專利名稱：作為抗瘧劑的rna適體的篩選的制作方法
技術領域：
本發明涉及用作抗瘧劑的針對惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)紅細胞膜蛋 白l(PfEMPl)保守區的特定RNA適體。此外，本發明涉及該適體用于診斷相對于不太嚴重 瘧疾的嚴重瘧疾的用途。
背景技術：
適體是通過不同于典型沃森_克里克堿基配對的相互作用對分子具有特異結合 親和力的核酸分子。與通過噬菌體展示產生的肽或單克隆抗體(“mAb”)一樣，適體能夠特異性結合到 選定的靶，并調節靶的活動或結合相互作用，例如，通過結合適體可以阻斷它們的靶發揮作 用的能力。通過隨機序列寡聚核苷酸庫的體外(in vitro)篩選過程而發現，已經產生包括 生長因子、轉錄因子、酶、免疫球蛋白和受體在內的超過130種蛋白質的適體。典型的適體 大小為10-15kDa (20-45核苷酸)，以納摩爾至亞納摩爾的親和力結合其靶，并且區別對待 密切相關的靶(例如，適體通常不結合來自相同基因家族的其它蛋白質)。一系列結構研究 顯示適體能夠利用促進抗體_抗原復合物親和力和特異性的相同類型的結合相互作用(例 如，氫鍵結合、靜電互補、疏水接觸、空間排斥)。適體具有許多用作治療劑和診斷劑所需的特征，包括高特異性和親和力、生物效 能和優異的藥代動力學性能，此外，它們提供超過抗體和其它蛋白質生物物質(biology) 的特定的競爭優勢，例如1)速度和控制。適體是通過完全的體外方法生產的，允許起始先導序列(lead)， 包括治療先導序列的快速生產。體外篩選使適體的特異性和親和力得到嚴格控制，并允許 先導序列，包括抗毒性和非免疫原性靶兩者的先導序列的生產。2)毒性和免疫原性。作為一個類別，適體顯示出治療可接受的毒性并缺乏免疫原 性。然而許多單克隆抗體的功效能夠受到對抗體自身的免疫反應的嚴重限制，但引發抗適 體的抗體是極其困難的，很可能是由于適體不能經MHC由T細胞遞呈和免疫反應通常被訓 練為不識別核酸片段。3)施用。盡管多數當前批準的抗體治療劑通過靜脈輸注施用(通常地超過2-4小 時)，但適體能夠通過皮下注射施用(猴子研究中經皮下施用的適體生物利用率為> 80% (Tucker et ah, J. Chromatography B. 732 203-212,1999))。具有良好的溶解性(> 150mg/ mL)和相對低的分子量(適體10-50kDa;抗體150kDa)，適體一周的劑量可通過以小于 0. 5mL的體積注射來遞送。此外，適體的小尺寸允許其滲入到對抗體或抗體片段不允許滲透 的構造收縮區(conformational constriction)，顯示出基于適體的治療或預防的另一優 點o4)可規模化和成本。治療性適體是化學合成的，因此能夠根據需要容易地規模 化以滿足生產需求。盡管當前規模生產中的困難限制了一些生物物質的利用率，并且大規 模蛋白質生產工廠的資本成本是巨大的，但是單個大規模寡核苷酸合成儀能夠生產達到 100kg/年，并要求相對適中的初期投資。當前對于千克規模的適體合成的產品成本估計為
4$500/g，與高度優化的抗體的產品成本相當。五年內期望在方法開發方面的持續改善使產 品成本降低到< $100/g。5)穩定性。治療性適體是化學穩固的。暴露于因素如熱和變性劑后，它們本質 上適于恢復活性，并且作為凍干粉末能夠在室溫下長期儲存(> 1年)。
而且， 適體發現過程容易地允許先導序列修飾，如適體序列優化和適體長度最小化[Conrad等 人，1996，Eaton等人，1997]。此外，可利用2'修飾如2' _氟代和2' _0_Me來穩定化 以防核酸酶，而不損害適體與靶的結合相互作用。參見例如Lin等人，Nucleic Acids Res. 22,5229-5234(1994) Jellinek 等人，Biochemistry 1995,34,11363-1137 ；Lin 等人， Nucleic AcidsRes.，1994，22，5229-5234 ;Kubik 等人，J Immunol.，1997，159 (1)，259-267 禾口 Pagratis 等人，Nat. Biotechnol.，1997，1，68-73。嚴重瘧疾幾乎完全由惡性瘧原蟲感染引起，并通常在感染后6-14天發病。如果不 經治療嚴重瘧疾的后果包括昏迷和死亡，幼童和孕婦特別容易感染。可能發生脾腫大(脾 臟腫大)、劇烈頭痛、腦缺血、肝腫大(肝臟腫大)、低血糖和血紅蛋白尿伴隨腎衰竭。腎衰 竭可引起黑水熱，其中來自溶解的紅細胞的血紅蛋白滲漏到尿中。嚴重瘧疾能夠極快速的 發展并在數小時或數天內弓丨起死亡。在多數嚴重病例中的致死率可超過20 %，甚至在采取 了加強監護和治療時也是如此。在流行地區，治療經常是較不令人滿意，和對于所有瘧疾病 例的總致死率可高達十分之一。在較長的時期內，已證明在遭受嚴重瘧疾發作的兒童中存 在發育損傷。惡性瘧原蟲是人類中嚴重瘧疾的病原體。全世界每年數百萬人感染惡性瘧原蟲， 超過一百萬死亡，其中多數是撒哈拉以南非洲的小孩。用于瘧疾治療的藥物在過去主要選 擇奎寧和氯奎，并自從20世紀60年代開始為磺胺多辛/乙胺嘧啶(SP)。不幸地是在流 行地區已證明了寄生蟲對這些藥物的抗性。當今作為一線治療使用的最有效的藥物是青 蒿素及其衍生物。雖然對于青蒿素還沒有顯示出臨床抗性，但有跡象表明在惡性瘧原蟲 中對該藥物發展了體外抗性。已描述了在流行地區內居民中對嚴重瘧疾的非消除性免疫 (non-sterile immunity)。這表明寄生蟲中抗原同質性的存在，引起嚴重瘧疾。已知通過形成玫瑰花結(rosetting)和內皮粘著過程負責嚴重腦型瘧的蛋白質 是表達于感染的紅細胞表面的紅細胞膜蛋白l(PfEMPl)。它暴露于感染的紅細胞上，結合到 許多人細胞表面受體，如硫酸肝素、ICAM-1、CD36、CSA，能夠使寄生蟲粘著到小血管的內皮 內層(細胞粘連)以及粘著到非感染的紅細胞(形成玫瑰花結)，由此防止從血流中被脾臟 清除。這種隔離的寄生蟲造成相當大的組織灌注阻礙。PfEMPl主要由duffy結合配體結構域(DBL)和結構域間半胱氨酸富含區(C1DR) 組成，并且結構域的數量和蛋白質的大小根據60個var-基因的所表達而變化。寄生蟲有規 律地改變表達的var-基因并因此產生感染的紅細胞表面的抗原變異的事實便于寄生蟲躲 避宿主的免疫系統。雖然由于這種蛋白的粘著功能期望某些序列保守。通過在PfEMPl結構 域中具有高度序列保守的N-末端Duffy樣結合結構域(DBL1 a )調節毒性相關表型(形成 玫瑰花結)。雖然在具有相似結構的結構域上已進行了廣泛的模擬，但不知道DBL1 a的決 定性結構。這使得DBL1成為用于開發抗嚴重瘧疾新藥的有吸引力的候選物。試圖進行對 DBL1 a中結構保守的表位的抗體識別而沒有較大的成就，由于事實上保守區被可變區在某 種程度上掩蔽使其難以接近到相對大的抗體。
Chen，Q 等人，Vaccine 22 (2004)，2701-2712 頁公開了用 PfEMPl-DBLl a 免疫產生 破壞玫瑰花結并防止感染惡性瘧原蟲的紅細胞的隔離的抗體。使用PfEMPl-DBLl a蛋白產 生抗體是次級治療性治療，而市場需要直接治療劑和方法。Moll，K 等人，Inf. Imm. 75(1)卷，(2007 年 1 月)，211-219 頁公開了通過用紅細 胞膜蛋白1-duffy結合樣la結構域免疫產生抗惡性瘧原蟲隔離的交叉保護性抗體。同樣 此工作利用PfEMPl-DBLl a蛋白產生抗體是次級治療性治療，而市場需要直接治療劑和方法。基于這些特征，本發明人設計了通過指數富集的配體的系統進化(Systematic Evolution of Ligand by Exponential Enrichment, SELEX)方法，其可以設計成允i午f帝選 以高親和力和特異性結合到DBL1 a的結構保守部分的RNA適體。Ulrich, H.等人，J. Biol. Chem，277 卷(2002)，20756-20762 頁描述了用于體外 篩選結合到細胞粘著受體克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)并抑制細胞侵襲的RNA適體的 SELEX方法。已報道了用于其它病原寄生蟲的相似策略，其中成功地篩選了抗毒性表面蛋白的 適體。在一個報道例子中，篩選了抗布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)的可變表面糖蛋白 (VSG)的高親和力RNA適體，證明其能夠引導抗體到活錐體蟲的表面。其它報道研究使用不 同的方法。篩選不是利用來自克氏錐蟲的表達的表面蛋白，而是利用4種不同的人表面受 體的置換技術進行的(Ulrich，H.等人，上述)。克氏錐蟲引起慢性期心臟問題，由此治療包括管理該疾病的臨床表現。例如，對于 一些患有慢性心臟病的病人，用于心律不齊的起搏器和藥物處理可能拯救生命，而對于巨 型腸(megaintestine)可能需要外科手術。然而，疾病不能在此階段被治愈。由恰加斯氏 病引起的慢性心臟病是現在心臟移植手術的常見原因。然而，直到最近才認為，恰加斯氏病 是該操作的禁忌癥，因為當外科手術后寄生蟲將預期抓住由免疫抑制提供的機會使心臟損 傷可能復發。已顯示適體表現出與抗體相同的對其靶的高特異性和親和力。除了有效結合外， 適體還顯示對其靶的抑制活性。SELEX方法基于體外篩選循環的重復步驟的反復過程，其中 將1014-1015個不同分子的初始DNA/RNA文庫降低到對相關靶具有高親和力的大約100個不 同分子的更小的庫。Lee, J. F.等人，Curr Opi. Chem. Biol. (2006)，10 :282_289 是對適體治療進展的 綜述。由此討論了抗HIV-1、抗-VEGF、抗-RET、抗-茶堿和抗肌腱蛋白_C的適體。Hjalmarsson,K.等人，F0I-R-1216-SE(ISSm650_1942)討論了適體-未來用于診 斷和治療的工具，并特別涉及到SELEX方法學。給出了不同適體及其選擇性使用的綜述。Goringer, H. U.等人，Int. J. Parasit. 33 (2003)，1309-1317 公開了對寄生蟲靶分
子具有高親和力的核酸配體的體外篩選，并討論了瘧疾，從而作者主要得出結論由于組分 的隨機篩選方法在識別抗寄生化合物方面還沒有成功，已放緩了開發過程。作者集中討論 了 SELEX方法。雖然瘧疾是提到的第一個寄生蟲，沒有暗示使用適體可處理其副作用，但是 作者討論了布氏錐蟲引起的睡眠病。Normark, J.等人，PNAS, (2007) 104 卷，15835-15840 頁公開了 PfEMPl-DBLl a 氨 基酸基序存在于惡性瘧原蟲瘧疾的嚴重病況。該論文沒有討論適體作為由惡性瘧原蟲引起
6的嚴重瘧疾治療的潛在藥劑，而是討論了產生抗體作為可能方案。Krause，D. R.等人，Inf. Imm. 75卷，(2007)5967-5973頁公開抗惡性瘧原蟲的抗體
反應，并討論了來自志愿者的血清抑制復原。作者陳述了該蛋白質(PfEMPl)在寄生蟲內和 之間的多樣性與變體之間的抗原性開關結合，使得PfEMPl特異性免疫的開發研究變得困難。W02004/080420 (Mota等人)概括地公開了通過向需其的哺乳動物施用抗瘧劑而 防止或抑制體內(in vivo)瘧疾活性的方法，并指出要干擾多條不同的通路。特別地該公 開討論了 MET抑制，MET是肝細胞生長因子的受體。該公開甚至提到了適體但沒有任何說 明。通常該公開是非常概念性而沒有提供任何具體解決方案，僅僅是關于治療瘧疾可能路 徑的想法。Jayasena, S. D. Clin. Chem. 45 9(1999) 1628-1650 頁公開了作為在診斷中與抗體 競爭的一類新興分子的適體。然而，該公開沒有給出治療性適體用于治療瘧疾的說明。本發明人進一步顯示了這些特異性高親和力結合適體能夠結合到活寄生蟲表面 的PfEMPl，并最終它們具有破壞玫瑰花結的能力。在此，顯示了在體外影響玫瑰花結形成的 一組適體的特異性結合。進一步提出使用這些適體診斷嚴重瘧疾是否存在，例如，區分瘧疾 的輕度(或不太嚴重形式)和嚴重形式。發明_既述因此本發明涉及針對PfEMPl產生的作為抗瘧劑的某些RNA適體或其活性片段。發明詳述特別地本發明涉及針對惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白1 (PfEMPl)的半保守duffy結合 配體結構域1 a (DBL1 a )區域產生的某些RNA適體。在其優選實施方案中，本發明涉及選自由以下組成的組的適體UGCCAACCUUCGAUGCAAGAUAAUACUUUUGAUGGUGUA⑶CGUAUU⑶U(SEQ. ID. NO. 1)UCAU⑶GCCA⑶⑶UUGAAAAAACGCGUUGAUUGCUGGUGUG⑶GAGCUA⑶(SEQ. ID. NO. 2)，CUUCGAACGGCCCUGGUU⑶UG⑶UUUAAUUCAUUUAUCCGCGUG⑶CACG⑶(SEQ. ID. NO. 3)，UAGCUCACCACACCAGCAAUCAACGCGUUUUUUCAAACACUGGCACAUGA(SEQ. ID. NO. 4)AACAAUACGACUACACCAUCAAAAGUAUUAUCUUGCAUCGAAGGUUGGCA(SEQ. ID. NO. 5)，禾口GUGACCACGCGGAUAAAUGAAUCAAAAACAACAACCAGGGCC⑶UCGACUACGCUAAUUAUCCCG(SE Q. ID. NO. 6)或其活性片段。在其優選實施方案中，本發明涉及具有序列GACUGAUUACGCCAGCUUGG (SEQ. ID. NO. 23)或 GACfUfGAUfUfACfGCfCfAGCfUfUfGG(SEQ. ID. NO. 24)的適體。在其更優選的實施方案中，本發明涉及選自由下述組成的氟化適體組成的組的適 體ufgcfcfaacfcfufufcfgaufgcfaagaufaaufacfufufufufgaufggufgufagufcfgufaufufgufuf(se Q. ID. NO. 7)，ufcfaufgufgcfcfagufgufufufgaaaaaacfgcfgufufgaufufgcfufggufgufggufgagcfufaguf(se
Q. ID. NO. 8)和cfufufcfgaacfggcfcfcfufggufufgufufggufufufufaaufufcfaufufufaufcfcfgcfgufggufcfacfgGUf(SEQ. ID. NO. 9)，UfAGCfUfCfACfCfACfACfCfAGCfAAUfCfAACfGCfGUfUfUfUfUfUfCfAAACfACfUfGGCfACfAUfGA(SE Q. ID. NO. 10)aacfaaufacfgacfufacfacfcfaufcfaaaagufaufufaufcfufufgcfaufcfgaaggufufggcfa(seq.
ID. NO. 11)gufgacfcfacfgcfggaufaaaufgaaufcfaaaaacfaacfaacfcfagggcfcfgufufcfgacfufacfgcfufa
AUfUfAUfCfCfCfG (SEQ. ID. NO. 12)或其活性片段。本發明的另一方面涉及針對惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白1 (PfEMPl)的半保守duffy 結合配體結構域la (DBL1 a )區域產生的一種或多種適體或其活性片段在治療腦型瘧中 的用途。在其優選實施方案中，本發明涉及選自以下組成的組的適體UGCCAACCUUCGAUGCAAGAUAAUACUUUUGAUGGUGUA⑶CGUAUU⑶U(SEQ. ID. NO. 1)UCAU⑶GCCA⑶⑶UUGAAAACGCGUUGAUUGCUGGUGUG⑶GAGCUA⑶(SEQ. ID. NO. 2)，CUUCGAACGGCCCUGGUU⑶UG⑶UUUAAUUCAUUUAUCCGCGUG⑶CACG⑶(SEQ. ID. NO. 3)，TAGCTCACCACACCAGCAATCAACGCGTTTTTTCAAACACTGGCACATGA(SEQ. ID. NO. 4)AACAATACGACTACACCATCAAAAGTATTATCTTGCATCGAAGGTTGGCA(SEQ. ID. NO. 5)，和
GTGACCACGCGGATAAATGAATCAAAAACAACAACCAGGGCCGTTCGACTACGCTAATTATCCCG(SE Q. ID. NO. 6)。在其更優選的實施方案中，本發明涉及選自由下述組成的氟化適體組成的組的適 體ufgcfcfaacfcfufufcfgaufgcfaagaufaaufacfufufufufgaufggufgufagufcfgufaufufgufuf(se
Q. ID. NO. 7)， ufcfaufgufgcfcfagufgufufufgaaaaaacfgcfgufufgaufufgcfufggufgufggufgagcfufaguf (se
Q. ID. NO. 8)cfufufcfgaacfggcfcfcfufggufufgufufggufufufufaaufufcfaufufufaufcfcfgcfgufggufcfacfg
GUF(SEQ. ID. NO. 9)UfAGCfUfCfACfCfACfACfCfAGCfAAUfCfAACfGCfGUfUfUfUfUfUfCfAAACfACfUfGGCfACfAUfGA(SE Q. ID. NO. 10)aacfaaufacfgacfufacfacfcfaufcfaaaagufaufufaufcfufufgcfaufcfgaaggufufggcfa(seq.
ID. NO. 11)gufgacfcfacfgcfggaufaaaufgaaufcfaaaaacfaacfaacfcfagggcfcfgufufcfgacfufacfgcfufa
AUFUFAUFCFCFCFG (SEQ. ID. NO. 12)。本發明更進一步的方面涉及通過確定血液樣品對針對惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白 1 (PfEMPl)的半保守duffy結合配體結構域1 a (DBL1 a )區域產生的適體的反應來確定存 在嚴重瘧疾的診斷工具。本發明更進一步的方面涉及預防性地和/或治療性地治療嚴重瘧疾的方法，該方 法是通過向正在遭受嚴重瘧疾或有遭受嚴重瘧疾風險的人施用治療有效量的針對惡性瘧 原蟲紅細胞膜蛋白1 (PfEMPl)的半保守duffy結合配體結構域1 a (DBL1 a )區域產生的適體。參考進行的實驗，將本發明描述如下。這些實驗涉及某些RNA適體的分離以及這 類某些RNA適體對形成玫瑰花結事件的生物作用。DBLla在大腸桿菌中的表達在大腸桿菌中的蛋白質表達。來自FCR3S1. 2的重組DBLlhis表達如下，將 來自 Qiagen 含有質粒 pQE-TriSystem His-Strep 2 (DBL lhis)或 pQE-60 (DBLlhis)的 SG13009(pREP4)細胞[22]在22°C或37°C生長于含氨芐青霉素(100iig/mL)和卡那霉素 (30 u g/mL)的LB培養基中。在0D6(1(1 = 0. 8時，用0. ImM IPTG誘導細胞3小時；收獲1升 細胞懸液(4°C，25分鐘，3000g)并再懸浮于25mL裂解緩沖液(50mM NaH2P04/Na0H pH 7.4， 300mMNaCl, ImMPMSF(Sigma)0. 05% Triton x-100, lOmM 咪唑)。將細胞用溶菌酶在冰上孵 育30分鐘并超聲降解。通過離心(4°C，30分鐘，18.000g)除去不溶性細胞碎片。用DNA 酶處理上清液，并在輕輕攪拌下用lmL Ni-NTA瓊脂糖珠(Qiagen)在4°C孵育2小時。珠 在 100 Xg 下沉淀 3 分鐘，并用 15mL 洗滌緩沖液(50mM NaH2P04/Na0H pH 7. 4、300mMNaCl、 0. 05 % Triton x_100、30mM 咪唑)洗滌 3 次。用 400mM 咪唑(Sigma)、50mM NaH2P04、 300mM NaCl洗脫結合的蛋白質，隨后通過在4°C用具有0. 05% Triton X-100的PBS緩沖 液透析18小時除去400mM咪唑(Sigma)、50mM NaH2P04、300mM NaCl。通過將樣品在10% SDS-PAGE上電泳估計蛋白純度，并最終測定蛋白濃度(Bradford 1976)。可選擇地，在 FPLC上純化His標記的DBL1。將大腸桿菌提取的可溶性級分以0. 5mL/min的流速加載到 FPLC(AmershamBiosciences)的 Ni_ 柱上。用 5_70mM 咪唑梯度(60mL 以 lmL/min)洗滌結 合蛋白質。用400mM咪唑洗脫并如前所述分析蛋白質。所有化學制品獲自Sigma。考慮到大腸桿菌中表達的密碼子使用，優化來自FCR3S1. 2的DBLla整個序 歹lj (Moll K, Pettersson F, Vogt AM, Jonsson C, Rasti N ^ A (2007)Generation of cross-protective antibodies against Plasmodium falciparum sequestration by immunization with an erythrocyte membrane protein 1-duffy binding-like 1 alpha domain(使用紅細胞膜蛋白1-duffy結合樣1 a結構域的免疫產生抗惡性瘧原蟲隔離的交 叉保護性抗體) Infect lmmun 75 :211_219)。通過His-標記高親和力純化，純化可溶性 DBL1 a (圖1)。以使用His-標記或DBL1 a特異性抗體的蛋白印跡確認DBL1 a His。通過其 對肝素(DBLla的主要靶之一)的親和力分析重組結構域的“活性”。重組結構域結合自由 形式和在肝素柱上的肝素。DBL1 a特異性RNA適體的篩選對于體外篩選，使用5X1014隨機選擇RNA序列的組合文庫。該文庫由具有50個核 苷酸大小的序列組成，這些序列在側端有20個核苷酸的引物結合位點，產生90個核苷酸的 RNA分子。T7 RNA轉錄在2' F-修飾的嘧啶核苷酸存在時進行以篩選血清穩定適體。策略 是富集對來自高玫瑰花結株FCR3S1. 2的重組DBLla結構域具有親和力的適體。對預先結 合到鎳珠的DBLla進行八輪篩選和擴增。通過測定在每個SELEX輪次中結合RNA的百分 數來監測實驗過程(圖2)。通過篩選輪次觀察到RNA回收的增加，并且在第8輪中達到具 有大約58% RNA回收的最大結合。為避免非特異性結合到Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)基質， 在每個篩選輪次前對純基質進行預篩選。將來自第8輪的擴增DNA庫克隆到TA載體，并測 定70個單獨克隆的核苷酸序列。利用MEME/MAST的生物信息數據顯示，克隆聚類成幾個保守組。利用MEME/MAST將測序的克隆分組基序搜索產生了在幾個不同保守組中的克隆分類。最保守組(A)包含6個成員。 組(B)到(D)具有統計值，而最后兩個大組具有低程度的保守性。在數據集中識別了具有 3-4個所列成員的大量較小但保守很好的組。表1右列是70個測試的克隆內共有序列出 現的頻率。將幾個克隆如g06和g07分成兩個組(A和D)。當使用mfold (電腦免費軟件) 在富G-T組(E)內的克隆的隨機區預測二級結構時，檢測到感興趣的觀察。這些克隆構建 具有低AG值和55°C以上熔點的相當穩定的結構。與組(E)的克隆相反，組(F)的克隆 在隨機區進行mfold預測時沒有穩定的二級結構。最后在70個克隆中存在大量孤兒克隆 (orphan)。表1.由MEME/MAST軟件在來自對DBL1 a His體外篩選的70個測序的克隆上產生 的分離的多級共有序列。
(組)和多級共有序列MEME概率評分發生(A) GACTGATTACGCCAGCTTGG(E = 7. 9X1CT20)8. 6%(B) CACACTGGCGGCCGCTCGAG(E = 2. oxicr7)5. 7%(C) rAATTCGCCCTTGCCG(E = 3. 9X1CT6)12. 9%(D) rAGCTCGGATCCACTAATAA(E = 1. 6X10—4)12. 9%(E) rGTTGTTGGTTTGGCTTGTT(E = 6. 2X10°)25. 7%(F) rAACACCAACACCAACA(E = 3. 0X103)18. 6%在重組DBL1 a His上測試單個適體。測試大量克隆對DBL1 a His的結合。以來自庫 0的未篩選RNA作為陰性對照，在DBL1 a His上分析放射標記克隆的回收。以這種方式可以 觀察到不同克隆間結合親和力的變化。將顯示較高程度結合的克隆用于進一步研究。在圖 3顯示的實驗中蛋白質的濃度為350-400nM，RNA為40nM。克隆b02、dl2、e05具有相似的 回收水平(70 % )，而來自庫0的未篩選RNA具有11. 7 %的回收率。代表最后SELEX篩選庫 的庫8具有51 %的回收率。克隆e 11具有低于b02、dl2、e05的回收水平，表示更低的結合 親和力。進行了幾種其它結合實驗(數據未顯示)，并且篩選的克隆的RNA回收水平通常低 于70%，但總是明顯高于(2-5倍)未篩選的RNA。從進行的實驗得出如下結論DBLlams 和RNA之間的比率對回收水平具有最深遠的影響。RNA/DBLlams在1 9通常產生高的回 收率，而RNA/DBLla 1吣在1 3的比率產生低水平的回收(篩選克隆為12-25%的回收， 未篩選的RNA為1-4%的回收)。選擇顯示較高回收率的克隆用于電泳遷移率變動測定并 在活細胞測定中測試。分別確定克隆dl2，b02和e05的核酸序列，并由下列RNA序列表示dl2/l，2
10
UGCCAACCUUCGAUGCAAGAUAAUACUUUUGAUGGUGUA⑶CGUAUU⑶U(SEQ. ID. NO. 1)UAGCUCACCACACCAGCAAUCAACGCGUUUUUUCAAACACUGGCACAUGA(SEQ. ID. NO. 4)b02/l，2UCAU⑶GCCA⑶⑶UUGAAAAAACGCGUUGAUUGCUGGUGUG⑶GAGCUA⑶(SEQ. ID. NO. 2)AACAAUACGACUACACCAUCAAAAGUAUUAUCUUGCAUCGAAGGUUGGCA(SEQ. ID. NO. 5)，e05/l，2CUUCGAACGGCCCUGGUU⑶UG⑶UUUAAUUCAUUUAUCCGCGUG⑶CACG⑶(SEQ. ID. NO. 3)。GUGACCACGCGGAUAAAUGAAUCAAAAACAACAACCAGGGCC⑶UCGACUACGCUAAUUAUCCCG(SE Q. ID. NO. 6)為提高適體在血液中的半衰期和穩定性，可以將其在一個或多個碳原子優選全部 碳原子上氟化。然后從上述公開的適體中獲得下列適體ufgcfcfaacfcfufufcfgaufgcfaagaufaaufacfufufufufgaufggufgufagufcfgufaufufgufuf(se
Q. ID. NO. 7)， ufcfaufgufgcfcfagufgufufufgaaaaaacfgcfgufufgaufufgcfufggufgufggufgagcfufaguf (se
Q. ID. NO. 8)和cfufufcfgaacfggcfcfcfufggufufgufufggufufufufaaufufcfaufufufaufcfcfgcfgufggufcfacfg GUF(SEQ. ID. NO. 9)，UfAGCfUfCfACfCfACfACfCfAGCfAAUfCfAACfGCfGUfUfUfUfUfUfCfAAACfACfUfGGCfACfAUfGA(SE Q. ID. NO. 10)aacfaaufacfgacfufacfacfcfaufcfaaaagufaufufaufcfufufgcfaufcfgaaggufufggcfa(seq.
ID. NO. 11)gufgacfcfacfgcfggaufaaaufgaaufcfaaaaacfaacfaacfcfagggcfcfgufufcfgacfufacfgcfufa
AUfUfAUfCfCfCfG (SEQ. ID. NO. 12)或其活性片段。此外，可以通過去除上述各序列的部分獲得適體的活性片段。電泳遷移率變動測定為研究溶液中rna/dbllahis相互作用，進行了大量實驗。用于這些實驗的蛋白質 是從ni-nta珠上新鮮洗脫的，以避免在溶液中長期儲存和冷凍，從而防止dbl1 a His沉淀。 用32p-atp內部標記rna，用dbl1 a His或bsa孵育后在10%非變性聚丙烯酰胺凝膠上分析遷 移。在圖4顯示的上部帶(177個核苷酸長度的rna)是源自較長轉錄模板的t7轉錄的不 正確產物。該模板是在前面pcr反應中產生的產物(pcr引物結合到t0p0-載體中外部t7 位點)。隨著向rna克隆b02和e05加入dbl1 a his，90nt的主要產物顯著地降低，而上部帶 (177nt)保持不變，表明177nt rna分子不與dbl1 a His相互作用。甚至克隆dl2和一定程 度的fll也顯示當與dbllahis孵育時90nt rna分子降低。通常在ni_nta珠上體外結合到 dbllams中顯示低回收率的克隆b03顯示非常低的90nt rna的量的變化。進行emsa實驗 過程中，沒有觀察到真實帶位移(結合到蛋白質的rna分子具有較慢的遷移)。圖5中見到 的克隆e05的90nt rna的主帶位移在凝膠中沒有遷移，而保持于凝膠頂部上樣孔下面。結合到活寄生蟲的適體為了驗證適體表面結合到活寄生蟲，用熒光素標記的適體進行活細胞測定。熒光
11素標記的核苷酸被共轉錄摻入到RNA適體中。用熒光顯微法檢測表面結合適體。結果總結 于圖6中。使用來自未篩選庫0的熒光素標記的適體RNA作為該實驗過程中的對照。這些 結果顯示在特異性單個RNA適體及從庫8篩選的RNA和寄生蟲感染的紅細胞之間的顯著締
1=1 oRNA適體對體外FCR3S1. 2中形成玫瑰花結的影響由于利用熒光素標記的RNA適體的活細胞測定顯示締合到被感染的紅細胞，下一 步分析該相互作用是否能夠影響高度玫瑰花結和多粘著的克隆FCR3S1. 2的血液培養物的 玫瑰花結狀況。FCR3S1. 2的玫瑰花結和細胞粘連對肝素和硫酸肝素敏感，并且能夠在具有 5%寄生蟲血癥的5%血細胞比容培養物中添加lOOii g/mL肝素來破壞玫瑰花結。認為該破 壞是由 DBLla 結合的硫酸肝素樣 GAG(DBL1 a-bound heparin sulphate-like GAG)和溶 液中添加的肝素之間的競爭引起的。以類似方式調查是否SELEX篩選的RNA適體能夠破壞 在結合的未感染的紅細胞上DBLla和GAG之間的相互作用。用濃度為2 y g/mL (65nM)至 12 u g/mL(387nM)的來自庫0的未篩選RNA作為陰性對照在血液培養物中測試適體。對于 克隆b02、dl2和e05在12 ii g/mL看到完全破壞，并且在8 u g/mL(258nM)觀察到相對于對 照降低到35%的玫瑰花結形成率(圖7將玫瑰花結狀況計算(med)為濃度的函數)。隨著 巨大玫瑰花結降低到較小玫瑰花結，在65nM濃度處能夠看到影響(圖8)。來自庫0的RNA 在該濃度范圍內(65-387nM)沒有破壞玫瑰花結，但在650nM至850nM的未篩選RNA濃度處 觀察到輕度的破壞(比未經處理的細胞低5-10% )。測試血液/血清培養物中2’ F修飾 的適體的穩定性。孵育3小時后，當在10%尿素(UREA)-PAGE上跑樣品時沒有觀察到明顯 的降解(數據未顯示)。這與之前用2’ F修飾的RNA在血液中進行的工作相關，其中RNA 的半衰期大約為15小時。普遍接受的是嚴重瘧疾很可能是由感染的紅細胞隔離引起的，然而至今沒有可用 的特異抗隔離的藥物。PfEMPl是被惡性瘧原蟲利用通過許多途徑與人類寄主相互作用的關 鍵分子。該蛋白的粘著功能可以使寄生蟲可能粘著到內皮襯里(endothelial lining)，將 寄生蟲感染的紅細胞從外周循環中去除，并因此避免脾清除。適體能夠以極高的親和力結合其靶，并且暗示它們甚至比抗體更特異。由于抗體 必須生物學生產，其涉及昂貴的細胞培養和最終的動物模型，適體由于其能夠完全在試管 中生產而具有明顯的優點。與使用特異性抗體相比，使用適體的另一個優點是大小的不同。 由于其更小，RNA適體具有巨大的潛力到達由于空間位阻抗體不能接近的更深埋藏的結構。 另外RNA適體容易被化學修飾并在治療應用中很少或沒有引起免疫原性。通過SELEX技術 已針對PfEMPl的半保守DBL1 a區產生適體。在該方案中致力于產生RNA適體，測試不同 RNA適體對重組His-標記的DBLla的結合容量，并檢驗玫瑰花結破壞的能力。還報道以類 似方式在體外利用噬菌體展示技術在間日瘧原蟲(P. vivax)、惡性瘧原蟲的表面蛋白質上 篩選肽_或單-鏈抗體片段。已證明生產用于篩選的DBL1 a靶是一項艱難的工作。進行了改變誘導時間、溫度 和IPTG濃度的一系列不同優化實驗，但是上述提到因素似乎沒有一個對產量具有顯著的 影響。溶液中白質的量總是相當有限，并且發現多數蛋白在不溶性級分中。已 通過結合到配體肝素來測試來自可溶性級分的純化蛋白的質量評價。通過對重組DBL1 a His 的八輪篩選觀察到RNA回收的大幅增加，并且對70個克隆測序并分析以考察在篩選的RNA內的保守基序。不幸地，MEME/MAST搜索的結果顯示了大量的更小的保守組。最小化組數 的策略是通過降低隨后篩選輪次中RNA和DBL1 a His的濃度來增加篩選壓力，因此拋棄對 靶具有低親和力的RNA適體。結果是RNA結合物的更同源的庫。不幸的是由于洗滌和透 析后DBLlams的質量和溶解性顯示差，蛋白質濃度保持在 lyM。增加親和力并更重要 地獲得生物相關適體的另一方法是于活的感染的紅細胞上淘選DBL1 a His篩選的適體。通 過將FCR3S1.2(70-80%寄生蟲血癥)的富集培養物與庫8的RNA—起孵育，并由胰蛋白酶 (trypsine)消化分離表面結合RNA來測試該方法。然而結果不令人滿意，并放棄了該方法。 在70個測序的克隆中的變化和大量孤兒克隆可以是由于DBL1 a的硫酸肝素結合位點和全 部正電荷引起了其“粘著”性。當RNA分子采用穩定的雙鏈體發夾結構(duplex hairpin) 加上RNA分子負電荷性質時，可以理論上以肝素分子的糖骨架和負電荷的硫酸酯代替RNA 的磷酸酯來模仿肝素分子，并以相同方式以低KD常數結合到DBL1 a的GAG結合結構域。在 測試的克隆中，b02、dl2和e05似乎在結合到DBL1 a His方面穩定。當與DBL1 a His在400nM 濃度孵育時這些適體顯示出與蛋白質的締合，這與在EMSA實驗過程中獲得的結果相互關 聯。在這些實驗中時常觀察到的帶位移顯示在DBLlaHis存在時RNA保持在凝膠的頂部。據 認為由于DBL蛋白質的正電荷和低溶解度，RNA結合到巨大的非遷移復合物中的DBL上。
為了驗證RNA/蛋白質結合是否具有任何生物學相關性，將三個克隆用熒光素標 記，并用活FCR3S1.2寄生物孵育。將熒光素圖像與用DAPI染色的細胞核圖像合并。結果顯 示了熒光素標記的RNA和DAP1染色的細胞核之間的共定位。從該測定收集的結果顯示，與 未篩選的RNA和感染的紅細胞之間的關聯相比，在篩選的適體克隆和感染的紅細胞表面之 間的顯著的特異性。對于基于熒光的活細胞測定可替換的方法是用生物素末端標記2' F 修飾的適體，由此保持在UTP和CTP上的修飾。這極大地增強了在血液/血清培養物中的 穩定性。將2' F-d(⑶)TP與(⑶)TP交換也可以在RNA中施加小構象變化，從而與原2' F 修飾的RNA相比降低親和力。2' F原子通過與DBLla中的氨基酸殘基相互作用在結合 中起直接作用。當進行活細胞測定時，在添加適體之前玫瑰花結并不是人工破壞的。由于 DBLla蛋白質被結合并且空間被GAG分子占據，形成玫瑰花結可以防止標記的適體結合到 暴露于表面的DBLla上。然而，如果適體具有比GAG分子對DBLla更高的親和力，它們 也許能夠競爭結合，從而排除并破壞GAG/DBLla的相互作用，可視化為破壞玫瑰花結。測 試了三個SELEX篩選的克隆b02、dl2和e05。它們全都能破壞FCR3S1. 2的體外培養物中 的玫瑰花結。低至65nM的濃度對玫瑰花結形成率本身具有有限的作用，然而它對降低玫瑰 花結大小確實具有明顯的作用。如果將包括玫瑰花結的大小作為培養物中玫瑰花結狀態的 指標，該作用變得更加明顯。在260nM的適體濃度下，玫瑰花結形成率降低至對照的大約 35%，并且387nM的濃度足以將玫瑰花結完全破壞為單個感染的紅細胞而沒有結合的紅細 胞。未篩選的RNA在這些濃度下不具有任何作用，但增加至650-850nM時顯示了輕度作用 (5-10%破壞)。該作用的原因從未被研究過。在肝素能夠破壞FCR3S1.2的玫瑰花結的情 況下，在vogt等人的工作中，在100 u g/mL,大約為7 ii M(肝素 15kDa)，的濃度觀察到從 100%降低至20%。篩選的RNA在低于肝素濃度15倍下能夠破壞玫瑰花結。測試了克隆 e02破壞玫瑰花結的能力。該克隆在260nM處對玫瑰花結狀態具有最小的作用。關于該克 隆的有趣的事實是在50nt的隨機區域完成的MFold預測不具有二級結構，而克隆b02、dl2 和e05顯示復雜的二級結構。在該研究中測試的適體是具有大約31kDa重量的90nt。用于T7RNA轉錄和引物結合的2X20nt固定的側翼區包括在該結構中。認為這些對于結合并不 是重要的，因此該研究中分離的活性適體可以在進行進一步的工作以闡明對于結合是重要 的適體區域之后被截短至40-50nt或更小。適體的給定結構僅僅是理論上的，并且必須進 行RNA指紋識別以驗證給定RNA的二級結構。總而言之，所述結果證明DBL1特異性適體具 有定位DBL1至感染的紅細胞表面以IFA成像的潛力。更重要地，可以將適體用作新的抗玫 瑰花結藥物。下一步是在動物模型如大鼠中測試適體破壞玫瑰花結和寄生蟲隔離以觀察適 體是否在體內是活性的。由于適體作為治療藥物的領域在擴展，已獲得大量關于如何增加 體內適體穩定性和活性的知識。這極大促進在體內情形下對適體進行的任何未來工作的成 功。最后須注意實驗方法可能具有更廣大的應用領域，特別是在不需要穿過膜遞送藥物的 胞外病原體的情形。惡性瘧原蟲的培養根據標準方法用添加有10% AB+Rh+血清的緩沖培養基(補充有羥乙基哌嗪乙磺 酸、慶大霉素和碳酸氫鈉的RPMI)培養惡性瘧原蟲株FCR3S1. 2的血液期寄生蟲。在大腸桿菌中的蛋白質表達來自FCR3S1. 2的重組DBL1 a His表達如下，將來自Qiagen的含有質粒 pQE-TriSystem His-Strep 2 (DBL1 a His)或 pQE-60 (DBL1 a His)的 SG13009 (pREP4)細胞 在或22 °C或37 °C生長于含氨芐青霉素(100yg/mL)和卡那霉素(30 y g/mL)的LB培 養基中。在0D6(K1 = 0.8時用0. ImM IPTG誘導細胞3小時；收獲1升細胞懸液(4°C， 25min，3000g)，并再懸浮于 25mL 裂解緩沖液(50mM NaH2P04/Na0H pH 7. 4,300mM NaCl, ImMPMSF (Sigma) 0. 05% Triton x_100，lOmM咪唑)。在冰上用溶菌酶孵育細胞30分鐘，并 超聲處理。通過離心(4°C，30min，18. 000g)除去不溶的細胞碎片。DNA酶處理上清液，并用 lmL Ni-NTA瓊脂糖珠(Qiagen)在4°C輕輕攪拌下孵育2小時。以100 X g沉淀珠子3分鐘， 并用 15mL洗滌緩沖液(50mM NaH2P04/Na0H pH 7. 4,300mM NaCl,0. 05% Tritonx-100, 30mM 咪唑)洗滌3次。用400mM咪唑(Sigma)、50mM NaH2P04、300mM NaCl洗脫結合蛋白質，隨后 通過針對具有0. 05% Triton X-100的PBS緩沖液在4°C透析18小時除去咪唑(Sigma)、 NaH2P04、NaCl。通過將樣品在10% SDS-PAGE上電泳估計蛋白純度，最后測定蛋白質濃度 (Bradford 1976)。可選擇地，在FPLC上純化His-標記的DBL1 a。將大腸桿菌提取的可溶 級分以0. 5mL/min的流速裝載到FPLC上的Ni柱。用5_70mM咪唑梯度(60mL以lmL/min) 洗滌結合蛋白質。用400mM咪唑洗脫并如前所述分析蛋白質。所有化學制品均得自Sigma。體外篩選-SELEX用寡核苷酸B(5 ‘ -CGACTGCAGAGCTTGCTACG(N)5。GGTACCGAGCTCGAATTCCC-3，) (SEQ. ID. NO. 19)和寡核苷酸 A (5 ‘ -GCGTAATACGACTCACTATAGGGAATTCGAGCTCGGTACC-3，) (SEQ. ID. NO. 20)(標下劃線的是用于T7啟動子的序列)產生上述DNA文庫。寡核苷酸是 合成的并購買自IBA，德國。寡核苷酸B包含50個隨機核苷酸的中央序列，其側端有用于 與寡核苷酸A退火的恒定區和用于反轉錄的引物位點。雙鏈DNA文庫通過以下構建將 3 u M寡核苷酸A和寡核苷酸B退火(95°C 5min并在25°C冷卻15min)，隨后在37°C添加在 Klenow緩沖液(Fermentas)中的 Klenow 片段(Fermentas) 2 小時。通過microcon Ym_30 柱 (Millipore)純化dsDNA，并在30 y 1無RNA酶的水中洗脫。2' F修飾的文庫通過以下構 建使用在提供的轉錄緩沖液中的T7聚合酶(Epicentre)，添加DTT (Epicentre)至10mM，
14ATP、GTP、2' F-dCTP、2' F-dUTP (Epicentre)至 1. 25mM，對 40 ii g 模板進行 T7RNA 轉錄。通 過向 20 u 1 反應體積中添力口 0. 37MBq[a -32P]-ATP(Amersham Biosciences)標記 RNA。反應 在37°C下進行5小時，并用0. 2MNa0Ac,70% EtOH沉淀DNA/RNA。樣品在10% 8M尿素PAGE 上進行電泳，從膠中切下放射性RNA，并通過壓碎和用1M NaOAc (pH = 4. 7)浸泡過夜純化。 玻璃棉離心后沉淀RNA(70% EtOH和糖原0. 05% )。用30u g(lnmol)放射標記的 2' F-RNA 和最低量 60 y g(l，3nmol)的純化 DBL1 a 進行第一個篩選循環。用大約300pmol RNA和從20 y g到60 y g變化量的蛋白質進行隨 后的循環。將His標記的DBL1 a在循環1-4和7-8中結合到Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)，并 在循環5和6中結合到Ni-NTA磁性珠(Qiagen)。以RNA/蛋白質的變化比率(1 1-4)， 蛋白質和RNA的濃度為800nM至1. 2 y M。選擇該濃度范圍，因為假定以相類似方式起作用 的其它分子，如硫酸肝素在10倍更高濃度中產生相同的值。在用DBLla孵育前每個循環 進行lOOyl Ni-NTA瓊脂糖中的預篩選，以避免基質結合物的富集。在37°C輕輕攪拌下用 DBLla進行RNA孵育，起始循環中孵育60分鐘，隨后循環為孵育20分鐘。用2X500ia PBSM洗滌珠子并用7M尿素、400mM咪唑、50mMNaH2P04 (pH = 7. 4)洗脫RNA/蛋白質。用苯 酚/氯仿抽提RNA，并用NaOAc/EtOH沉淀。通過使用閃爍器測量實驗過程中所有收集級分 的放射性來測定每個循環中的RNA回收。用Nanodrop估計RNA的濃度并通過添加過量的引物 B(5 ‘ -CGACTGCAGAGCTTGCTACG-3 ‘)和提供的緩沖液中的20單位的 M-MuLV-RT (Fermentas)以及 ImM dNTP 產生 ssDNA。在 37°C反應 2 小時。通過在 37°C添加 0. 1M NaOH 部分地降解 2 ‘ F-RNA 30 分鐘。用 Ym-30microcon 柱純化 ssDNA，并用 Nanodrop 測定濃度。以1 1比例向ssDNA中添加寡核苷酸A。兩種寡核苷酸退火后，通過Klenow 補足產生全長dsDNA。通過以下條件的PCR擴增dsDNA 使用Taq DNA聚合酶(Fermentas)， 具有使用引物A (5 ‘ -GCGTAATACGACTCACTATAG-3 ‘)和引物B的最多14個循環。將PCR 產物匯集和純化，并用作下一 SELEX循環的模板。RNA適體的克隆和測序將從庫8中PCR擴增的dsDNA克隆到來自Invitrogen的T0P0載體pCR 4或pCR 2. 1，并轉化到大腸桿菌株ToplO (Invitrogen)。將細胞涂布到具有100 y g/mL氨芐青霉素 和30 u g/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚基—b-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)的LB瓊脂上。分離白 色菌落，通過使用M13反向和正向引物的菌落PCR確認插入。將陽性克隆劃線到96孔板并 送到AG0WA(德國)用M13引物測序。比對70個序列并用MEME/MAST系統基序發現檢索版 本 3. 5. 4. (//meme. sdsc. edu/meme)蹄選保守基序。單個適體的轉錄及其對DBLla His的結合從LB-amp平板中挑取單個大腸桿菌克隆，并在37 °C過夜生長于 5mLLB-amp (100 u g/mL)中。使用小量提取試劑盒(minipr印kit, Sigma)在3mL細胞 培養物中分離質粒。在lOOyl水中洗脫質粒。使用用于PCR的引物A和引物B產生 轉錄模板。在PCR擴增之前，用NotI切割載體，以避免不正確PCR產物的產生。通過 在Ym-30柱(Mi 11 ipore)上離心純化PCR產物。500ng dsDNA模板的T7轉錄在20 yl 具有 1. 25mM 2 ‘ F-dNTP(Epicentre)禾口 NTP(Fermentas)，10mM DTT(Epicentre)， 0. 37Mbq[ ( a -32P]-ATP (Amersham Bioscience)的反應液中，于 37°C反應 3 小時完成。將模板用1單位DNA酶在37°C消化15分鐘。用MICR0C0N 純化RNA。用NanoDrop測定RNA濃度。電泳遷移率變動測定將25-30ng 內部 32P_[ a -ATP]標記的 RNA 孵育于 18 u 1 具有 4-5 yl ( 300ng)新 洗脫DBL1 a His的體積內，并將3 ii g酵母RNA添加到PBSM。將沒有DBL1 a His的樣品在10 y g BSA存在下孵育，并將4-5iU 400mM咪唑洗脫緩沖液添加到BSA樣品，因此，對照與用 DBLla孵育的樣品相同。將樣品在37°C孵育10分鐘，并添加6X上樣緩沖液(Maniatis)。 將10 ill樣品加載到1mm厚度的10 % PAA凝膠，并在80V電泳30分鐘，然后在200V電泳 直到低分子量遷移染料(lower migration dye)(溴酚藍)跑出凝膠為至。將磷光成像板 (商標)曝光過夜，并在Storm磷光成像儀上分析成像板。熒光素標記適體用熒光素共轉錄地標記適體RNA。轉錄混合物在每20 ill反應中含有NTP標記混 合物(10mM ATP, 10mM CTP, lOmM GTP，6. 5mM UTP 和 3. 5mM 熒光素 _12_UTP，pH 7. 5) (Roche Applied Science)、5XT7 轉錄緩沖液、2 ii 1 T7 聚合酶(50U/iU，Fermentas)、無菌無 RNA 酶的dH20(Fluka)和200ng模板DNA。在37°C進行反應2小時。轉錄產物用DNA酶處理 (New England BioLabs Inc) ；EtOH/NaOAc 沉淀兩次，并用 MICR0C0N (MILLIP0RE)純化。活細胞分析，熒光顯微法和成像(Imagin)將惡性瘧原蟲寄生蟲(株FCR3S1. 2)培養到營養體階段(trophozoite stage) 并調整到4-5%的寄生蟲血癥。用無菌PBS洗滌寄生蟲感染的紅細胞(parasitized erythrocytes, PE)兩次，棄去上清液，并將沉淀重懸于大約200 yl無菌PBS。對于活細胞分 析，根據制造商的方案在粘著載玻片(Marienfeld Glassware)上制備單層。基于靜電粘著 而沒有其它固定步驟將負電性的細胞結合到這些載玻片，允許研究活晚期寄生蟲感染的紅 細胞。用無菌PBS洗滌細胞，添加溶解于20 ill PBS 1% BSA的500ng RNA樣品，并允許孵 育30分鐘。作為該實驗中的陰性對照，使用來自庫0的適體RNA。通過用無菌PBS洗滌除 去未結合的RNA，并添加含有DAPI(4'，6-二脒基-2-苯基吲哚)(載體)的Vectasheild Mounting培養基。所有孵育在室溫潮濕箱中進行。用尼康Optiphot 2 UV顯微鏡中的100X 油浸鏡頭分析載玻片。玫瑰花結破壞分析將用于破壞分析的RNA樣品用水和ImM MgCl2洗滌。使用燭罐技術(參見Vogt) 將惡性瘧原蟲株FCR3S1. 2培養到5%血細胞比容的4-5%的寄生蟲血癥。將細胞培養物與 RNA樣品混合到從130nM至750nM濃度的最終100 u 1體積。添加水/MgCl2或用從未篩選 庫OdsDNA的T7轉錄產生的未篩選RNA進行陰性對照。將寄生蟲在室溫輕輕攪拌下孵育1 到2. 5小時。將培養物與RPMI/吖啶橙混合，并使用顯微鏡分析玫瑰花結情況。盲法無偏 見進行計數，對于每個樣品最小計數400個寄生蟲。將玫瑰花結寄生蟲定義為具有大于2 個附著未感染紅細胞的感染紅細胞。當自動凝集時，將簇中的每個單一寄生蟲計數為玫瑰 花結寄生蟲。將玫瑰花結形成率計算為(玫瑰花結寄生蟲/(玫瑰花結寄生蟲+非玫瑰花 結寄生蟲)X 100。我們已能夠顯示這些SELEX-適體在33nM濃度的玫瑰花結破壞能力，顯示在387nM 具有100%破壞。而且，它們在血清中具有20小時的半衰期。
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適體結合到GST-DBL1 a。設計另外的實驗以證實新適體與蛋白質的相互作用是特 異性的。非標記RNA與放射性5'標記的RNA競爭結合到GST-DBLla融合蛋白。隨著30 倍摩爾過量的非標記RNA的添加，標記的RNA的回收減少40%。如果與b02、dl2、e05相比， 實驗中兩個陰性對照，未篩選的RNA (庫0)和e02產生85-90%更低的回收。將放射性標記的dl2在存在30倍摩爾過量的e02和庫0下孵育，以進一步證實觀 察的降低是特異性的。隨著來自這兩個庫的RNA的添加，沒有觀察到降低。而且，當添加45 倍摩爾過量的非標記dl2 RNA時，標記RNA顯示出從40%至60%的額外的降低。適體結合到感染的紅細胞表面。隨著篩選的適體結合到重組DBL1 a結構域，下一 步是驗證是否它們能夠關聯到感染的紅細胞表面。將這些適體中的兩種與來自庫0的未篩 選的RNA以及非結合適體e02比較。將等摩爾量的RNA用32P末端標記并用FCR3S1. 2的 5%寄生蟲血癥的培養物孵育。結果顯示篩選的RNA保持比來自未篩選庫的RNA或非結合 適體e02高4倍。本發明的治療性或藥理組合物將通常包括溶解或分散于藥學可接受介質的有效 量的治療活性組分。藥學可接受介質或載體包括任何溶劑、分散介質、包衣、抗細菌劑和抗 真菌劑、等滲和吸收延遲劑及類似物。用于藥物活性物質的此類介質和試劑的使用在本領 域是熟知的。本發明的治療組合物還可以摻入輔助活性成分。根據本公開，本領域的技術人員了解藥物或藥理組合物的制備。通常地，該組合 物可制備為注射劑，作為液體溶液或懸浮液；適于在注射前溶解或懸浮于液體的固體形式； 作為片劑或其它用于口服的固體；作為定時釋放膠囊(time release capsule)；或任何其 它當前使用的形式，包括滴劑、乳劑、洗劑、膏劑、吸入劑及類似物。外科醫生、內科醫師或護 理工作者使用無菌制劑(例如基于鹽水的洗劑)以處理手術區中特定區域也可特別有用。 組合物也可經由微裝置、微顆粒或海綿遞送。配制后，治療劑以與劑量制劑相容的方式，并以藥理學有效的量施用。制劑容易以 各種劑型，如上述可注射溶液的類型施用，但也可采用藥物釋放膠囊及類似物。本文中，待施用的活性成分的量和組合物的體積取決于待治療的宿主動物。需要 施用的活性物質的準確量取決于醫生的判斷并因各個體而異。通常地使用分散活性化合物所需的組合物的最小體積。用于施用的適合方案也是 可變化的，但典型為起始施用化合物并監視結果，然后以進一步的間隔給予進一步控制的劑量。例如，對于以片劑或膠囊(如，明膠膠囊)形式的口服施用，活性藥物組分可以與 口服非毒性藥學可接受惰性載體如乙醇、甘油、水及類似物組合。而且，當需要或必要時，也 可將適當的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑摻入混合物。適當粘合劑包括淀粉、硅酸鎂鋁、 淀粉糊、明膠、甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮，天然糖類，如葡萄糖或 3 “乳糖；玉米甜味劑；天然和合成膠如阿拉伯膠、黃芪膠或海藻酸鈉、聚乙二醇、蠟及類似 物。這些劑型中使用的潤滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉、 二氧化硅、滑石、硬脂酸、其鎂或鈣鹽和/或聚乙二醇及類似物。崩解劑包括，但不限于，淀 粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠淀粉、瓊脂、海藻酸或其鈉鹽、或泡騰混合物、及類似 物。稀釋劑包括如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纖維素和/或甘氨酸。本發明的化合物還可以諸如定時釋放和持續釋放的片劑或膠囊、藥丸、粉末、顆粒、酏劑、酊劑、懸浮液、糖漿和乳狀液的口服劑型施用。可注射組合物優選為含水的等滲溶液或懸浮液，從脂肪性乳狀液或懸浮液有利地 制備栓劑。組合物可以是無菌的和/或包含佐劑，如防腐劑、穩定劑、潤濕劑或乳化劑，溶解 促進劑，用于調節滲透壓的鹽和/或緩沖劑。另外，它們還可包含其它治療有用物質。分別 根據常規混合、造粒或包衣法制備組合物，通常地包含約0. 至75%，優選約至50% 的活性成分。液體特別是可注射組合物例如可以通過溶解、分散等制備。將活性化合物溶解于 或與藥學純溶劑，如水、鹽水、右旋糖水溶液(aqueous dextrose)、甘油、乙醇及類似物混 合，由此形成可注射溶液或懸浮液。另外，可配制在注射前適于溶解于液體的固體形式。
本發明的化合物可以以靜脈內(推注和輸注)、腹膜內、皮下或肌內形式施用，全 部使用對藥學領域的普通技術人員是熟知的形式。注射劑可以以常規形式制備，作為液體 溶液或懸浮液。而且，本發明優選的化合物可以以鼻內形式經由局部使用適當鼻內載體、吸入劑、 或經由經皮路徑使用本領域普通技術人員熟知的經皮皮膚貼劑的那些形式施用。以經皮 遞送系統形式施用，在整個劑量方案中劑量施用當然是連續性，而不是間歇性的。其它優 選局部制劑包括乳劑、軟膏劑、洗劑、氣溶膠噴霧和凝膠，其中活性成分的濃度通常地在從 0.01%至15% (w/w或w/v)的范圍內。對于固體組合物，可以使用賦形劑，包括藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、 糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂及類似物。以上定義的活性化合物也可配制為 栓劑，使用例如聚亞烴基二醇(polyalkylene glycol)，如丙二醇作為載體。在一些實施方 案中，從脂肪性乳狀液或懸浮液有利地制備栓劑。本發明的化合物還可以以脂質體遞送系統，如小單層囊泡(vesicle)、大單層囊泡 和多層囊泡的形式施用。可由包含膽固醇、硬脂酰胺或磷脂酰膽堿的各種磷脂形成脂質體， 在一些實施方案中，如美國專利第5，262，564號所述，脂質組分的薄層與藥物的水溶液水 合成封裝有藥物的脂質層。例如，此處所述的適體分子可以提供為與利用本領域已知的方 法構造的親脂性化合物或非免疫原性高分子量化合物的復合物。核酸相關復合物的實例提 供于美國專利第6，011，020號。本發明的化合物還可與作為可靶向藥物載體的可溶性聚合物偶聯。該聚合物可 以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥丙基_甲基丙烯酰胺_苯酚、聚羥乙基天冬酰胺 苯酚或用十六酰基殘基取代的聚氧化乙烯聚賴氨酸(polyethyleneoxicbpolylysine)。而 且，本發明的化合物可偶聯到一類用于實現藥物的控制釋放的可生物降解的聚合物，如聚 乳酸、聚e己內酯、聚羥丁酸、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚縮醛、聚二氫吡喃、聚氰基 丙烯酸酯和水凝膠的交聯或兩性嵌段共聚物。本發明的化合物還可通過到組織的全身血液和體液而遞送到組織，所以通過腸胃 外全身注射、通過靜脈內、肌內或皮下遞送路徑施用。本發明的藥物組合物通過注射施用可 用作對全身施用治療瘧疾和/或有這種表現的全身性疾病治療劑的補充。本發明的化合物也可以儲庫或持續釋放凝膠或聚合物制劑通過下列施用至組織 手術移植可生物降解的微小尺寸聚合物系統(如微裝置、微顆粒或海綿，或者其它緩釋經 鞏膜裝置)，在疾病治療過程中移植；或通過遞送裝置，如聚合物持續遞送裝置。本發明的化合物也可局部施用到組織，如以注入本發明的化合物的滴劑，或通過使用電流驅動藥物 從表面到組織的離子電滲療法。如果需要，待施用的藥學組合物也可包含少量非毒性輔助物質，如潤濕或乳化劑， PH緩沖劑和其它物質例如，乙酸鈉和油酸三乙醇胺。使用適體的劑量方案根據多種因素來選擇，所述因素包括患者的類型、物種、年 齡、重量、性別和醫學病況；待治療病況的嚴重度；施用途徑；患者的腎和肝功能；和采用的 特定適體或其鹽。普通熟練醫師可以容易地決定和開出防止、阻礙或阻止病況進展所需的 藥物有效量。當為指定效果使用時，本發明適體組合物的口服劑量范圍為每天口服約0.05到 7500mg。優選以帶刻痕片劑的形式提供組合物，該帶刻痕片劑包含0. 5,1. 0,2. 5,5. 0,10. 0、 15. 0,25. 0,50. 0,100. 0,250. 0,500. 0和1000. Omg的活性成分。本發明的化合物可以單一
日劑量施用，或以每天二、三或四次分劑量施用總的日劑量。本發明適體組合物的輸注劑量、鼻內劑量和經皮劑量范圍為每天0. 05到7500mg。 本發明適體組合物的皮下、靜脈內和會陰內劑量范圍為每天0. 05到3800mg。本發明適體組合物的腦內劑量在0. 001到10mg之間，例如通過從一周一次到每三 個月一次的注射或通過持續釋放裝置或制劑施用。本發明適體化合物的有效血漿水平在0. 002mg/mL到50mg/mL的范圍內。本發明 適體化合物的有效腦內水平可以在從20nM到250 u M的范圍內。對于適體SEQ. ID. NO 6到 9及相應的氟化適體SEQ. ID. NO 10到12來說，33nM的濃度對于提供破壞能力是足夠的，而 380nM將提供100 %的破壞。


圖1.在大腸桿菌中表達的His-標記的DBL1 a的Ni_NTA瓊脂糖純化。用100 y M IPTG在0D6QQ =1.2時誘導細胞，并生長三個小時。在10mM咪唑和0. 1 % TritonX-100中 用超聲處理裂解細胞。用20mM到90mM咪唑洗滌Ni_NTA瓊脂糖珠，在具有400mM咪唑的磷 酸鹽緩沖液中洗脫結合蛋白質。圖2.使用具有在UTP和CTP上的2' _F取代的序列的隨機RNA文庫在結合到 Ni-NTA瓊脂糖或者Ni-NTA磁性珠的純化DBLla上的體外篩選。在包含ImM MgCl2、具有大 約1 ii M比率為2 1的蛋白質和RNA的PBS緩沖液中，在37°C和孵育30分鐘，進行篩選。 用苯酚-氯仿抽提結合的RNA，并通過反轉錄和Klenow補全反應轉變為dsDNA，隨后PCR擴
+飽
+曰o圖3.放射性標記RNA在大腸桿菌純化的DBL1 a His上的結合。在提供有600 u g 酵母 RNA 的 800 u 1 PBSM 中，在 37 °C 攪拌下將 40nM 32P-標記的 2 ‘ F-RNA 與 350_400nM DBLlaHis孵育45分鐘。用2XlmL PBS洗滌珠子，用500mM咪唑洗脫結合的RNA/DBL1 a His。 收集所有級分，并通過閃爍計數估計RNA回收。圖4.在DBL1 a His存在下孵育的篩選的克隆的遷移率變動測定。將25-30ng內部 32P-[ a ATP]標記的RNA用 300ng DBL1 a His孵育10分鐘，在10% TBE-緩沖的PAA凝膠 (+)上電泳。在陰性對照(“)中將25-30ng內部32P-[aATP]用10 y g BSA孵育并加載到 凝膠上。
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圖5.篩選的克隆e05的遷移率變動測定。將 30ng內部32P_[ a ATP]標記的RNA 用 300-400ng DBL1 a His孵育10分鐘，并與在存在10 y g BSA下孵育的陰性對照㈠一 起上樣到10% TBE緩沖的PAA凝膠⑴。圖6.在熒光顯微術中活細胞檢測的分析。(a)熒光素標記的來自庫8的RNA締合 到DAPI染色的寄生蟲感染的紅細胞。相同的熒光素標記的RNA與未感染寄生蟲的紅細胞 (顯示為黑色小塊)結合并不明顯。(b)從前面的圖中剪出圖(cut out)。(c)雖然熒光素 標記的來自庫0的RNA在一定程度上締合到DAPI染色的寄生蟲感染的紅細胞，但不如寄生 蟲和庫8RNA之間的締合那樣顯著。圖7與未篩選的庫0RNA相比，克隆e05和b02的玫瑰花結破壞作用的初步圖。在 最終圖中顯示在x軸上的適體濃度為1或2-4-8-12 u g/mL和包括e02作為沒有明顯作用 的適體。圖8.顯示了對照的狀態和破壞的玫瑰花結的狀態。FCR3S1.2的玫瑰花結破壞。 用吖啶橙染色的細胞的熒光顯微檢查，使用40X或20X的放大率。圖像(a)和(c)是用 在98 ill細胞中與2 u 1水孵育一小時的對照細胞。(b)和(d)是用來自SELEX克隆dl2的 2u l(800ng)2' F-RNA處理的細胞。在圖像(c)中，巨大的玫瑰花結圈于圓內。
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權利要求
一種適體或其活性片段，其針對惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白1PfEMP1的半保守的duffy結合配體結構域1αDBL1α區域而產生。
2.根據權利要求1所述的適體，其中所述適體選自由以下組成的組 ugccaaccuucgaugcaagauaauacuuuugauggugua⑶cguauu⑶u(seq. id. no. 1) ucau⑶gcca⑶⑶uugaaaaaacgcguugauugcuggugug⑶gagcua⑶(seq. id. no. 2)， cuucgaacggcccugguu⑶ug⑶uuuaauucauuuauccgc⑶gguacg⑶(seq. id. no. 3)， uagcucaccacaccagcaaucaacgcguuuuuucaaacacuggcacauga(seq. id. no. 4) aacaauacgacuacaccaucaaaaguauuaucuugcaucgaagguuggca(seq. id. no. 5)，禾口 gugaccacgcggauaaaugaaucaaaaacaacaaccagggccguucgacuacgcuaauuaucccg(seq.id. no. 6)或其活性片段。
3.根據權利要求1或2所述的適體，其中所述適體選自由以下組成的氟化適體seq. id. no. 1至6組成的組ufgcfcfaacfcfufufcfgaufgcfaagaufaaufacfufufufufgaufggufgufagufcfgufaufufgufuf(seq.id. no. 7)，ufcfaufgufgcfcfagufgufufufgaaaaaacfgcfgufufgaufufgcfufggufgufggufgagcfufaguf(seq.id. no. 8)cfufufcfgaacfggcfcfcfufggufufgufufggufufufufaaufufcfaufufufaufcfcfgcfgufggufcfacfgguf(seq. id. no. 9)，ufAGCfufcfacfcfacfacfcfagcfaaufcfaacfgcfgufufufufufufcfaaacfacfufggcfacfaufga(seq. id. no. 10)aacfaaufacfgacfufacfacfcfaufcfaaaagufaufufaufcfufufgcfaufcfgaaggufufggcfa(seq.id. no. 11)gufgacfcfacfgcfggaufaaaufgaaufcfaaaaacfaacfaacfcfagggcfcfgufufcfgacfufacfgcfufaaufufaufcfcfcfg (seq. id. no. 12) 或其活性片段。
4.根據權利要求2或3所述的適體，其中所述適體由序列seq.id. no. 4,seq. id. no. 5、 se q. id. no. 6、seq. id. no. 10、seq. id. no. 11 或 seq. id. no. 12 的任一個組成。
5.根據權利要求1所述的適體，其中所述適體由序列gacugauuacgccagcuugg(seq. id. no. 23)或 gacfufgaufufacfgcfcfagcfufufgg(seq. id. no. 24)的任一個組成。
6.一種或多種適體或其活性片段在治療腦型瘧中的用途，其中所述適體或其活性片段 針對惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白1 (PfEMPl)的半保守duffy結合配體結構域1 a DBL1 a區域 產生。
7.根據權利要求6所述的用途，其中所述適體選自由以下組成的組 ugccaaccuucgaugcaagauaauacuuuugauggugua⑶cguauu⑶u(seq. id. no. 1) ucau⑶gcca⑶⑶uugaaaaaacgcguugauugcuggugug⑶gagcua⑶(seq. id. no. 2)， cuucgaacggcccugguu⑶ug⑶uuuaauucauuuauccgcgug⑶cacg⑶(seq. id. no. 3) uagcucaccacaccagcaaucaacgcguuuuuucaaacacuggcacauga(seq. id. no. 4) aacaauacgacuacaccaucaaaaguauuaucuugcaucgaagguuggca(seq. id. no. 5)，禾口2gugaccacgcggauaaaugaaucaaaaacaacaaccagggccguucgacuacgcuaauuaucccg(seq. id. no. 6)。
8.根據權利要求6或7所述的用途，其中所述適體選自由以下組成的氟化適體組成的組ufgcfcfaacfcfufufcfgaufgcfaagaufaaufacfufufufufgaufggufgufagufcfgufaufufgufuf(seq. id. no. 7)，ufcfaufgufgcfcfagufgufufufgaaaaaacfgcfgufufgaufufgcfufggufgufggufgagcfufaguf(seq.id. no. 8)，cfUfufcfgaacfggcfcfcfufggufufgufufggufufufufaaufufcfaufufufaufcfcfgcfgufggufcfacfgguf( seq. id. no. 9)ufAGCfufcfacfcfacfacfcfagcfaaufcfaacfgcfgufufufufufufcfaaacfacfufggcfacfaufga(seq. id. no. 10)aacfaaufacfgacfufacfacfcfaufcfaaaagufaufufaufcfufufgcfaufcfgaaggufufggcfa(seq.id. no. 11)gufgacfcfacfgcfggaufaaaufgaaufcfaaaaacfaacfaacfcfagggcfcfgufufcfgacfufacfgcfufaaufufaufcfcfcfg (seq. id. no. 12)。
9.根據權利要求6所述的用途，其中所述適體由序列gacugauuacgccagcuugg(seq. id. no. 23)或 gacfufgaufufacfgcfcfagcfufufgg(seq. id. no. 24)的任一個組成。
10.一種用于確定存在嚴重瘧疾的診斷，該診斷是通過確定血液樣品對針對惡性瘧原 蟲紅細胞膜蛋白lPfEMPl的半保守duffy結合配體結構域1 a，DBL1 a區域產生的適體的 反應。
11.一種用于預防性地和/或治療性地治療嚴重瘧疾的方法，該方法是通過施用 治療活性量的針對惡性瘧原蟲紅細胞膜蛋白lPfEMPl的半保守duffy配體結合結構域 1 a DBL1 a區域產生的適體。
全文摘要
本發明涉及針對惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)紅細胞膜蛋白1(PfEMP1)的半保守duffy結合配體結構域1α(DBL1α)區域產生的適體或其活性片段，所述適體具有抗瘧疾、特別是嚴重腦型瘧的作用。
文檔編號C12N15/115GK101981188SQ200980111646
公開日2011年2月23日 申請日期2009年2月5日 優先權日2008年2月5日
發明者約翰·林德, 蒂娜·佩爾松 申請人:南方佛斯卡專利公司