/L；6-BA：4mg/L；蔗糖：30g/L；水解酪蛋白：0.3g/L；肌醇：0.1g/L；植物凝膠：4.6g/L。(PH＝5.8)共培養后，將愈傷移到三角瓶中，加入無菌水洗滌愈傷組織3次，然后用添加了0.5g/L頭孢霉素的無菌水洗滌多次至澄清，倒掉后再加(含0.5g/L頭孢霉素)無菌水，放在搖床上搖2個小時，28℃，150轉，(若發現液體渾濁，應再用0.5g/L頭孢霉素無菌水洗滌至澄清，)之后將愈傷移至無菌濾紙上，吸干多余水分，超凈臺吹1小時左右，再將愈傷組織轉移到選擇培養基上(可挑選較大的愈傷組織分散在培養基上)，暗28℃培養兩周。再挑取從原愈傷組織上生長出來的抗性愈傷組織，轉移到預分化培養基上，暗28℃預分化培養1周。然后，將愈傷組織轉移到分化培養基上，28℃分化培養：先在黑暗下培養3d，然后在持續光照下，光周期16h晝/8h夜，培養兩周以上，這樣愈傷組織會分化出幼苗。將分化出的幼苗轉移到含MS培養基的三角瓶培養長大為植株(根系發達)，最后移栽到營養土培養。4)水稻陽性植株的鑒定a、轉GmSLT水稻To代幼苗普通PCR檢測利用SDS簡易提取法，剪去少量水稻葉片，液氮磨碎，提取DNA。然后以此為模板，用GmSLT檢測引物擴增，進行PCR擴增，并用原始親本水稻(WT)作對照，結果請參見附圖5。引物如下：GmSTL-d-F：5’-CTTCACATGAGGAACTGG-3’(SEQIDNO.20)GmSTL-d-R：5’-CTCAGTCTCATAGCCTTG-3’(SEQIDNO.21)從電泳圖(圖5)中可以看到，無論以轉化GmSTL的水稻苗基因組DNA還是cDNA為模板，均可擴增出與以含GmSTL基因的質粒作為正對照進行PCR擴增完全相同的片段，證明轉基因苗中成功導入了GmSTL基因。5)轉GmSLT水稻To代部分株系基因表達量分析(RealtimePCR)a)幼苗總RNA提取使用北京康為世紀公司的植物RNA提取試劑盒，操作參考說明書。相關用品的處理：用0.1％的DEPC溶液浸泡藍色磨棒過夜，然后121℃滅菌30分鐘，倒去DEPC溶液，80℃烘干備用。并用DEPC水加無水乙醇配制75％乙醇。b)反轉錄為cDNA。葉片中提取總RNA，RNA洗脫體積50μl，檢驗RNA純度和完整度后，進行反轉錄。再利用反轉錄試劑盒，參照說明書合成cDNA。接著，利用制備的cDNA作為模板進行RT-PCR檢測，同上普通檢測所用的引物進行陽性植株檢測，并用原始親本水稻(WT)作對照。選用檢測為陽性的水稻植株制備cDNA模板，再根據有關原則，分別設計了ricetub和GmSLT的實時熒光定量PCR引物，如下：Ricetub-F：5’-GGCAAGATGAGCACCAAGGA-3’(SEQIDNO.22)Ricetub-R：5’-AAGCCACCGCAATACACCAC-3’(SEQIDNO.23)GmSLT-F5’-AGAATCACCACCCATCCA-3’(SEQIDNO.24)GmSLT-R5’-GTGCCAAGACCAACATCC-3’；(SEQIDNO.25)實時熒光定量pcr反應體系(SYBRGreen染色法)，20μl體系，具體成分如下：輕輕混勻后短暫離心反應條件：程序最后采用熔解曲線(meltingcurve)反應，分析PCR產物的特異性。實時熒光定量PCR每個樣平行三次重復，以水稻看家基因tub作為內參，用2-ΔΔCT方法計算目標基因相對表達量。從附圖6中可看到，野生型親本苗中未檢測到GmSLT的表達，而轉基因苗1、3、4號中均檢測到了GmSLT的表達，其中1號苗的表達量最高。4、轉基因水稻耐鹽試驗材料：水稻日本晴野生型WT幼苗和轉GmSLT水稻To代1#株系幼苗；處理方法：分別澆灌NaCl濃度1M和1.50M的MS+NaCl溶液，每盆澆30ml一次，9d后統計水稻耐鹽情況。由下表及圖7中可以觀察到，采用1M的Nacl分別處理親本日本晴與轉GmSLT的1#小苗9天后，野生型日本晴已出現明顯的枯萎現象，而轉GmSLT基因的小苗并未出現明顯的鹽害癥狀。當采用1.5M的NaCl處理9天后，野生型日本晴已基本枯死，而轉GmSLT基因的小苗雖有葉片枯萎現象，但小苗仍存活。由此可以得出結論，過表達GmSLT基因可以顯著提高水稻的耐鹽特性。轉GmSLT基因的水稻苗鹽脅迫處理結果鹽濃度植株處理后植株表現1MWT水稻葉片枯萎較重1M轉GmSLT水稻葉片枯萎輕微1.5MWT水稻部分植株枯死，部分植株枯萎嚴重1.5M轉GmSLT水稻植株存活，葉片枯萎綜上所述，本發明通過生物信息學及基因時空表達分析，獲得了一種耐鹽基因，命名為GmSLT；將該基因轉化酵母、水稻等多種生物，均可顯著提高相關生物的耐鹽性能。本發明的基因能夠用于改良工業菌株,如:酵母,以及作物，如：水稻等，可顯著提高其耐鹽能力。具有降低酵母等工業生產菌株培養要求，減少生產成本，提高目標化合物產量以及擴展作物種植區域、提高產量等應用前景與價值。以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是，本發明并不局限于上述特定實施方式，本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改，這并不影響本發明的實質內容。當前第1頁1 2 3