從大興安嶺野生牧馬豆中高效提取總生物堿的新方法
【專利摘要】本發明屬于天然有機化學領域，涉及一種從大興安嶺野生牧馬豆里提取、純化總生物堿的方法，特別是涉及一種采用生物酶解技術，超高壓藕聯亞臨界水提取，酶法分離精制再采用高速逆流色譜法分離純化，最終得到高純度總生物堿的方法。本發明優點：1、生物破壁技術使生物堿有效成分快速溶出，保持高活性。在常溫下進行，能耗低，可進行工業化生產。2、亞臨界水無毒、無污染，使提取物的活性不被破壞；運行成本低，易于和產物分離，可進行工業化大規模生產。3、高速逆流色譜技術具有操作靈活、高效、分離速度快、制備量大、費用低等優點，并且可以工業化使用。本發明利用上述技術所得總生物堿含量高，純度高達95.8％。
【專利說明】從大興安嶺野生牧馬豆中高效提取總生物堿的新方法
【技術領域】:
[0001]本發明屬于天然有機化學領域，涉及一種從大興安嶺野生牧馬豆里提取總生物堿的新方法，特別是涉及一種利用超高壓藕聯亞臨界水提取，高速逆流色譜分離純化總生物堿的新方法。
【背景技術】:
[0002]牧馬豆，別名披針葉黃華。多年生草本，高10~40厘米，全株無毛。根莖細長，淡黃褐色，具少數須根。莖直立，稍分枝，表面有細縱紋。3出復葉，互生；小葉片倒卵狀長圓形或倒披針形，長2.5~8.5厘米，寬7~20毫米，先端急尖，基部楔形，上面平滑，下面密生平伏短柔毛；托葉2，對生，基部連合，總狀花序頂生；苞片3，基部連合；花長約3厘米；萼筒狀，長約1.6厘米；花冠蝶形，黃色。莢果條形，長5~9厘米，寬7~12毫米。種子腎形，黑褐色，有光澤。花期6~7月。果期7~8月。種子含生物堿達5%，主要成分為金雀花堿，其次為黃華堿、鷹爪豆堿、臭豆堿。生物堿具有一定營養和藥理作用，在食品、化妝、醫藥等方面有著巨大的應用潛力。
[0003]國內一般用有機溶劑提取法提取生物堿，常用的有冷浸、滲漉、索氏提取、熱回流提取。有機溶劑提取需要幾小時至十幾小時，操作溫度高且得率低，能耗大。
[0004]本發明的不同之處在于主要采用生物酶解技術，超高壓藕聯亞臨界水提取，酶法分離精制，后期采用高速逆流色譜法分離純化總生物堿。產品不僅得率高，而且純度高。亞臨界水的極性在較大范圍內變化，可以實現天然產物中有效成分的連續提取，并可實現選擇性提取；且動態亞臨界水裝置結構簡單，可以根據實驗要求進行不同的改進。

【發明內容】
:·[0005]本發明的目的在于克服常規技術提取率較低、提取純度低等缺點，提供一種主要采用生物酶解技術，超高壓藕聯亞臨界水提取，后期采用高速逆流色譜法(HSCCC)分離純化總生物堿的方法。
[0006]本發明方法提取快捷、產品純度高。本發明優點:大大提高了生物堿萃取速度，同時極大提高有效成分含量，克服了常規提取提取物純度低、得率低的缺點。
[0007]為實現上述目的，本發明采用的技術方案是:
[0008]一種采用生物酶解技術，超高壓藕聯亞臨界水提取，酶法分離精制再采用高速逆流色譜法分離純化，最終得到高純度總生物堿的方法，其步驟如下:
[0009](I)生物破壁:牧馬豆種子加入果膠酶與纖維素酶、半纖維素素酶混合酶解，在一定酶濃度，PH值3-4，酶解時間2-3h ；
[0010](2)超高壓提取:按一定料液比加入加入亞臨界水，以適當壓力、時間加壓兩次；
[0011](3)酶法分離精制:提取液添加一定量的木瓜蛋白酶和淀粉酶，將提取液中的蛋白質、淀粉降解為小分子物質除去，改善水提取液的過濾難問題，提高澄清度和純度；
[0012](4)微濾:粗提液用適當的微孔膜過濾，膜壓力0.2-0.4MPa，過濾溫度50_60°C ；[0013](5)結晶:
[0014]過濾后液體初步濃縮，濃縮粉按一定的量加鹽酸溶液，加氨水調至中性，加熱溶解，濃縮后，放置過夜，析出結晶，過濾，分離晶體；
[0015](6)分相:稱取總生物堿提取物，選擇HSCCC溶劑系統，按比例將各種溶劑加入分液漏斗中，震蕩使溶液充分混合，放置過夜。分相平衡后分出上相和下相；
[0016](7) HSCCC純化:以溶劑系統的上相為固定相，下相為流動相，調整轉速，以一定流速泵入流動相，純化總生物堿提取物；
[0017](8)檢測:采用高效液相色譜法，紫外檢測器在一定波長進行檢測，得純度為90%以上的總生物堿。
【具體實施方式】:
[0018]實施例1:一種采用生物酶解技術，超高壓藕聯亞臨界水提取，酶法分離精制再采用高速逆流色譜法分離純化，最終得到高純度總生物堿的方法，其步驟如下:
[0019](I)生物破壁:2kg牧馬豆種子加入果膠酶與纖維素酶、半纖維素素酶(I:1:1)混合酶解，酶濃度為0.3g / kg，調整pH值為3，40°C下酶解時間2h ；
[0020](2)超高壓提取:加入亞臨界水，按1:8料液比加入，以200MPa壓力加壓5min，加壓兩次；
[0021](3)酶法分離精制:提取液添加木瓜蛋白酶和淀粉酶(1:1)，添加量1%。，將提取液中的蛋白質、淀粉降解為小分子物質除去，提高提取液的澄清度和純度；
[0022](4)微濾:將初步分離液用0.8um微孔過濾，壓力0.2MPa，過濾溫度50°C ；
`[0023](5)結晶:
[0024]過濾后液體初步濃縮，濃縮粉加I %鹽酸溶液，加氨水調至中性，加熱溶解，濃縮后放置過夜，析出結晶，過濾，分離得到晶體79.7g ；
[0025](6)分相:稱取總生物堿提取物200mg，選擇正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4:2:3:DHSCCC溶劑系統，按比例將各種溶劑加入分液漏斗中，震蕩使溶液充分混合，放置過夜。分相平衡后分出上相和下相；
[0026](7)HSCCC純化:以溶劑系統的上相為固定相，下相為流動相，調整轉速700r /min,以2.0mL / min流速泵入流動相,純化總生物堿提取物；
[0027](8)檢測:采用高效液相色譜法，紫外檢測器在一定波長進行檢測，得純度為92.3%的總生物堿。
[0028]實施例2: —種采用生物酶解技術，超高壓藕聯亞臨界水提取，酶法分離精制再采用高速逆流色譜法分離純化，最終得到高純度總生物堿的方法，其步驟如下:
[0029](I)生物破壁:5kg牧馬豆種子加入果膠酶與纖維素酶、半纖維素素酶(I:2:1)混合酶解，酶濃度為0.4g / kg，調整pH值為4，45°C下酶解時間3h ;
[0030](2)高壓提取:加入亞臨界水，按1:10料液比加入，以400MPa，加壓6min，加壓兩次；
[0031](3)酶法分尚精制:提取液添加木瓜蛋白酶和淀粉酶(2:1)，添加量1.2%。,將提取液中的蛋白質、淀粉降解為小分子物質除去，改善水提取液的過濾難問題，提高澄清度和純度；[0032](4)微濾:將初步分離液用0.6um微孔過濾，壓力0.3MPa，過濾溫度60°C ；
[0033](5)結晶:
[0034]過濾后液體初步濃縮，濃縮粉加1.5%鹽酸溶液，加氨水調至中性，加熱溶解，濃縮后放置過夜，析出結晶，過濾，分離得到晶體210.9g ;
[0035](6)分相:稱取總生物堿提取物200mg，選擇氯仿_甲醇_水(4:3:2) HSCCC溶劑系統，按比例將各種溶劑加入分液漏斗中，震蕩使溶液充分混合，放置過夜。分相平衡后分出上相和下相；
[0036](7)HSCCC純化:以溶劑系統的上相為固定相，下相為流動相，調整轉速900r /min,以3.0mL / min流速泵入流動相,純化總生物堿提取物；
[0037](8)檢測:采用高效液相色譜法，紫外檢測器在一定波長進行檢測，得純度為95.8%的總生物堿。
[0038]實施例3: —種采用生物酶解技術，超高壓藕聯亞臨界水提取，酶法分離精制再采用高速逆流色譜法分離純化，最終得到高純度總生物堿的方法，其步驟如下:
[0039](1)生物破壁:2kg牧馬豆種子加入果膠酶與纖維素酶、半纖維素素酶(I:2:2)混合酶解，酶濃度為0.5g/kg，調整pH值為3，50°C下酶解時間2h ；
[0040](2)高壓提取:按I:12料液比加入亞臨界水，以300MPa加壓4min，加壓兩次；
[0041](3)酶法分尚精制:提取液添加木瓜蛋白酶和淀粉酶(I:2)，添加量1.5%。,將提取液中的蛋白質、淀粉降解為小分子物質除去，改善水提取液的過濾難問題，提高澄清度和純度；
[0042](4)微濾:將初步分離液用0.5um微孔過濾，壓力0.4MPa，過濾溫度55°C ；
[0043](5)結晶:
[0044]過濾后液體初步濃縮，濃縮粉加2.0%鹽酸溶液，加氨水調至中性，加熱溶解，濃縮后放置過夜，析出結晶，過濾，分離得到晶體80.2g ；
[0045](6)分相:稱取總生物堿提取物200mg，選擇正丁醇-乙酸乙酯-水(5:4:2) HSCCC溶劑系統，按比例將各種溶劑加入分液漏斗中，震蕩使溶液充分混合，放置過夜。分相平衡后分出上相和下相；
[0046](7)HSCCC純化:以溶劑系統的上相為固定相，下相為流動相，調整轉速800r /min,以2.0mL / min流速泵入流動相,純化總生物堿提取物；
[0047](8)檢測:采用高效液相色譜法，紫外檢測器在一定波長進行檢測，得純度為94.7%的總生物堿。
【權利要求】
1.一種采用生物酶解技術，超高壓藕聯亞臨界水提取，酶法分離精制再采用高速逆流色譜法分離純化，最終得到高純度總生物堿的方法，其步驟如下: (1)生物破壁:牧馬豆種子加入果膠酶與纖維素酶、半纖維素素酶混合酶解，在一定酶濃度，PH值3-4，酶解時間2-3h ； (2)超高壓提取:按一定料液比加入加入亞臨界水，以適當壓力、時間加壓兩次； (3)酶法分離精制:提取液添加一定量的木瓜蛋白酶和淀粉酶，將提取液中的蛋白質、淀粉降解為小分子物質除去，改善水提取液的過濾難問題，提高澄清度和純度； (4)微濾:粗提液用適當的微孔膜過濾，膜壓力0.2-0.4MPa，過濾溫度50_60°C ； (5)結晶:過濾后液體初步濃縮，濃縮粉按一定的量加鹽酸溶液，加氨水調至中性，加熱溶解，濃縮后放置過夜，析出結晶，過濾，分離晶體； (6)分相:稱取總生物堿提取物，選擇HSCCC溶劑系統，按比例將各種溶劑加入分液漏斗中，震蕩使溶液充分混合，放置過夜。分相平衡后分出上相和下相； (7)HSCCC純化:以溶劑系統的上相為固定相，下相為流動相，調整轉速，以一定流速泵入流動相，純化總生物堿提取物； (8)檢測:采用高效液相色譜法，紫外檢測器在一定波長進行檢測，得純度為90%以上的總生物堿。
2.根據權利要求1所述的一種采用生物酶解技術，超高壓藕聯亞臨界水提取，酶法分離精制再采用高速逆流色譜法分離純化，最終得到高純度總生物堿的方法，其特征是:在所述的步驟(1)中，果膠酶與纖`維素酶、半纖維素素酶比例為1:1:1、1:2:1、1:2:2，酶濃度為0.3-0.5g / kg，酶解溫度 40-50 (。
3.根據權利要求2所述的一種采用生物酶解技術，超高壓藕聯亞臨界水提取，酶法分離精制再采用高速逆流色譜法分離純化，最終得到高純度總生物堿的方法，其特征是:在所述的步驟(2)中，料液比為1:8-12，超高壓力為200-400MPa，加壓時間5_8min。
4.根據權利要求3所述的一種采用生物酶解技術，超高壓藕聯亞臨界水提取，酶法分離精制再采用高速逆流色譜法分離純化，最終得到高純度總生物堿的方法，其特征是:在所述的步驟⑶中，木瓜蛋白酶和淀粉酶比例為1:1、2:1、1:2，添加量為1.0-1.5%。。
5.根據權利要求4所述的一種采用生物酶解技術，超高壓藕聯亞臨界水提取，酶法分離精制再采用高速逆流色譜法分離純化，最終得到高純度總生物堿的方法，其特征是:在所述的步驟(4)中，微孔過濾膜為0.5-0.Sum。
6.根據權利要求5所述的一種采用生物酶解技術，超高壓藕聯亞臨界水提取，酶法分離精制再采用高速逆流色譜法分離純化，最終得到高純度總生物堿的方法，其特征是:在所述的步驟(6)中，HSCCC溶劑系統為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(4:2:3:1)、氯仿-甲醇-水(4:3:2)、正丁醇-乙酸乙酯-水(5:4:2)中的任意一種。
7.根據權利要求6所述的一種采用生物酶解技術，超高壓藕聯亞臨界水提取，酶法分離精制再采用高速逆流色譜法分離純化，最終得到高純度總生物堿的方法，其特征是:在所述的步驟(7)中，轉速700-900r / min，流動相流速為2.0-3.0mL / min。
【文檔編號】C07D471/22GK103626770SQ201310631037
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月27日 優先權日:2013年11月27日
【發明者】張亞紅, 信小娟 申請人:大興安嶺嘉迪歐營養原料有限公司