一種蝦原肌球蛋白過敏原基準物的制備方法
【專利摘要】一種蝦原肌球蛋白基準物的制備方法，屬于生物【技術領域】。本發明涉及從蝦肉中將原肌球蛋白這種主要的過敏原蛋白進行高效穩定的提取和分離純化的方法，所述原肌球蛋白的純化采用浸提、熱沉淀、親和層析等多種技術相結合的手段，將高過敏原性的原肌球蛋白從蝦肉中分離出來，并保持原有活性。本發明方法獲得的原肌球蛋白有助于對蝦過敏的針對，并可用于免疫技術檢測食品中的蝦過敏原。
【專利說明】一種蝦原肌球蛋白過敏原基準物的制備方法
【技術領域】
[0001]一種蝦原肌球蛋白過敏原基準物的制備方法，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]隨著世界經濟的全球化和食品貿易的國際化，食物過敏已日益成為人們關注的食品安全問題。作為八大類食物過敏原之一，蝦蟹等甲殼類海產品的過敏原成為大家關注的焦點。目前對于激發過敏反應的閾值還沒有定論，而且存在很大的個體差異，但微量過敏原可以使大多數過敏患者產生過敏癥狀已經形成共識。為了對蝦類過敏原進行有效的控制，必須建立靈敏可靠的檢測方法，雖然目前很多單位和研究者根據自己的研究建立了不同的檢測方法，但目前過敏原的研究基本處于各自為戰的狀態，不同研究機構的結果無法重復，造成巨大的浪費。而解決這一問題的關鍵在于獲得合適的過敏原基準物。因此，制備蝦類過敏原基準物對于規范過敏原的研究，盡快實現對過敏原的控制和利用具有重要的意義。
[0003]

【發明內容】

[0004]要解決的技術問題
本發明所要解決的技 術問題是提供一種蝦類原肌球蛋白基準物的制備方法，同時保持原有的過敏原性。
[0005]技術方案
一種蝦類原肌球蛋白基準物的制備方法，該指標方法采取低鹽緩沖液浸提，熱沉淀，離心和親和層析等多種手段相結合的方式，將高活性的原肌球蛋白從蝦肉中分離出來，最大程度的保持原有的過敏原性。制備步驟為:
(1)提取
將蝦肉打碎并溶解與0.01mol/L、pH7.4，含0.01mg/mL酶抑制劑的磷酸鹽緩沖液中，蝦肉質量:磷酸鹽緩沖液體積比為1: 20，在4°C條件下磁力攪拌10h，并5000r/min離心20min,收集上清得到蝦蛋白的抽提液。
(2)熱沉淀
將蝦蛋白抽提液加熱至70°C，并保持20min后，在4°C條件下5000r/min離心20min，收集上清液，去除不耐熱的雜蛋白，得到對熱有一定耐受度的蝦類抽提液，并進行冷凍干燥，得到熱耐受蝦蛋白粉末。
(3)飽和硫酸銨分級沉淀
按照硫酸銨濃度分配表，配制飽和度為30%的硫酸銨溶液，向其中加入熱耐受蝦蛋白粉末20g，4°C磁力攪拌2h、靜置4h，并在4°C條件下5000r/min離心20min后，取上清液。向上清液中加入硫酸銨至飽和度達到45%，在4°C條件下磁力攪拌2h、靜置4h，并在4°C條件下5000r/min離心20min,收集沉淀,用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液復溶。
(4)原肌球蛋白特異性IgG抗體親和層析將收集的蛋白組分裝入透過分子量為2000的透析袋，用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液于4°C透析48h,然后用固定有原肌球蛋白特異性IgG的Sephrose親和層析柱進行純化，條件為:將柱體積10%的蝦蛋白溶液加入柱子，在4°C條件下平衡2h，然后采用含有IMNaCl的0.01mol/L, pH7.4的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，流速為0.2mL/min，每2min對洗脫液進行分部收集，在280nm和260nm進行紫外吸收檢測，收集所需的樣品，合并后在4°C條件下用去離子水透析24h，樣品經冷凍干燥后即為蝦原肌球蛋白的基準物質。
[0006]所述的魚過敏原標準物的制備方法，第(I)步中得到的蝦蛋白抽提液、第(2)步只能夠得到的熱耐受蝦蛋白粉末、第(3)步得到的30%和45%飽和度的硫酸銨沉淀的蛋白組分和第(4)步得到的親和純化的各蛋白組分都進行變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，電泳條件為:12%分離膠，5%濃縮膠，恒壓120V，步驟(4)得到的冷凍干燥蛋白粉條帶單一，相對分子質量為36kDa的蛋白質組分即為蝦原肌球蛋白基準物。
[0007]本發明的有益效果在于:所制備的蝦原肌球蛋白基準物保持了其過敏原性，可以用于食品中蝦過敏原的檢測，同時還有助于在醫學上對蝦過敏進行準確的診斷。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1所制備的蝦原肌球蛋白過敏原基準物的SDS-PAGE鑒定圖。
【具體實施方式】
[0009]實施例1:蝦類原肌球蛋白過敏原基準物的制備，步驟如下:
(1)提取
將蝦肉打碎并溶解與0.01mol/L、pH7.4，含0.01mg/mL酶抑制劑的磷酸鹽緩沖液中，蝦肉質量:磷酸鹽緩沖液體積比為1: 20，在4°C條件下磁力攪拌10h，并5000r/min離心20min,收集上清得到蝦蛋白的抽提液。
(2)熱沉淀
將蝦蛋白抽提液加熱至70°C，并保持20min后，在4°C條件下5000r/min離心20min，收集上清液，去除不耐熱的雜蛋白，得到對熱有一定耐受度的蝦類抽提液，并進行冷凍干燥，得到熱耐受蝦蛋白粉末。
(3)飽和硫酸銨分級沉淀
按照硫酸銨濃度分配表，配制飽和度為30%的硫酸銨溶液，向其中加入熱耐受蝦蛋白粉末20g，4°C磁力攪拌2h、靜置4h，并在4°C條件下5000r/min離心20min后，取上清液。向上清液中加入硫酸銨至飽和度達到45%，在4°C條件下磁力攪拌2h、靜置4h，并在4°C條件下5000r/min離心20min,收集沉淀,用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液復溶。
(4)原肌球蛋白特異性IgG抗體親和層析
將收集的蛋白組分裝入透過分子量為2000的透析袋，用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液于4°C透析48h,然后用固定有原肌球蛋白特異性IgG的Sephrose親和層析柱進行純化，條件為:將柱體積10%的蝦蛋白溶液加入柱子，在4°C條件下平衡2h，然后采用含有IMNaCl的0.01mol/L, pH7.4的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，流速為0.2mL/min，每2min對洗脫液進行分部收集，在280nm和260nm進行紫外吸收檢測，收集所需的樣品，合并后在4°C條件下用去離子水透析24h，樣品經冷凍干燥后即為蝦原肌球蛋白的基準物質。[0014]實施例2:魚過敏原蛋白的SDS-PAGE鑒定
對實施例1中第(I)、(2)、(3)、(4)步所獲得的蝦蛋白抽提液、熱耐受蝦蛋白粉末、飽和硫酸銨分級沉淀組分、親和層析各峰組分進行SDS-PAGE鑒定。電泳條件為:12%分離膠，5%濃縮膠，恒壓120V。圖1中所制備的標準物質條帶單一，相對分子量36kDa，與文獻報道
相一 致。
【權利要求】
1.一種蝦類原肌球蛋白過敏原基準物的制備方法。 制備步驟: (1)提取 將蝦肉打碎并溶解與0.01mol/L、pH7.4，含0.01mg/mL酶抑制劑的磷酸鹽緩沖液中，蝦肉質量:磷酸鹽緩沖液體積比為1: 20，在4°C條件下磁力攪拌10h，并5000r/min離心20min,收集上清得到蝦蛋白的抽提液。 (2)熱沉淀 將蝦蛋白抽提液加熱至70°C，并保持20min后，在4°C條件下5000r/min離心20min，收集上清液，去除不耐熱的雜蛋白，得到對熱有一定耐受度的蝦類抽提液，并進行冷凍干燥，得到熱耐受蝦蛋白粉末。 (3)飽和硫酸銨分級沉淀 按照硫酸銨濃度分配表，配制飽和度為30%的硫酸銨溶液，向其中加入熱耐受蝦蛋白粉末20g，4°C磁力攪拌2h、靜置4h，并在4°C條件下5000r/min離心20min后，取上清液。向上清液中加入硫酸銨至飽和度達到45%，在4°C條件下磁力攪拌2h、靜置4h，并在4°C條件下5000r/min離心20min,收集沉淀,用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液復溶。 (4)原肌球蛋白特異性IgG抗體親和層析 將收集的蛋白組分裝入透過分子量為2000的透析袋，用0.01mol/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液于4°C透析48h,然后用固定有原肌球蛋白特異性IgG的Sephrose親和層析柱進行純化，條件為:將柱體積10%的蝦蛋白溶液加入柱子，在4°C條件下平衡2h，然后采用含有IMNaCl的0.01mol/L, pH7.4的磷酸鹽緩沖液進行洗脫，流速為0.2mL/min,每2min對洗脫液進行分部收集，在280nm和260nm進行紫外吸收檢測，收集所需的樣品，合并后在4°C條件下用去離子水透析24h，樣品經冷凍干燥后即為蝦原肌球蛋白的基準物質。
2.根據權利要求1所述的蝦類原肌球蛋白過敏原基準物的制備方法，其特征在于，第(I)步中得到的蝦蛋白抽提液、第(2)步只能夠得到的熱耐受蝦蛋白粉末、第(3)步得到的30%和45%飽和度的硫酸銨沉淀的蛋白組分和第(4)步得到的親和純化的各蛋白組分都進行變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，電泳條件為:12%分離膠，5%濃縮膠，恒壓120V，步驟(4)得到的冷凍干燥蛋白粉條帶單一，相對分子質量為36kDa的蛋白質組分即為蝦類原肌球蛋白過敏原基準物。
【文檔編號】C07K1/30GK103804480SQ201210440816
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年11月2日 優先權日:2012年11月2日
【發明者】王國英, 陳官芝 申請人:青島大學