專利名稱：川牛膝果聚糖、制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及從中藥川牛膝中提取川牛膝果聚糖及其總多糖、制備方法及用途。
本發明提供了從中藥材川牛膝中提取獲得的果聚糖，其化學結構如下 本發明還提供了所述的川牛膝果聚糖的總多糖，其是由如下方法制備將干燥后的中藥材川牛膝用水浸泡，用或不用有機溶劑沉淀，沉淀用水溶解，上清液經透析或膜分離后，濃縮干燥獲得總多糖。推薦的川牛膝果聚糖的總多糖中含有60～99％的川牛膝果聚糖CoPS，尤其推薦的川牛膝果聚糖的總多糖中含有95％的川牛膝果聚糖CoPS。
本發明的制備方法是將川牛膝切片用冷水浸泡或熱水煮，采用有機溶劑沉淀，透析或膜分離，濃縮干燥獲得總多糖。總多糖經離子交換柱和凝膠柱層析得到川牛膝果聚糖純品CoPS。
該果聚糖經完全酸水解，HPLC分析得知由果糖和葡萄糖組成。由ESI-MS及HPLC測得其分子量分布為1000～10000Da。其紅外圖譜的數據如下3700～3000cm-1的強寬峰為分子間及分子內羥基吸收，2950～2870cm-1為C-H鍵伸縮振動，1400～1200cm-1為C-H的變角振動，1000～1200cm-1為糖環上C-O-C醚鍵不對稱伸縮振動，929cm-1為呋喃環的對稱伸縮振動，815cm-1為呋喃環的C-H變角振動。
其核磁共振譜圖數據如下δ(ppm)1H-NMR5.307為α-Glc(1→。13C-NMR果糖呋喃環上的化學位移數據δ62.6～63.9、105.8～106.8、78.9～79.8、76.8～77.9或82.9～83.7、64.9～66.0ppm，葡萄糖吡喃環上的碳的化學位移數據δ95.1、73.8、75.0、71.8、73.7、62.6ppm。(其誤差為±0.5ppm)本發明的制備方法包括將川牛膝藥材用水浸泡，采用有機溶劑沉淀，透析或膜分離，濃縮干燥獲得川牛膝總多糖。川牛膝總多糖經離子交換柱和凝膠柱層析純化可得川牛膝果聚糖純品CoPS。
具體來說，將干燥后的川牛膝藥材粉碎或切片，用水浸泡，其中川牛膝藥材與水浸泡的重量比推薦是川牛膝∶水＝1∶8～15，尤其推薦用10～12倍重量或更多的水，浸泡36～48小時。所述水推薦為無離子水。浸泡液的pH值推薦保持在6.0～8.0。
過濾，濾液經或不經濃縮，用有機溶劑沉淀后離心。離心所得沉淀用水溶解，推薦用1-5倍重量的水溶解。
離心，上清液透析或膜分離，透析時間推薦為24-72小時，透析用透析膜、透析袋，其孔徑推薦截留分子量在1000以下，尤其推薦截留分子量為500～1000。
濃縮干燥獲得總多糖，其中干燥或減壓濃縮溫度推薦低于60℃進行，最好采用低溫真空濃縮或冷凍干燥，例如在30～60℃干燥或濃縮，壓強推薦控制在0.08～0.10MPa。
所述川牛膝總多糖加水溶解，其中推薦1～5倍重量的水溶解。經CM-Sephadex C-50柱層析，純度可達到95％。再經凝膠柱層析作進一步純化，用水或稀鹽溶液洗脫，收集糖峰，冷凍干燥獲得川牛膝果聚糖純品CoPS，純度可達99％。凝膠柱層析所采用的凝膠為Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose型、Bio-Gel P型或Superdex，選用的分離范圍為1×102-5.0×104道爾頓。推薦凝膠用Sephadex G-50，用0.1mol/L NaCl洗脫。
前述的用有機溶劑沉淀，所述有機溶劑推薦與水互溶的有機溶劑，可以是低碳鏈的醇或酮，例如C1～C6的醇或酮等，尤其推薦丙酮，例如用2～6倍體積的75％～95％的丙酮；沉淀時間推薦為12～36小時。
本發明首次從川牛膝中提取川牛膝果聚糖CoPS。本發明的提取分離方法簡便，產率高，適于工業化生產。經生物活性試驗，研究結果表明川牛膝果聚糖CoPS具有較好的抑制Lewis肺癌的效果，并具有增強免疫活性的作用。
圖2是川牛膝果聚糖CoPS的CE圖。洗脫液100mmol/LH3BO3-KOH(pH＝10)，電壓12KV，檢測波長254nm，分析亦得到單一對稱峰，表明其具有均一性。
圖3是川牛膝果聚糖CoPS的IR圖。儀器為Bio-Rad公司的FTS185型紅外光譜儀。
圖4是川牛膝果聚糖CoPS的1H-核磁共振(NMR)圖譜。儀器是Bruker-MX-400核磁共振儀。溶劑為重水。
圖5是川牛膝果聚糖CoPS的13C-核磁共振(NMR)圖譜。儀器是Bruker-MX-400核磁共振儀。溶劑為重水。
圖6是川牛膝果聚糖CoPS單糖組成分析的HPLC圖。分析柱為Carbohydrate Analysis，洗脫液乙腈∶水(82∶18)，檢測器RI。
圖7是川牛膝果聚糖CoPS甲基化產物的氣相(GC)圖譜。儀器是Shimadzu QP5000色質聯用儀。
圖8、9、10、11、12、13、14、15是川牛膝果聚糖CoPS甲基化產物的質譜(MS)圖。其中圖8對應于圖7中3.22min的峰，表明有末端葡萄糖；圖9、10分別對應于圖7中3.27min和3.40min的峰，表明有末端果糖；

圖11、13分別對應于圖7中5.41min和5.74min的峰，表明有1，2連接的果糖；圖12對應于圖7中5.63min的峰，表明有2，6連接的果糖；圖14、15分別對應于圖7中8.13min和8.58min的峰，表明有支鏈的果糖。
實施例2將川牛膝藥材100g洗凈干燥，切片，用1.2升無離子水室溫浸泡48小時，過濾。殘渣用1升無離子水繼續浸泡12小時，過濾，合并濾液，50℃減壓濃縮，然后用3倍體積95％的丙酮沉淀，沉淀靜置24小時。離心，沉淀用100毫升水溶解，離心，無離子水透析72小時。50℃減壓濃縮后冷凍干燥，即獲得川牛膝總多糖13～15g。
實施例3將川牛膝藥材100g洗凈干燥，切片，用0.8升無離子水室溫浸泡48小時，過濾。殘渣用0.5升無離子水繼續浸泡12小時，過濾，合并濾液，50℃減壓濃縮，無離子水透析72小時，離心。50℃減壓濃縮后冷凍干燥，即獲得川牛膝總多糖15～17g。
實施例4將川牛膝藥材100g洗凈干燥，粉碎，用1.5升無離子水沸水煮6小時，過濾。殘渣用1升無離子水繼續煮6小時，過濾，合并濾液，50℃減壓濃縮，然后用2倍體積95％的丙酮沉淀，沉淀靜置24小時。離心，沉淀用100毫升水溶解，離心，無離子水透析72小時。50℃減壓濃縮后冷凍干燥，即獲得川牛膝總多糖13～15g。
實施例5川牛膝總多糖經CM-Sephadex C-50柱層析精制，純度為95％，再經Sephadex G-50柱層析，即獲得純度為99％的川牛膝果聚糖CoPS。具體的分離方法稱取川牛膝總多糖100mg，溶于2～3mL蒸餾水中，離心(4500r/min，10min)。取上清液上玻璃柱(1.5cm×120cm)，用0.1M NaCl洗脫，流速為0.5mL/min，每管收集3～5mL并檢測糖峰。收集后脫鹽，冷凍干燥，即獲得純果聚糖CoPS 80～90mg。
實施例6川牛膝果聚糖CoPS的元素分析將川牛膝果聚糖CoPS在110℃干燥5小時后，進行碳、氫、氮元素分析。元素分析儀為CARIO-ERBA元素自動分析儀。結果如下碳百分含量41.36％(±0.8％)氫百分含量6.63％(±0.3％)不含氮元素。
實施例7川牛膝果聚糖CoPS的生物活性研究我們對不同劑量的川牛膝果聚糖CoPS送檢生物活性測定，其結果如下1.川牛膝果聚糖CoPS對小鼠Lewis肺癌足趾接種的療效試驗之一樣品劑量給藥動物數 動物體重 瘤重 抑制率mg/kg方案始/終始/終 X±SD ％CoPS200 ip×10qd 8/8 20.4/24.1 0.488±0.04 49.17**對照組 NSip×10qd 16/16 20.4/24.3 0.960±0.15/**表示試驗組與陰性對照組相比p＜0.012.川牛膝果聚糖CoPS對小鼠Lewis肺癌足趾接種的療效試驗之二樣品劑量給藥 動物數 動物體重瘤重抑制率
mg/kg 方案 始/終 始/終 X±SD ％CoPS 100ip×10qd8/8 20.9/25.1 0.620±0.04 40.95**對照組 NS ip×10qd16/16 21.0/25.5 1.05±0.16 /**表示試驗組與陰性對照組相比p＜0.0權利要求
1.一種川牛膝果聚糖CoPS，其特征結構如下
2.如權利要求1所述的川牛膝果聚糖，其特征是分子量范圍為1000～10000。
3.如權利要求1所述的川牛膝果聚糖的總多糖，其特征是由如下方法制備將干燥后的中藥材川牛膝用水浸泡，用或不用有機溶劑沉淀，沉淀用水溶解，上清液經透析或膜分離后，濃縮干燥獲得總多糖。
4.如權利要求3所述的川牛膝果聚糖的總多糖，其特征是含有60～99％的川牛膝果聚糖CoPS。
5.如權利要求1或3所述的川牛膝果聚糖及其總多糖的生產方法，其特征是包括將干燥后的中藥材川牛膝用水浸泡，用或不用有機溶劑沉淀，沉淀用水溶解，上清液經透析或膜分離后，濃縮干燥獲得總多糖。
6.如權利要5所述的川牛膝果聚糖的生產方法，其特征是川牛膝總多糖加水溶解后，柱層析純化可得川牛膝果聚糖純品CoPS。
7.如權利要求5所述的川牛膝果聚糖的生產方法，其特征是藥材川牛膝與水浸泡的重量比川牛膝∶水＝1∶5～15，水浸泡時間24～48小時，浸泡液的pH＝6～8。
8.如權利要求5所述的川牛膝果聚糖的生產方法，其特征是所述的有機溶劑是與水互溶的有機溶劑。
9.如權利要求5所述的川牛膝果聚糖的生產方法，其特征是所述的凝膠柱層析所采用的凝膠為Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose型、Bio-Gel P型或Superdex，選用的分離范圍為1×102-5.0×104道爾頓。
10.如權利要求1或3所述的川牛膝果聚糖及其總多糖的用途，其特征在于所述的川牛膝果聚糖用于制備具有抗腫瘤和增強免疫功能的藥物或保健品。
全文摘要
本發明涉及一種從中藥材川牛膝中提取的果聚糖的生產方法和用途。本發明采用水浸泡獲得川牛膝水提液，用有機溶劑沉淀、沉淀用水溶解，上清液經透析或膜分離，濃縮干燥獲得總多糖，川牛膝總多糖經柱層析純化獲得川牛膝果聚糖CoPS，其化學結構為上式本發明方法工藝簡單、產率高，適于工業化生產。經生物活性試驗表明，該果聚糖無毒副作用，可用于制備具有抗腫瘤及增強免疫功能的作用的藥品和保健品。
文檔編號C08B37/00GK1434058SQ03115429
公開日2003年8月6日 申請日期2003年2月14日 優先權日2003年2月14日
發明者田庚元, 陳曉明 申請人:中國科學院上海有機化學研究所