一種灰樹花多糖的提純方法
【專利摘要】本發明涉及一種灰樹花多糖的提純方法，將灰樹花粉碎，去離子水作為溶劑，微波提取；采用HD-8陽離子交換樹脂脫蛋白純化，多糖提取液稀釋或濃縮上樣，控制一定流速，收集流出液，即得純度較高的生物活性物質灰樹花多糖提純液。本方法工藝流程短，操作簡便，效率高，能耗少，避免了大量有機試劑的消耗，分離純化過程可連續化，且樹脂可回收再利用，安全環保，制備工藝流程成本低，有利于降低產品價格，很適合大規模工業化生產。
【專利說明】一種灰樹花多糖的提純方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種從食用菌中提純生物活性物質的方法，特別涉及一種利用微波提取一HD-8陽離子交換樹脂純化集成工藝提純灰樹花多糖的方法。

【背景技術】
[0002]灰樹花又名栗子蘑、蓮花菌、千佛菌等，是一種珍貴的藥食兼用真菌，口味鮮美，富含多種生物活性物質、礦物質與維生素等。其主要生物活性物質灰樹花多糖是近年來研宄的熱點。
[0003]眾多藥理與臨床試驗證實，灰樹花多糖具有抗腫瘤，降血壓，調節血糖、血脂水平，抗HIV病毒，增強免疫系統功能的作用，尤其是抗腫瘤活性，日本醫學專家實驗發現灰樹花多糖腫瘤抑制率可達86.2%，比國際公認的抗癌新藥香菇多糖抑制率高32%。對癌細胞生成和轉移防治、高血壓、糖尿病、艾滋病及免疫系統功能紊亂均有一定的療效，且無毒副作用。因此，灰樹花多糖的制備工藝備受關注，具有良好的開發前景。
[0004]目前，國內外灰樹花多糖提取物產品還很少見，文獻中更多是用水提醇沉工藝法提取和脫蛋白及色素等雜質，或者是用傳統的提取方法如熱水提取法、酸提法、堿提法等聯合一般的脫蛋白純化方法如醇沉法、Sevage法，三氯乙酸法等提純多糖，存在操作時間長、有機試劑用量大、效率低、效果差等缺點，多糖的得率和純度都受到很大的限制，不利于工業化生產制備多糖產品。
[0005]因此，研宄灰樹花多糖提純方法，開發操作便捷，高效，低成本的灰樹花多糖的制備工藝，對于降低產品價格，增加產品附加值具有重大的經濟效益，并滿足市場需求，為社會增益。


【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種操作便捷、成本低即經濟高效的提純藥食兩用真菌灰樹花多糖的方法，以滿足工業化生產需要。該發明提純工藝亦可應用于其他食用菌。具體技術方案如下:
[0007]一種灰樹花多糖的提純方法，其特征在于，包括如下步驟:
[0008](1)將灰樹花粉碎，選用粒徑為20目的灰樹花，在pH為6的去離子水中進行微波提取，得到灰樹花多糖提取液；
[0009](2)將樹脂用去離子水反復浸洗，然后用NaOH溶液浸泡18?24h，再用鹽酸溶液浸泡18?24h，最后用去離子水浸洗，待用；
[0010](3)將步驟⑵處理過的樹脂進行濕法裝柱，形成樹脂床層后，靜置過夜備用；使用前用去離子水過柱，將樹脂柱活化；
[0011](4)將步驟(1)得到的灰樹花多糖提取液取適量裝入步驟(3)的活化樹脂柱，收集流出液，即為脫蛋白純化后灰樹花多糖提純液。
[0012]步驟(1)中微波提取的裝置的輸出功率為500?650W，頻率為2450MHz，輻射過程中鼓泡攪拌；液固比為20?40mL/lg，提取時間為60s?270s。
[0013]微波提取一段時間，提取液冷卻至室溫后，需要進行稱重補水，再抽濾。
[0014]預處理的樹脂是氨基酸分離專用樹脂HD-8陽離子交換樹脂。
[0015]步驟⑵中將樹脂用去離子水反復浸洗的方法如下:浸洗時每隔5?10分鐘換一次水，并不時攪動，換水4?5次后，再每隔15?20分鐘換水一次，浸洗至浸洗水不褐色為止。
[0016]步驟(2)中所述NaOH溶液的濃度是0.5?lmol/L，其溶液體積是樹脂體積的3?5倍，浸泡樹脂的前兩個小時內不斷攪動，用水沖洗，直至浸泡水pH值為6?7。
[0017]步驟(2)中所述鹽酸溶液的濃度是0.5?lmol/L，其溶液體積是樹脂體積的3?5倍，將樹脂轉成H+型，鹽酸浸泡后，用去離子水浸洗，至pH值為6以上時，即可進行裝柱。
[0018]稱取20g預處理過的HD-8陽離子交換樹脂濕法上柱，將去離子水注入層析柱內(1.5X 50cm)，趕走空氣；再將經過步驟(2)處理的HD-8陽離子交換樹脂加入去離子水混合至適宜稠度，灌注入層析柱內，使其自由沉降；沉降結束形成樹脂床層后，靜置過夜備用。
[0019]步驟(4)中將80?100mL去離子水以0.5?2.5mL/min的流速流過樹脂柱，重復操作3遍，即可上樣。
[0020]步驟⑷中所述灰樹花多糖提取液中蛋白質的濃度為0.15?0.5mg/mL。
[0021]所述的灰樹花多糖溶液的上樣量為200?500mL，上樣濃度:蛋白質濃度為0.15?05mg/mL，采用苯酚硫酸法檢測多糖濃度，用考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白含量。
[0022]本發明的方法，與其他工藝相比，具有如下優點:
[0023](1)避免使用有機溶劑，液固比30mL/g，微波提取，提取率高達22.75%,與酶法提取率相當，但微波提取更節省時間(只有210s)，不使用酶制劑，減少雜質的帶入，比傳統熱水浸提法的得率提高了 50%多，具有省時高效，減少耗能，提升產率等優點。
[0024](2)HD-8陽離子交換樹脂為氨基酸分離專用樹脂，純化效果與常規的Sevage法(脫蛋白率為37.95%，多糖含量為78.32% )相比，灰樹花多糖的保留率和脫蛋白率均高達90%以上，純度近60%，且可回收再利用，安全環保，并適用于連續化操作，處理量大。
[0025](3)微波提取一HD-8陽離子交換樹脂純化集成工藝對提純灰樹花多糖具有操作便捷，高效，成本低，產品質量好等優勢，工藝簡短有利于工業化生產，并且該工藝可應用于其他食用菌多糖的提純與制備，具有較高的實用價值，開發意義大。

【具體實施方式】
[0026]實施例1
[0027]從灰樹花中提取純化多糖:
[0028](1)將干燥的灰樹花粉碎過篩，精確稱取粒徑為20目的藥材3g，置于250mL三口燒瓶中，加入90mL的去離子水，稱重，微波提取210s，冷卻至室溫，再稱重補水，抽濾，即得到灰樹花多糖提取液。
[0029](2)稱取200g HD-8樹脂，用去離子水反復浸洗5次，期間不時攪動每隔15分鐘換一次水，再隔30分鐘換一次水，浸洗2次。然后用400mL，lmol/L NaOH浸泡24h，用去離子水浸洗7遍，再用400mL，lmol/L的鹽酸浸泡24h，用去離子水浸洗8次。
[0030](3)稱取20g經過預處理的樹脂進行濕法裝柱，將大約40mL去離子水注入層析柱內(1.5X50cm)，趕走空氣；再將經過預處理的HD-8陽離子交換樹脂加入少量去離子水混合至適宜稠度，灌注入層析柱內，使其自由沉降；沉降結束形成樹脂床層后，靜止過夜備用。
[0031](4)將80mL去離子水以lmL/min的流速流過樹脂柱，操作3遍。
[0032](5)將400mL，蛋白質含量為0.33mg/mL微波提取的灰樹花子實體多糖溶液以lmL/min流速通過HD-8陽離子交換樹脂柱，收集流出液，測定流出液中多糖和蛋白質含量。
[0033]灰樹花多糖微波提取得率為22.61%, HD-8陽離子交換樹脂純化后，多糖保留率為95.94%，脫蛋白率為92.02%，純度為58.7%，并通過抗氧化活性測試，所得灰樹花多糖液抗氧化生物活性功能良好。
[0034]實施例2
[0035]從灰樹花中提取純化多糖:
[0036](1)將干燥的灰樹花粉碎過篩，精確稱取粒徑為20目的藥材3g，置于250mL三口燒瓶中，加入90mL的去離子水，稱重，微波提取180s，冷卻至室溫，再稱重補水，抽濾，即得到灰樹花多糖提取液。
[0037](2)稱取200g HD-8樹脂，用去離子水反復浸洗5次，期間不時攪動每隔15分鐘換一次水，再隔30分鐘換一次水，浸洗2次。然后用400mL，lmol/L NaOH浸泡24h，用去離子水浸洗7遍，再用400mL，lmol/L的鹽酸浸泡24h，用去離子水浸洗8次。
[0038](3)稱取20g經過預處理的樹脂進行濕法裝柱，將大約40mL去離子水注入層析柱內(1.5X50cm)，趕走空氣；再將經過預處理的HD-8陽離子交換樹脂加入少量去離子水混合至適宜稠度，灌注入層析柱內，使其自由沉降；沉降結束形成樹脂床層后，靜止過夜備用。
[0039](4)將80mL去離子水以lmL/min的流速流過樹脂柱，操作3遍。
[0040](5)將400mL，蛋白質含量為0.309mg/mL微波提取的灰樹花子實體多糖溶液以lmL/min流速通過HD-8陽離子交換樹脂柱，收集流出液，測定流出液中多糖和蛋白質含量。
[0041]灰樹花多糖微波提取得率為21.95%, HD-8陽離子交換樹脂純化后，多糖保留率為93.94%，脫蛋白率為94.08%，純度為56.01 %，并通過抗氧化活性測試，所得灰樹花多糖液抗氧化生物活性功能良好。
[0042]實施例3
[0043]從灰樹花中提取純化多糖:
[0044](1)將干燥的灰樹花粉碎過篩，精確稱取粒徑為20目的藥材3g，置于250mL三口燒瓶中，加入90mL的去離子水，稱重，微波提取210s，冷卻至室溫，再稱重補水，抽濾，即得到灰樹花多糖提取液。
[0045](2)稱取200g HD-8樹脂，用去離子水反復浸洗5次，期間不時攪動每隔15分鐘換一次水，再隔30分鐘換一次水，浸洗2次。然后用400mL，lmol/L NaOH浸泡24h，用去離子水浸洗7遍，再用400mL，lmol/L的鹽酸浸泡24h，用去離子水浸洗8次。
[0046](3)稱取20g經過預處理的樹脂進行濕法裝柱，將大約40mL去離子水注入層析柱內(1.5X50cm)，趕走空氣；再將經過預處理的HD-8陽離子交換樹脂加入少量去離子水混合至適宜稠度，灌注入層析柱內，使其自由沉降；沉降結束形成樹脂床層后，靜止過夜備用。
[0047](4)將80mL去離子水以lmL/min的流速流過樹脂柱，操作3遍。
[0048](5)將300mL，蛋白質含量為0.248mg/mL微波提取的灰樹花子實體多糖溶液以lmL/min流速通過HD-8陽離子交換樹脂柱，收集流出液，測定流出液中多糖和蛋白質含量。
[0049]灰樹花多糖微波提取得率為22.57%, HD_8陽離子交換樹脂純化后，多糖保留率為90.08%，脫蛋白率為95.56%，純度為54.13 %，并通過抗氧化活性測試，所得灰樹花多糖液抗氧化生物活性功能良好。
[0050]實施例4
[0051]從灰樹花中提取純化多糖:
[0052](1)將干燥的灰樹花粉碎過篩，精確稱取粒徑為20目的藥材3g，置于250mL三口燒瓶中，加入90mL的去離子水，稱重，微波提取210s，冷卻至室溫，再稱重補水，抽濾，即得到灰樹花多糖提取液。
[0053](2)稱取200g HD-8樹脂，用去離子水反復浸洗5次，期間不時攪動每隔15分鐘換一次水，再隔30分鐘換一次水，浸洗2次。然后用400mL，lmol/L NaOH浸泡24h，用去離子水浸洗7遍，再用400mL，lmol/L的鹽酸浸泡24h，用去離子水浸洗8次。
[0054](3)稱取20g經過預處理的樹脂進行濕法裝柱，將大約40mL去離子水注入層析柱內(1.5X50cm)，趕走空氣；再將經過預處理的HD-8陽離子交換樹脂加入少量去離子水混合至適宜稠度，灌注入層析柱內，使其自由沉降；沉降結束形成樹脂床層后，靜止過夜備用。
[0055](4)將80mL去離子水以lmL/min的流速流過樹脂柱，操作3遍。
[0056](5)將500mL，蛋白質含量為0.149mg/mL微波提取的灰樹花子實體多糖溶液以lmL/min流速通過HD-8陽離子交換樹脂柱，收集流出液，測定流出液中多糖和蛋白質含量。
[0057]灰樹花多糖微波提取得率為22.68%, HD_8陽離子交換樹脂純化后，多糖保留率為94.03%，脫蛋白率為94.56%，純度為55.02 %，并通過抗氧化活性測試，所得灰樹花多糖液抗氧化生物活性功能良好。
【權利要求】
1.一種灰樹花多糖的提純方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)將灰樹花粉碎，選用粒徑為20目的灰樹花，在pH為6的去離子水中進行微波提取，得到灰樹花多糖提取液； (2)將樹脂用去離子水反復浸洗，然后用NaOH溶液浸泡18?24h，再用鹽酸溶液浸泡18?24h，最后用去離子水浸洗，待用； (3)將步驟(2)處理過的樹脂進行濕法裝柱，形成樹脂床層后，靜置過夜備用；使用前用去離子水過柱，將樹脂柱活化； (4)將步驟(I)得到的灰樹花多糖提取液取適量裝入步驟(3)的活化樹脂柱，收集流出液，即為脫蛋白純化后灰樹花多糖提純液。
2.根據權利要求1所述的提純方法，其特征在于，步驟(I)中微波提取的裝置的輸出功率為500?650W，頻率為2450MHz，輻射過程中鼓泡攪拌；液固比為20?40mL/lg，提取時間為60?270s。
3.根據權利要求1所述的提純方法，其特征在于，步驟(2)所述樹脂是氨基酸分離專用樹脂HD-8陽離子交換樹脂。
4.根據權利要求1或3所述的提純方法，其特征在于，步驟(2)中將樹脂用去離子水反復浸洗的方法如下:浸洗時每隔5?10分鐘換一次水，并不時攪動，換水4?5次后，再每隔15?20分鐘換水一次，浸洗至浸洗水不褐色為止。
5.根據權利要求1所述的提純方法，其特征在于，步驟(2)中所述NaOH溶液的濃度是0.5?lmol/L，其溶液體積是樹脂體積的3?5倍，浸泡樹脂的前兩個小時內不斷攪動，用水沖洗，直至浸泡水pH值為6?7。
6.根據權利要求1所述的提純方法，其特征在于，步驟(2)中所述鹽酸溶液的濃度是0.5?lmol/L，其溶液體積是樹脂體積的3?5倍，將樹脂轉成H+型，鹽酸浸泡后，用去離子水浸洗，至PH值為6以上時，即可進行裝柱。
7.根據權利要求3所述的提純方法，其特征在于，稱取20g預處理過的HD-8陽離子交換樹脂濕法上柱，將去離子水注入層析柱內，趕走空氣；再將經過步驟(2)處理的HD-8陽離子交換樹脂加入去離子水混合至適宜稠度，灌注入層析柱內，使其自由沉降；沉降結束形成樹脂床層后，靜置過夜備用。
8.根據權利要求1所述的提純方法，其特征在于，步驟⑷中將80?10mL去離子水以0.5?2.5mL/min的流速流過樹脂柱，重復操作3遍，即可上樣。
9.根據權利要求1所述的提純方法，其特征在于，步驟(4)中所述灰樹花多糖提取液中蛋白質的濃度為0.15?0.5mg/mL。
【文檔編號】C08B37/00GK104497161SQ201510003250
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2015年1月4日 優先權日:2015年1月4日
【發明者】韓偉, 滿寧, 羅文鋒, 韓樂, 馬迪, 豆欣欣, 汪佳丹 申請人:華東理工大學