本發明屬于菌種的選育
技術領域：
，特別涉及一種獲得生產pf1022的半知菌無孢霉菌的方法。
背景技術：
：pf1022a是半知菌無孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022產生的n-甲基-codp(環狀縮肽)類化合物。pf1022a是一種對動物低毒、防治譜廣、效果好的驅蟲藥物，其是繼大環內酯類驅蟲藥后，最有潛力的用于牲畜和寵物的一類驅蟲藥。美國專利文獻us09901393a1(公開日2002年4月18日)公開了一種轉化pf1022a生產其衍生物emodepside的化學法。目前emodepside與吡喹酮的組合物profender已上市，用于控制貓或狗胃腸道內的線蟲和絳蟲。隨后emodepside與妥曲珠利的組合物procox也已上市。中國專利文獻cn1046940a(公開日1990年11月14日)公開了半知菌無孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022的性狀：菌絲體呈白色絨毛狀，7天菌絲體即可覆蓋整個培養皿，即形成的菌落的直徑大于8.5mm。此外，該菌株不產生有性孢子或無性孢子，在固體平板上菌落的形態差異小，不利于根據表型進行菌株的選擇。目前，關于pf1022發酵生產pf1022a的報道比較少，pf1022a的產量又比較低。針對此現狀，有必要研究生產高產量的pf1022的半知菌無孢霉菌的方法。技術實現要素：本發明要解決的技術問題就是針對現有的pf1022a產量低、沒有關于獲得高產pf1022的半知菌無孢霉菌roselliniasp.的方法的不足，提供一種獲得生產pf1022的半知菌無孢霉菌的方法，該方法所得的菌株產pf1022a 產量高，重復性好，能夠有效獲得將pf1022a產量提高至少120％的半知菌無孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022。本發明人經過仔細的考慮和廣泛的研究后發現，通過高滲溶液產生一定的高滲透壓的逆境，在該高滲透壓的逆境下能夠生長良好的半知菌無孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022具有高產pf1022a的潛能。即與出發菌株相比，在高滲透壓的逆境下，菌落直徑小、形狀圓的半知菌無孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022單菌落能夠高產pf1022a。這樣的半知菌無孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022與在不含高滲溶液的平板培養基中培養獲得的半知菌無孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022相比，產量至少提高120％。本發明解決上述技術問題所采用的技術方案之一是，一種獲得生產pf1022的半知菌無孢霉菌roselliniasp.的方法，其包括以下步驟：1)將野生的半知菌無孢霉菌roselliniasp.pf1022在含有0.1～1.2mol/l的高滲溶液的平板固體培養基中培養，選擇菌落直徑小于5mm、形狀為圓形的單菌落；2)接種步驟1)所得的單菌落至發酵培養基發酵培養，檢測發酵物中pf1022a的含量，選擇pf1022a含量比出發菌株高的菌株。本發明中，步驟1)為：將野生的半知菌無孢霉菌roselliniasp.pf1022在含有0.1～1.2mol/l的高滲溶液的平板固體培養基中培養，選擇菌落直徑小于mm、形狀為圓形的單菌落。其中，所述高滲溶液的濃度為0.1～1.2mol/l，較佳地為0.3～0.9mol/l，更佳地為0.5～0.7mol/l。所述高滲溶液的溶質為本領域常規的溶質，較佳地為氯化鉀、硫酸鎂、氯化鈉、山梨醇或蔗糖，更佳地為氯化鉀或硫酸鎂。所述菌落直徑小于5mm，較佳地小于4mm，更佳地小于3mm。所述平板固體培養基為本領域常規的平板固體培養基，較佳地為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)培養基。所述pda培養基為本領域常規的培養基，較佳地由土豆15～20％、葡萄糖2～3％和瓊脂1.5～2％組成，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。所述質量體積百分比指每100ml所述pda培養基中，含有組分的克數。如，每100ml所述pda培養基中含有15～20g 土豆。更佳地，所述平板固體培養基由以下的方法制得：將150～200g土豆切成小塊放入鍋中，加水后加熱至沸騰，維持20～30min，用8層紗布過濾，補充水分至1000ml，加入20～30g葡萄糖和15～20g瓊脂即可。所述培養的溫度為本領域常規的溫度，較佳地為25～28℃，更佳地為26℃。所述培養的時間為本領域常規的時間，較佳地為6～8天，更佳地為7天。所述培養的接種量為本領域常規的接種量，較佳地為100μl。較佳地，所述培養還包括以下的步驟：將野生的半知菌無孢霉菌roselliniasp.pf1022稀釋。更佳地為，將保存在甘油中的野生的半知菌無孢霉菌roselliniasp.pf1022在勻漿器中碾碎后稀釋。所述稀釋后的濃度為本領域常規的濃度，較佳地為103～104個/ml。本發明中，步驟2)為：接種步驟1)所得的單菌落至發酵培養基發酵培養，檢測發酵物中pf1022a的含量，選擇pf1022a含量比出發菌株高的菌株。其中，所述接種前還包括如下的步驟：接種步驟1)所得的單菌落于斜面培養基中擴大培養得菌落a。所述斜面培養基為本領域常規的斜面培養基，較佳地為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)培養基。更佳地，所述斜面培養基的組分與步驟(1)所述平板固體培養基的組分相同，但不含高滲溶液。所述擴大培養的溫度為本領域常規的溫度，較佳地為25～28℃。所述擴大培養的時間為本領域常規的時間，較佳地為5～8天。所述擴大培養的接種量為本領域常規的接種量，較佳地為100μl。較佳地，所述擴大培養還包括以下的步驟：挑取步驟1)所得的單菌落，在所述斜面培養基的試管壁上碾碎，再均勻地涂在所述斜面培養基上。較佳地，所述接種的種子液由包括如下的步驟的方法獲得：將步驟1)所得的單菌落接種在種子培養基中培養。更佳地，將所述的菌落a接種在種子培養基中培養。所述培養的接種量為本領域常規的接種量，較佳地為1～2cm2。所述培養的時間為本領域常規的時間，較佳地為3～5天。所述培養的溫度為本領域常規的溫度，較佳地為25～28℃。較佳地，所述培養為震蕩培養。所述震蕩培養的轉速為本領域常規的轉速，較佳地為200rpm。所述 的種子培養基為本領域常規的種子培養基，較佳地包括0.5～1.5％葡萄糖、1～3％可溶性淀粉、0.1～0.5％酵母抽提物、0.5～1％麥芽浸粉、0.1～0.5％豆餅粉和0.1～0.4％碳酸鈣，所述百分比為占所述種子培養基的總體積的質量體積百分比。所述質量體積百分比指每100ml所述種子培養基中，含有組分的克數。如，每100ml所述種子培養基中含有1～3g可溶性淀粉。所述種子培養基的ph為本領域常規的ph，較佳地為5.5～6.5。所述發酵培養的接種量為本領域常規的接種量，較佳地為5～15％，所述百分比為體積百分比。所述發酵培養的時間為本領域常規的時間，較佳地為6～10天。所述發酵培養的溫度為本領域常規的溫度，較佳地為25～28℃。較佳地，所述發酵培養為震蕩培養。所述震蕩培養的轉速為本領域常規的轉速，較佳地為200rpm。所述發酵培養的發酵培養基為本領域常規的所述發酵培養的，較佳地包括2～4％葡萄糖、3～7％可溶性淀粉、0.3～0.5％酵母抽提物、0.5～1％麥芽浸粉、0.5～2.5％豆餅粉和0.1～0.3％碳酸鈣，所述百分比為質量體積百分比。所述質量體積百分比指每100ml所述發酵培養基中，含有組分的克數。如，每100ml所述發酵培養基中含有3～7g可溶性淀粉。所述發酵培養基的ph為本領域常規的ph，較佳地為5.5～6.5。本發明所述檢測的方法為本領域常規的方法，能夠定量發酵物中pf1022a的含量即可。較佳地，所述檢測包括以下的步驟：向所述發酵物中加入甲醇，超聲后過濾取上清液，hplc法測定所述上清液中pf1022a的含量。所述甲醇的體積為本領域常規的體積，較佳地為所述發酵物的體積。所述超聲的溫度為本領域常規的溫度，較佳地為20℃。所述超聲的頻率為本領域常規的頻率，較佳地為90hz。所述超聲的時間為本領域常規的時間，較佳地為20分鐘。將本發明所述的方法應用于雀稗麥角菌(clavicepspaspali)時，雀稗麥角菌在含有所述高滲溶液的培養基中不能良好生長，其產生麥角堿的發酵單位略低于不使用本發明所述的方法發酵產生pf1022a的發酵單位。由此可見，本發明所述的方法特別適于roselliniasp.pf1022。此外，本發明所述的 方法不僅適于野生的roselliniasp.pf1022，也適于經過誘變選育(包括uv誘變、ntg誘變、des誘變和ems誘變等)獲得的roselliniasp.pf1022。roselliniasp.pf1022對滲透壓的耐受能力較高，高滲溶液的濃度最大至1.2mol/l時，roselliniasp.pf1022仍能夠生存，可見roselliniasp.pf1022在本發明所述的方法的條件下不存在完全不能存活的可能性。在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。本發明所用試劑和原料均市售可得。本發明的積極進步效果在于：本發明提供一種獲得生產pf1022的半知菌無孢霉菌的方法，該方法所得的菌株產pf1022a產量高，該方法重復性好，能夠有效獲得將pf1022a產量提高至少120％的半知菌無孢霉菌菌株roselliniasp.pf1022，可見該方法能夠有效地提高pf1022a的產量，從而有利于pf1022a的產業化生產。附圖說明圖1為未加入高滲溶液的roselliniasp.pf1022菌株的菌落形態。圖2為加入0.7molkcl溶液的roselliniasp.pf1022菌株的菌落形態。圖3為加入0.9molkcl溶液的roselliniasp.pf1022菌株的菌落形態。具體實施方式下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但并不因此將本發明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。實施例中，若無特別說明，百分比的含義為相對于培養基總體積的質量體積百分比。所述質量體積百分比指每100ml所述培養基中，含有組分的克數。如，葡萄糖1％指每100ml所述培養基中含有1g葡萄糖。實施例中的半知菌無孢霉菌rosellinia.sp.pf1022為購自nitebiological resourcecenter(日本技術評價研究所生物資源中心)，編號為nbrc-33096的rosellinia.sp.pf1022。種子培養基的組成為：1％葡萄糖、2％可溶性淀粉、0.3％酵母抽提物、0.6％麥芽浸粉、0.2％豆餅粉和0.2％碳酸鈣，所述百分比為質量體積百分比，用0.3mol/l的鹽酸溶液調節所述種子培養基的ph至6.2。發酵培養基的組成為：2％葡萄糖、5％可溶性淀粉、0.4％酵母抽提物、0.8％麥芽浸粉、1.5％豆餅粉和0.2％碳酸鈣，用0.3mol/l的鹽酸溶液調節所述種子培養基的ph至6.2。hplc測定的條件為：色譜柱為hypersilc18柱(4.6mm×150mm，5μm)；流動相為乙腈：水，體積比80:20；流速為1ml/min；柱溫為30℃；檢測波長為220nm；進樣量為20μl；出峰時間為7.3min。實施例1高滲平板固體培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖、1.8％瓊脂和濃度為0.7mol/l的kcl，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。所述高滲平板固體培養基由以下的方法制得：將200g土豆切成小塊放入鍋中，加水后加熱至沸騰，維持20min，用8層紗布過濾，補充水分至1000ml，加入20g葡萄糖、18g瓊脂和0.7molkcl即可。斜面培養基的組成除不含kcl以外，其他組分和制備方法均與所述高滲平板固體培養基的組成和制備方法相同。對比平板固體培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖和1.8％瓊脂，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。(1)、將保存在甘油中的rosellinia.sp.pf1022在均漿器中碾碎后，稀釋至10-3～10-4個/ml得稀釋液，取0.1ml稀釋液均勻涂布于所述高滲平板固體培養基上和對比平板固體培養基上，置于26℃培養箱中培養7天，隨機選擇高滲平板固體培養基上的十個單菌落(參見圖2)，獲得單菌落。(2)鏟取2cm2的步驟(1)所得的單菌落的成熟菌苔，在斜面培養基的試管壁上碾碎，均勻地涂于斜面培養基上，26℃條件下中培養6天，得菌 落a。(3)接種2cm2步驟(2)所得的菌落a至種子瓶中的種子培養基，在26℃、200rpm的搖床中震蕩培養4天，得種子液。以10％(v/v)的接種量將所述種子液移種于發酵培養基中，在26℃、200rpm的搖床中震蕩培養8天，得發酵液。發酵結束后向所述的發酵液中加入等體積的甲醇后超聲20min，得超聲的發酵液。所述超聲的溫度為20℃、頻率為90hz。將超聲的發酵液過濾取上清液，所得的上清液中即含pf1022a。hplc測定所得的上清液中pf1022a的發酵單位，結果如表1所示。表1發酵單位與單菌落形態菌落編號菌落形態菌落直徑(mm)發酵單位(g/l)菌落1較大，平6632菌落2大，稍凸，正面呈淺黃色8516菌落3小，圓形2928菌落4較大，形狀不規則5775菌落5較小，凸，內部凹陷31017菌落6小，圓形2.5933菌落7較大，形狀不規則，凸5821對比菌落大，平，絮狀15478表1的結果說明，在使用高滲平板固體培養基進行選擇的情況下，所獲的菌株的發酵單位的高低與該菌株的單菌落的形態有一定的相關性，單菌落直徑越小，如小于5mm時尤其是小于3mm時，且單菌落的形狀為圓形，能夠獲得更高的發酵單位。而對比菌落的菌落形態參見圖1。圖1說明，由于對比平板固體培養基中沒有加入高滲溶液，菌株的菌絲體向平板周圍攀爬能力強，產生平鋪的形態，不存在顯著的形態差異，以至于不能利用形態進行選擇。實施例2高滲平板固體培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖、1.8％瓊脂和濃度分別為0.1mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l、0.7mol/l、0.9mol/l或1mol/l的kcl，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。將200g土豆切成小塊放入鍋中，加水后加熱至沸騰，維持30min，用8層紗布過濾，補充水分至1000ml，加入2g葡萄糖、18g瓊脂和kcl即可。斜面培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖和1.8％瓊脂，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。所述斜面培養基的制備方法與所述高滲平板固體培養基的制備方法相同。(1)、將保存在甘油中的rosellinia.sp.pf1022在均漿器中碾碎后，稀釋至10-3～10-4個/ml得稀釋液，取0.1ml稀釋液均勻涂布于所述高滲平板固體培養基上，置于26℃培養箱中培養7天，選取菌落直徑小于5mm，形狀為圓形的單菌落。(2)鏟取2cm2的步驟(1)所得的單菌落的成熟菌苔，在斜面培養基的試管壁上碾碎，均勻地涂于斜面培養基上，26℃條件下中培養6天，得菌落a。其余的步驟與實施例1完全一致。計算實施例2所獲得的菌株的pf1022a的發酵單位與實施例1所得的對比菌落的pf1022a的發酵單位的比值。若該比值≥120％，則將該菌株記為正突變菌株。其中，正突變率的含義為正突變菌株的數目占實施例2最終獲得的菌株的數目的百分比。實施例2所獲得的菌株的pf1022a的發酵單位與出發菌株的pf1022a的發酵單位的結果和計算出的正突變率結果見于表2。為了體現實施例2具有良好的重復性，將實施例2的重復3個批次。表2的結果說明，只要運用實施例2的方法，就能使的菌株的pf1022a的發酵單位與出發菌株的pf1022a的發酵單位提高1.2倍以上。可見實施例2能夠有效、可靠地獲得高產pf1022a的菌株。此外，不同濃度的kcl能夠影響pf1022a的發酵單位，隨著kcl濃度的增加，所獲菌株的正突變率也呈現相 應的增加。其中當kcl的濃度為0.5mol/l或者0.7mol/l時，正突變率增加尤為明顯。實施例2重復3個批次所產生的結果一致，說明該方法具有良好的重復性。其中，含有0.7mol/lkcl的平板培養基上菌落生長的形態如圖3所示，圖3說明，在含有0.7mkcl的平板上，菌落收縮，面積變小，菌體有了一定的厚度，有的甚至會在內部出現凹陷，形態差異大。表2正突變率實施例3高滲平板固體培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖、1.8％瓊脂和濃度分別為0.1mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l、0.7mol/l、0.9mol/l或1mol/l的mgso4.7h2o，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。斜面培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖和1.8％瓊脂，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。其余所有條件均與實施例2完全一致。結果如表3所示，表3的數據說明，不同濃度的mgso4.7h2o能夠影響pf1022a的發酵單位，隨著mgso4.7h2o濃度的增加，所獲菌株的正突變率也呈現相應的增加。其中當mgso4.7h2o的濃度為0.5mol/l或者0.7mol/l時，正突變率增加尤為明顯。實施例3重復3個批次所產生的結果一致，說明該方法具有良好的重復性。表3正突變率實施例4高滲平板固體培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖、1.8％瓊脂和濃度分別為0.1mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l、0.7mol/l、0.9mol/l或1.2mol/l的nacl，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。斜面培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖和1.8％瓊脂，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。其余所有條件均與實施例2完全一致。結果如表4所示，表4的數據說明，不同濃度的nacl能夠影響pf1022a的發酵單位，隨著nacl濃度的增加，所獲菌株的正突變率也呈現相應的增加。其中當nacl的濃度為0.5mol/l或者0.7mol/l時，正突變率增加尤為明顯。實施例4重復3個批次所產生的結果一致，說明該方法具有良好的重復性。表4正突變率實施例5高滲平板固體培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖、1.8％瓊脂和濃度分別為0.1mol/l、0.3mol/l、0.5mol/l、0.7mol/l、0.9mol/l或1.2mol/l的山梨醇，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。斜面培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖和1.8％瓊脂，余量為水，所述百分比為質量體積百分比(單位g/l)。其余所有條件均與實施例2完全一致。結果如表5所示，表5的數據說明，不同濃度的山梨醇能夠影響pf1022a的發酵單位，隨著山梨醇濃度的增加，所獲菌株的正突變率也呈現相應的增加。其中當山梨醇的濃度為0.5mol/l時，正突變率增加尤為明顯。實施例5重復3個批次所產生的結果一致，說明該方法具有良好的重復性。表5正突變率實施例6高滲平板固體培養基的組成為：15％馬鈴薯、3％葡萄糖、1.5％瓊脂和濃度為0.7mol/l的kcl，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。斜面培養基的組成為：15％馬鈴薯、3％葡萄糖和1.5％瓊脂，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。(1)、將保存在甘油中的rosellinia.sp.pf1022在均漿器中碾碎后，稀釋至10-3個/ml得稀釋液，取0.1ml稀釋液均勻涂布于所述高滲平板固體培養基上，置于25℃培養箱中培養8天，選取菌落直徑小于3mm，形狀為圓形的單菌落。(2)鏟取2cm2的步驟(1)所得的單菌落的成熟菌苔，在斜面培養基的試管壁上碾碎，均勻地涂于斜面培養基上，25℃條件下中培養8天，得菌落a。其余所有條件均與實施例2完全一致。結果如表6所示，表6說明，所選擇的5個直徑小于3mm，形狀為圓形的菌落(即菌落1～5)的發酵單位均優于出發菌株。表6發酵單位(mg/l)實施例7高滲平板固體培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖、2％瓊脂和濃度為0.7mol/l的kcl，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。斜面培養基的組成為：15％馬鈴薯、2％葡萄糖和2％瓊脂，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。(1)、將保存在甘油中的rosellinia.sp.pf1022在均漿器中碾碎后，稀釋至10-4個/ml得稀釋液，取0.1ml稀釋液均勻涂布于所述高滲平板固體培養基上，置于28℃培養箱中培養6天，選取菌落直徑小于4mm，形狀為圓形的單菌落。(2)鏟取2cm2的步驟(1)所得的單菌落的成熟菌苔，在斜面培養基的試管壁上碾碎，均勻地涂于斜面培養基上，28℃條件下中培養6天，得菌落a。其余所有條件均與實施例2完全一致。結果如表7所示，表7說明，所選擇的5個直徑小于4mm，形狀為圓形的菌落(即菌落1～5)的發酵單位均優于出發菌株。表7發酵單位(mg/l)實施例8高滲平板固體培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖、1.8％瓊脂和0.3mol/lnacl和0.5mol/l的kcl，余量為水，所述百分比為質量體積百分 比。斜面培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖和1.8％瓊脂，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。其余所有條件均與實施例2完全一致。結果如表8所示，表8說明，使用兩種或多種溶質形成高滲條件，也能夠達到選擇獲得正突變率高的菌株的目的。表8正突變率正突變率(％)獲得菌株對比菌株批次14.42.1批次24.81.9批次34.92.2對比例1高滲平板固體培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖、1.8％瓊脂和濃度為0.05mol/l的kcl，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。斜面培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖和1.8％瓊脂，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。其余所有條件均與實施例2完全一致。結果如表9所示，表9的數據說明，用含有濃度過低的高滲溶液的高滲平板固體培養基培養，菌落形態差異不明顯，難以根據選擇得到正突變高的菌株。表9正突變率正突變率(％)獲得菌株對比菌株批次12.02.1批次21.91.9批次32.32.2對比例2高滲平板固體培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖、1.8％瓊脂和濃度為1.5mol/l的kcl，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。斜面培養基的組成為：20％馬鈴薯、2％葡萄糖和1.8％瓊脂，余量為水，所述百分比為質量體積百分比。其余所有條件均與實施例2完全一致。結果如表10所示，表10的數據說明，用含有濃度過高的高滲溶液的高滲平板固體培養基培養，由于產生了嚴重的高滲逆境，影響正常的代謝功能，因而正突變率嚴重下降。表10正突變率正突變率(％)獲得菌株對比菌株批次10.92.1批次21.01.9批次30.72.2應理解，在閱讀了本發明的上述內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。當前第1頁12