專利名稱：突變的單純皰疹病毒及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及突變的單純皰疹病毒，其包括插入到必需基因內的HSV潛伏性相關轉錄(LAT)區域元件，和內源性LAT區域的對應序列內的缺失。本發明也涉及這種突變的單純皰疹病毒在基因治療和分析基因功能的方法上的應用。
單純皰疹病毒(HSV)經常被建議作為神經和非神經來源細胞的一種基因傳遞載體。HSV可能尤其適用于神經系統的基因傳遞，因為它可以天然地在這些細胞中處于一種終生潛伏狀態，因此如果潛在性治療基因的表達可以在潛伏期自始至終被維持的話，它則提供了達到終生治療效果的可能性。由于HSV的基因組長度大，大片段DNA可以插入到基因組中，同時允許多個基因的表達，這對于特定疾病的治療可能是重要的。然而，在這些優點可以被開發之前，該病毒需要被失活以阻止復制和降低細胞毒性，并且需要開發允許插入基因在潛伏期表達的啟動子系統。
為了構造一種HSV載體菌株，可以將必需和非必需基因的組合從基因組中剔除，以使該病毒為非病原性和最低細胞毒性。載體病毒的構造通常是通過缺失一個或另一個或兩個必需的即早期基因ICP4和ICP27。這些病毒需要在表達缺失基因的細胞系上生長。可以進行進一步的缺失以降低細胞毒性。為了產生允許基因在潛伏期表達的病毒，所設計的啟動子必須允許基因在該時期內繼續表達，這已經被證明是在HSV載體開發領域中的一個重要挑戰。然而，我們和其他研究人員已經發現許多不同的，各自摻入HSV潛伏性相關轉錄(LAT)區域的不同元件的啟動子系統，其在潛伏期確實存在不同效率水平的基因表達。這些使用一個或另一個LAT啟動子(LAP1或LAP2；Goins等，1994)在潛伏期直接驅動基因表達，或者利用來自LAT區域的DNA片段來給予單個或成對的啟動子長期的活性。該元件，此處稱為LATP2(包括LAP2和其它上游序列；(核苷酸118,866-120,219-GenBankHE1CG))，隨后已經表現出不是作為一個真正的啟動子發揮作用，而是給予位于其附近的異源啟動子長期的活性，當單獨使用這些啟動子時，它們在潛伏期不具活性。
本發明通過缺失與插入到一種必需IE基因內的啟動子構建體中存在的序列對應的內源性LAT序列，以試圖克服所得經修飾的HSV基因組穩定性的降低。
特別地，我們已經發現插入到IE必需IE基因(ICP4和/或ICP27)、其內源性LAT區域內的相應元件沒有被缺失的、基于LAT的啟動子，其重排可以在當這種突變病毒在表達互補基因的細胞系內復制時，通過同源重組實現。這常常導致插入的異源基因以及其它序列從病毒中被缺失。然而，如果相應于已經被插入到ICP4和/或ICP27的LAT序列的元件從內源性的LAT區域中被缺失，則無法檢測到重排，而且這種病毒能以一種穩定的模式復制。因此本發明涉及具有插入片段的病毒，插入片段包括插入到基因的基因座LAT區域的元件，優選的是必需IE基因基因座，相應的元件已經被從該病毒的內源性LAT區域中被缺失。這些病毒能以一種穩定的模式復制，這種穩定的復制在其它情況下是不可能的。
因此，本發明提供了一種單純皰疹病毒(HSV)，其包括
(ⅰ)一段插入到HSV的一個必需基因內的HSV LAT序列；和(ⅱ)HSV內源性LAT區域上的缺失。
優選的，缺失包括存在于插入的HSV LAT序列中的至少一些序列，優選的是存在于插入的LAT序列中的至少50％的序列，更優選的是至少75％，最優選的是存在于插入的LAT序列中的至少所有的序列。
LAT序列已經插入到其中的必需基因優選的是包括一個缺失，如在一個必需基因的編碼區域和/或內源性調控序列上的一個缺失。插入到必需IE基因上是優選的。
本發明的單純皰疹病毒可以被用于，例如，在治療神經系統的疾病或損傷(包括帕金森氏病)、脊髓損傷或中風、或眼睛、心臟或骨骼肌的疾病、或惡性腫瘤的方法中傳遞治療基因。本發明也涉及研究基因在哺乳動物細胞中的功能的方法，如鑒定補償細胞機能不良的基因、或研究在野生型或突變的哺乳動物細胞中表達突變基因的影響。本發明的方法尤其可以被用于對疾病所涉及的基因進行功能研究。
本發明進一步提供了本發明的一種HSV，其攜有一個異源基因。術語異源基因包括任何在HSV基因組中沒有被發現的基因。異源基因可以是一種野生型基因的任何等位基因的變體，或者其可能是一種突變基因。異源基因優選的是與允許上述異源基因在哺乳動物細胞中表達的控制序列可操作連接，所述細胞優選的是中樞或周圍神經系統的細胞，或眼睛、心臟或骨骼肌的細胞，更優選的是中樞或周圍神經系統的細胞。本發明的HSV可以因此被用于將一種異源基因傳遞到哺乳動物細胞內，所述基因將在所述細胞內表達。這種載體在多種應用中都是有用的，如，在基因治療、或在體外分析方法或HSV基因調控的研究中。
該異源基因優選的是編碼一種具有治療作用的多肽，包括具細胞毒性或能夠將一種藥物前體轉變為一種細胞毒化合物的多肽。
本發明進一步提供了本發明的單純皰疹病毒，其攜有一個異源基因，用于人類和動物的治療。例如，這些病毒可以被用于治療神經系統的疾病或損傷(包括帕金森氏病)、脊髓損傷或中風或眼睛、心臟或骨骼肌的疾病、或惡性腫瘤。
本發明的HSV也可以被用于研究哺乳動物細胞中的基因功能的方法中，例如用于鑒定補償細胞營養不良的基因、或研究突變基因在野生型或突變的哺乳動物細胞中表達的影響。本發明的方法尤其可以被用于對疾病所涉及的基因進行功能研究。
本發明也提供了一種構建本發明中的單純皰疹病毒的方法，上述方法包括(ⅰ)將一段HSV LAT序列插入到該病毒的一個必需基因內；以及(ⅱ)缺失該病毒的至少部分LAT區域。
在該HSV的LAT區域的缺失，優選的是包括至少部分或更優選的是包括全部與存在于插入的HSV LAT序列內的序列相應的內源性序列。發明詳述A LAT序列LAT序列在本文中的定義是包括所有來自HSV1株系17+的5,490到9,214和117,159到120,882位之間的核苷酸序列(GenBanKHE1CG)，和來自其它HSV1株系和所有HSV2株系的同源區域。
LAT P2區域在本文中的定義是HSV1株系17-中的HSV1核苷酸118866到120219位(GenBank HE1CG來自PstⅠ-BstXⅠ位點)，以及該區域的片段或衍生物，包括HSV2和其它HSV1株系的同源區域，這些區域可以向與它們連接的啟動子提供長期的表達能力，或者它們本身可以驅動長期的基因表達。
B．病毒株系本發明中的單純皰疹病毒可以來自，例如，HSV1或HSV2株系，或它們(優選的是HSV1)的衍生物。衍生物包括含有來自HSV1和HSV2株系的DNA的型內(inter-type)重組體。衍生物優選的是與HSV1或HSV2基因組至少具有70％序列同源性，較優選的是至少80％，更優選的是至少90或95％。其它可以被用于獲得本發明的病毒的衍生物包括已經在ICP4和/或ICP27上具有突變的株系，如株系d120，其在ICP4上具有一個缺失(DeLuca等，1985)。在ICP27上具有缺失的HSV株系也已經被構建，例如Reef Hardy和Sandri-Goldin,1994以及Rice和Knipe,1990(株系d27-1)。在ICP4和ICP27上均具有缺失的株系如US-A-5,658,724.和Samaniego等，1995(株系d92)所描述。使用這些株系將減少構建本發明的突變HSV株系所需要的步驟。
用于描述不同HSV基因的術語如Coffin和Latchman,1996中所述。
C．補償性細胞系本發明的病毒在表達必需基因的細胞系內復制。表達ICP4細胞系的例子包括E5細胞(DeLuca等1985)或B4細胞(見實施例2)，優選的是B4細胞。表達ICP27細胞系的例子包括V27細胞(Rice和Knipe,1990)、2-2細胞(Smith等，1992)或B130/2細胞(見實施例1和WO98/04726)，優選的是B130/2細胞。
表達必需基因的細胞系的構建可以通過將一種載體(優選是一種質粒載體，其包括一種可以在上述細胞內表達的功能性的HSV必需基因)和一種載體(優選的是質粒載體，編碼一種選擇性標記，如新霉素抗性)一起共轉染哺乳動物細胞(例如Vero或BHK細胞)。然后篩選具有選擇性標記的克隆以進一步確定哪個克隆也表達該功能性的必需基因，所述篩選基于它們支持缺乏該必需基因的HSV株系的生長的能力，使用的是本領域技術人員所了解的方法。
如以上所描述的構建細胞系，其不允許缺乏一種特定必需基因的突變HSV株系回復到一種具有功能性必需基因的株系，必須確保含有該功能性必需基因的載體盡可能地，不含有與保留在突變病毒內的序列重疊(即，與其同源)的序列。優選地，完全沒有重疊。
D．突變的方法在通過幾種本領域熟知的技術插入LAT序列之前，可以使必需基因功能性失活。例如，它們可以通過缺失、取代或插入被功能性失活，優選的是通過缺失。缺失可以除去基因的部分或整個基因。例如，可以僅缺失一個核苷酸，導致移碼。然而，優選的是進行較大的缺失，如全部編碼和非編碼序列的至少25％，更優選的是50％(或者可選地，以絕對的術語，至少10個核苷酸，更優選的是至少100個核苷酸，最優選的，至少1000個核苷酸)。尤其優選的是除去整個基因和一些側翼序列。插入的序列可以包括以上所描述的LAT序列和以下描述的異源基因。
缺失也可以是除去HSV的LAT區域的部分或全部。這些缺失可以如以下所描述的進行。
在單純皰疹病毒內進行的突變可以通過本領域技術人員所熟知的同源重組的方法。例如，將HSV基因組DNA與一種載體(優選的是質粒載體，含有同源的HSV序列，在其側翼為突變序列)一起共轉染。該突變序列可以包括缺失、插入或取代，所有這些都可以通過常規的技術構建。插入可以包括選擇性標記的基因，如lacZ，以通過，如β-半乳糖苷酶活性篩選重組體病毒。
E．異源基因和啟動子本發明的突變HSV株系可以被修飾以攜有一個異源基因，也就是除了存在于HSV基因組內的基因以外的基因。術語“異源基因”包括除了存在于HSV基因組內的基因以外的任何基因。異源基因可以是某一野生型基因的任何等位基因的變體，或者其可以是一個突變基因。術語“基因”是用于涵蓋至少可以被轉錄的的核苷酸序列。因此，編碼mRNA、tRNA和rRNA的序列均被包括在該定義內。就啟動子而言，該序列可以為有義或反義方向。根據熟知的技術，反義構建體可以被用于抑制一種基因在細胞內的表達。編碼mRNA的序列將隨意地包括部分或全部5’和/或3’自然地轉錄但不翻譯的側翼序列，或要不然包括與翻譯的編碼序列相關的序列。其可以進一步隨意地包括一般與轉錄的序列相關的相關轉錄調控序列，如轉錄終止信號、多聚腺苷酸化位點和下游增強子元件。
可以通過將HSV株系與，例如質粒載體(如攜有異源基因的質粒，所述基因的側翼為HSV序列)同源重組將該異源基因插入到HSV基因組內。該異源基因可以采用本領域熟知的克隆技術被引入到一個合適的帶有HSV序列的質粒載體上。該異源基因可以在任何位點被插入到HSV基因組內，只要該病毒仍然可以復制即可。優選的是該異源基因被插入到一個必需基因內，優選的是ICP4或ICP27。
該異源基因的轉錄序列優選的是與一段允許該異源基因在哺乳動物細胞內表達的操縱序列可操作連接，優選的是中樞和周圍神經系統的細胞。術語“可操作連接”是指并列，其中所描述組分之間的關系允許它們以其特定的方式發揮功能。一段控制序列與一段編碼序列“可操作連接”是以這樣一種方式連接，使得編碼序列的表達在與控制序列相容的條件下完成。
控制序列包括一個允許該異源基因表達的啟動子和一個終止轉錄的信號。啟動子選自在哺乳動物、尤其是人細胞內發揮功能的啟動子。該啟動子可以來自真核基因的啟動子序列。例如，其可以是來自該異源基因將在其中表達的細胞的基因組的啟動子，所述細胞優選的是哺乳動物中樞或周圍神經系統的細胞。至于真核啟動子，它們可以是以普遍存在的方式(如β-肌動蛋白、微管蛋白的啟動子)或者，可選擇地，以組織特異性方式(如丙酮酸激酶基因的啟動子)發揮功能。它們也可以是響應特定刺激的啟動子，如與甾類激素受體結合的啟動子。也可以使用病毒啟動子，如Moloney鼠白血病病毒長末端重復序列(MMLV LTR)啟動子或HSV基因的啟動子。
HSV LAT啟動子，和含有LAT啟動子區域元件的啟動子是尤其優選的，因為有可能在潛伏期獲得異源基因的長期表達。特別地，實質上由一段LAT P2區域組成的表達盒，其本身并不充當啟動子，以該次序連接一個啟動子和一個異源基因是尤其優選的。
術語“長期表達”是用于表示一個異源基因在一個被本發明的單純皰疹病毒感染的細胞內的表達，甚至是在該單純皰疹病毒已經進入潛伏期之后的表達。優選在感染之后至少兩周，更優選地是至少一或兩個月，尤其優選的是在細胞的終生表達。
表達盒可以進一步包括第二個啟動子和第二個異源基因，它們以該次序與上述HSV LAT P2區域可操作連接，其取向與第一個啟動子和第一個異源基因相反，其中上述第二個啟動子和第二個異源基因與該第一個啟動子和第一個異源基因相同或不同。因此，一對取向相反的啟動子/異源基因構建體在一個單個的LAT P2區域側翼，以允許成對的異源基因(其可以相同或不同，被相同或不同的啟動子驅動)長期表達。此外，在合適的生理條件下，第一個異源基因的產物可以調控第二個異源基因的表達(或反之亦然)。
表達盒可以采用本領域技術人員所知的常規克隆技術被構建(見，例如，Sambrook等，1989.分子克隆-實驗室手冊；冷泉港出版社)。此外，含有這種表達盒的特定HSV株系的構建如實施例中所描述。
LAT P2區域此處定義為HSV1核苷酸118866到120219位(GenBank HE1CG來自Pst1-BstX1位點)，該區域的片段或衍生物，包括HSV2的同源區域，其可以向與其連接的啟動子提供長期表達的能力。
至于啟動子，也有利的是其為可誘導的，以致該異源基因的表達水平可以在細胞的終生被調控。可誘導表示使用啟動子所獲得的表達水平可以被調控。例如，在一個優選的實施方案中，其中不止一個異源基因被插入到HSV基因組內，一個啟動子將包括一個對以前所報道(Gossen和Bujard,1992.Gossen等，1995)的tet相抑蛋白/VP16轉錄激活物融合蛋白有反應、并驅動其表達將被調控的異源基因的啟動子。第二個啟動子將包括一個驅動tet相抑蛋白/VP16融合蛋白表達的強啟動子(如，CMV IE啟動子)。因此在該實施例中，第一個異源基因的表達將取決于四環素的存在或缺乏。
另外，這些啟動子中的任何一種可以通過加入另一個調控序列進行修飾，如增強子序列(包括LAT區域的元件)。也可使用嵌合的啟動子，其包括來自以上所描述的兩個或更多不同啟動子的序列元件，如MMLV LTR/LAT融合啟動子(Lokensgard等，1994)或含有LAT區域元件的啟動子(見上文)。
該異源基因可以編碼，例如，參與調控細胞分裂的蛋白質，如促有絲分裂生長因子，包括神經營養生長因子(如腦源神經營養因子、神經膠質細胞來源的神經營養因子、NGF、NT3、NT4和NT5、GAP43)、細胞因子(如α、β或γ-干擾素、包括IL-1、IL-2的白介素、腫瘤壞死因子、或胰島素樣生長因子Ⅰ或Ⅱ)、蛋白激酶(如MAP激酶)、蛋白磷酸酶和以上任何的細胞受體。該異源基因也可以編碼參與細胞代謝途徑的酶，如參與氨基酸生物合成或降解的酶(如酪氨酸羥化酶)、嘌呤或嘧啶生物合成或降解的酶、以及神經遞質(如多巴胺)生物合成或降解的酶、或參與這些途徑的調控的蛋白質，如蛋白激酶和磷酸酶。該異源基因也可以編碼參與它們的調控的轉錄因子或蛋白，如Brn3家族的成員(包括Brn3a、Brn3b和Brn3c)或Rb家族的pocket蛋白如Rb或p107、膜蛋白(如視紫質)、結構蛋白(如肌營養不良蛋白)或熱激蛋白如hsp27、hsp65、hsp70和hsp90。
優選的，該異源基因編碼肌一種具有治療作用的多肽，或者其功能或功能的缺乏對疾病的過程可能較重要的多肽。例如，在所描述蛋白質中，酪氨酸羥化酶可以被用于治療帕金森氏病，視紫質可以被用于治療眼部病癥，營養不良蛋白可以被用于治療肌營養不良，以及熱激蛋白可以被用于治療與局部缺血(ischaemic)壓力相關的心臟和腦部紊亂。具有治療用途的多肽也可以包括細胞毒多肽如蓖麻毒素，或者可以將一種藥物前體轉化為一種細胞毒化合物的酶類，它們可以被用于，如病毒介導的酶藥物前體治療或基因介導的酶前體藥物治療的方法。在后一種情況下，理想的是確保該酶具有一個合適的信號序列以將其導向細胞表面，優選的是允許該酶暴露在細胞表面的外部、同時依然錨定在細胞表面的信號序列。合適的酶包括細菌硝基還原酶，如WO93/08288中所公布的大腸桿菌硝基還原酶或羧肽酶，尤其是如WO88/07378中所公布的羧肽酶CPG2。其它的酶可以參見EP-A-415731。合適的藥物前體包括氮芥藥物前體和其它化合物，如WO88/07378、WO89/10140、WO90/02729和WO93/08288(引入本文作為參考)中所描述的化合物。
異源基因也可以編碼作為疫苗使用的抗原性多肽。優選的是該抗原性多肽來自病原性生物，如細菌或病毒，或來自腫瘤。
異源基因也可以包括標記基因(如編碼β-半乳糖苷酶或綠色熒光蛋白)或其產物調節其它基因表達的基因(如，轉錄調節因子，包括以上所描述的tet相抑蛋白/VP16轉錄激活物融合蛋白)。
基因治療和其它治療上的應用有可能需要施用多個基因。多個基因的表達對于治療多種疾病可能是有利的-如使用多個神經營養因子。HSV是唯一合適的，因為其不具有其它病毒載體系統的限制性包裝能力。因此可以在其基因組內部容納多個異源基因。這可以通過，如，至少兩種途徑達到。例如，可以將不止一個的異源基因和相關控制序列導入一個特定的HSV株系內。也有可能采用遠離位于中心的LAT P2元件、以相反取向面對的成對啟動子(相同或不同的啟動子)，這些啟動子各自驅動如以上所描述的一個異源基因(相同或不同的異源基因)的表達。
F．施用本發明的突變單純皰疹病毒因此可以被用于將一種治療基因傳遞給需治療的患者或動物。使用本發明的突變單純皰疹病毒傳遞治療基因可以被用于治療如，帕金森氏病、神經系統的障礙、脊髓損傷、中風或惡性腫瘤，如神經膠質瘤。
一種施用基因治療的方法包括如以上所描述的，將治療基因插入到本發明的突變單純皰疹病毒的基因組內，然后將所得到的重組病毒與一種藥物可接受的載體或稀釋劑混合以生產一種藥物組合物。合適的載體和稀釋劑包括等滲的鹽溶液，如磷酸緩沖鹽水。可以配制組合物以進行非腸道、肌內、靜脈內、皮下、眼內或經皮給藥。
施用該藥物組合物的方式使得含有用于基因治療的治療基因的突變病毒可以在適當的區域摻入細胞。例如，當基因治療的目標是中樞或周圍神經系統時，該組合物可以被施用到突觸末梢所在的部位。一般通過立體定位接種將該藥物組合物施用到腦部。當該藥物組合物是被施用到眼部時，視網膜下注射是典型施用的技術。
所施用病毒的量的范圍為從104到1010pfu，優選的是從105到108pfu，更優選的是約106到107pfu。當注射時，典型的是將1至10微升的病毒在一種藥物可接受的合適的載體或稀釋劑內施用。
所描述的給藥路徑和劑量僅作為一種引導，因為熟練的醫師將很容易為任何特定的病人和病情確定給藥的最優路徑和劑量。
G．分析方法學本發明的突變單純皰疹病毒也可以被用于科學研究的方法中。因此，本發明的另一個方面涉及在體外或體內分析基因在哺乳動物細胞內的功能的方法。異源基因功能的確定可以通過以下方法進行，其包括(a)將所述異源基因導入本發明的突變的單純皰疹病毒內；(b)將所得到的病毒導入哺乳動物細胞系內；以及(c)確定所述異源基因在所述哺乳動物細胞系內表達的影響。
例如，該細胞系可能在細胞分裂中具有溫度敏感性缺陷。當一種含有本發明的異源基因的HSV株系被導入該缺陷型細胞系，并且該細胞系在限制性溫度下生長時，熟練技術人員將很容易能夠確定該異源基因是否能夠補償該細胞分裂上的缺陷。類似地，可以應用其它已知的技術來確定異源基因的表達是否能夠糾正哺乳動物細胞系內可見的突變表型。
本方法也可以被用于實現一種異源基因的系統性誘變，以確定由該基因編碼的蛋白質的哪一區域參與恢復該突變表型。
本方法也可以被用于動物，如攜有所謂的“基因敲除”的小鼠。使用本發明的一種突變HSV株系可以將野生型異源基因導入該動物體內，使用本領域已知的各種行為學、組織化學或生物化學的分析來確定對動物的影響。可選擇地，可以將一種突變的異源基因導入野生型或“基因敲除”動物體內以確定是否引發了與疾病相關的病理學。一個例子是使用編碼朊病毒的基因來引發嚙齒類動物中樞神經系統內的Creutzfeld-Jacob和其它朊病毒型疾病。其它疾病模式可以包括Alzheimer病、運動神經元疾病或帕金森氏病的模式。
因為由于HSV基因組的大容量，有可能將至少兩種不同的異源基因導入一個細胞內，所以也有可能研究兩個或更多個基因產物之間的相互作用。
因此，本發明中的方法尤其可以被用于疾病所涉及基因的功能研究。
本發明將結合以下實施例進行描述，其僅作為說明而非限制性。
一種允許ICP4缺失病毒生長的補償型細胞系(B4)的構建是通過將質粒pICP4 DNA和新霉素抗性編碼質粒pMamNeo(Invitrogen)共轉染到BHK細胞并篩選新霉素抗性克隆來完成的。質粒pICP4含有一段來自HSV1基因組的DdeⅠ-SphⅠ片段(核苷酸126,764-131,730),其包括ICP4編碼區域和啟動子,該片段被克隆于pSP72(Promega)的EcoRⅤ和SphⅠ位點之間。
選擇一種高度允許HSV1 ICP4缺失突變體(B4)生長的克隆以進行病毒生長。
參考實施例2-ICP27-補償細胞系(B130/2)的制備。
一種允許ICP27缺失的病毒生長并在補償序列和上述ICP27缺失病毒之間沒有重疊(因此阻止了在病毒生長過程中，通過同源重組對ICP27的修復)的補償型細胞系(B130/2)，其產生是通過將質粒pSG130BS(Sekulovich等。1988)DNA和新霉素抗性編碼質粒pMamNeo(Invitrogen)共轉染到BHK細胞內并篩選新霉素抗性克隆來完成的。選擇一種高度允許HSV-1 ICP27缺失突變體(B130/2)生長的克隆以允許病毒生長。PSG130BS攜有來自HSV1的BamHⅠ/SacⅠ片段(核苷酸)，其編碼完整的ICP27編碼序列和部分UL55。實施例1-含有LAT序列的啟動子被插入其中以缺失ICP27、但在內源性的LAT區域沒有缺失的HSV株系不能夠穩定復制。
(a)一段來自質粒pR20.5的表達盒，由以相反的背靠背取向排列并被一段HSV LAT區域序列(核苷酸118,866-120,219)隔開的一段RSV/lacZ/pA和一段CMV/GFP/pA序列組成，通過標準的方法使該盒與純化后的基因組HSV1株系17+的DNA同源重組以插入到ICP27基因座。該pR20.5表達盒首先以兩種取向被插入到一種含有ICP27側翼區域的質粒(pΔ27)內，從而允許兩種具有與在內源性LAT區域附近的LAT序列取向相同或相反的HSV LAT序列的病毒產生。缺失這些病毒的整個ICP27基因。當一段編碼SrfⅠ的寡核苷酸被插入到該pR20.5表達盒的任一邊時，該表達盒可以通過SrfⅠ從其pGEM5(Promega)質粒的骨架上被切除下來。RSV啟動子從pRc/RSV(Invitrogen)上被切除、lacZ/pA來自pCH110(Pharmacia)、CMV/pA來自pcDNA3(Invitrogen)以及GFP來自pEGFP-N1(Clontech)，使用它們構建質粒pR20.5。pΔ27的構建首先是通過將一段EcoRⅠ-NotⅠ片段從HSV1的限制性片段EcoRⅠB(核苷酸)上亞克隆下來，該過程包括將ICP27基因插入到pGEM5(Promega)以及通過用MluⅠ消化和重新連接(religation)缺失編碼ICP27(UL54)、UL55和UL56的MluⅠ片段。然后將該pR20.5表達盒插入目前唯一的MluⅠ位點。
在熒光顯微鏡下通過選擇表達綠色GFP的噬菌斑來對病毒進行噬斑純化，原種的制備使用了B130/2細胞(在上文參考實施例2中所描述)。所得到的病毒原種(17+/pR20.5/27和17+/pR20/27rev)無法對BHK細胞(其不能補償ICP27缺失)形成生產性感染。
病毒原種的制備是通過將單個的噬菌斑接種到六孔板的一個孔內，收集該原種并接種到新的六孔板內來完成的。然后將來自這些板的原種滴定到B130/2細胞內。在每個過程之后計算綠色(在熒光顯微鏡下)、藍色(在X-gal染色以檢測lacZ之后)和白色的噬菌斑數。對于17+/pR20.5/27,GFP基因在插入的LAT序列和內源性LAT區域之間，對于17+/pR20/27rev,lacZ基因在插入的和內源性LAT序列之間。結果在病毒原種的生長和滴定之后，發現不是所有的噬菌斑均表達GFP和lacZ基因。對于17-/pR20.5/27，發現雖然所有的噬菌斑均表達lacZ，但大約2％不再表達GFP。這暗示著在病毒生長的過程中，在插入的和內源性的LAT序列(此處它們的取向相同)之間存在同源重組，以相對較低的水平缺失了包括GFP在內的間插序列。至于17+/PR20/27rev，其中插入的和附近的內源性LAT序列以與對方相反的取向排列，大多數噬菌斑仍然表達lacZ和GFP。然而，大約有1％不表達lacZ或GFP或兩個插入基因均不表達，這暗示著當以與對方相反的取向排列時，在插入的和內源性的LAT序列之間發生了更為復雜的重組機制，其可以導致一個或另一個或更罕見地是兩個插入基因的缺失。
(b)如以上a)所述的將一段表達盒插入到pΔ27內，該盒由以下組分組成一段LAT序列(DdeⅠ-Ddel核苷酸118180至118768)，其后跟隨一段來自pJ4(Morgenstern和Land 1990)的MMLⅤ LTR啟動子，二者被一段大約700bp的質粒間隔序列(NdeⅠ-SmaⅠ來自pGEM3zf-Promega)，其后跟隨一段來自pCH110(Pharmacia)的lacZ/pA序列隔開。該質粒被稱為pR18/27。此處LAT序列以相同的取向在內源性LAT區域的附近。構建一種病毒(17+/pR18/27)，并如以上所描述的使用B130/2細胞培養原種，此處通過X-gal染色選擇lacZ的表達。X-gal染色之后再次滴定原種并計算藍色和白色ICP27缺失的噬菌斑數目。結果在如所描述的兩個連續傳代步驟之后，所得到的噬菌斑大約有3％不再表達lacZ。這暗示著插入的和內源性的LAT區域之間的同源重組已經導致了間插序列(包括lacZ基因)的缺失。實施例2-含有LAT序列的啟動子被插入到其中以缺失ICP4但不缺失內源性LAT區域的HSV株系不能夠穩定復制通過將pR20.5表達盒插入到ICP4側翼區域(質粒pΔ4)以產生質粒pR20.5/4，并與純化的基因組HSV1株系17+DNA同源重組到B4細胞內(如參考實施例1中所描述的構建)，以將pR20.5盒插入到HSV1的ICP4基因座，同時伴隨著ICP4的缺失。pΔ4由下列組分組成pSP72(Promega)中的ICP4側翼序列核苷酸123,459-126,774(Sau3a-Sau3a)和核苷酸131,730-134,792(SphⅠ-KpnⅠ)，二者被來自pSP72的XbaⅠ和SalⅠ位點分開。pICP4含有來自HSV1、被克隆至pSP72的EcoRⅤ和SphⅠ位點之間的DdeⅠ-SphⅠ片段(核苷酸126,764-131,730)。所得到的病毒(17+/pR20.5/4)不能夠在BHK細胞(其不補償ICP4的缺失)內生長。
如以前，病毒的原種的制備是通過將單個的噬菌斑接種到六孔板的單個孔內，收集該原種并接種到新的六孔板內來完成的。然后使用這些原種接種175cm2培養瓶。然后將來自平板和培養瓶的原種滴定到B4細胞內。在每個步驟之后再次計算綠色(在熒光顯微鏡下)、藍色(在X-gal染色以鑒定lacZ之后)和白色噬菌斑的數目。在17+/pR20.5/4中，插入的位點(ICP4)表示內源性的和插入的LAT序列取向相反，彼此通過GFP基因和ICP0、RL1和ORFP的編碼序列以及其它特征不太清楚的編碼序列分割開來。通過內源性的和插入的LAT序列之間的同源重組缺失ICP0(雖然可能不是RL1 OPFP或其它序列)將有望產生一種與含有IE1的病毒相比，具有明顯減弱的生長特征的病毒。結果對從六孔板中制備的病毒原種的滴度沒有顯示出可檢測到的lacZ或GFP基因的缺失。然而當將目前已經被連續傳代3次的原種從大培養瓶中滴定時，可以檢測到少量數目的噬菌斑不再表達一個或另一個或兩個基因，雖然決不使用高MOI感染來產生已經被滴定的原種。因此大約有0.5％的噬菌斑不再表達GFP或lacZ基因，以及大約有0.1％不再表達任一種基因。可以得出結論，即在ICP4兩種拷貝內的插入的LAT序列和存在于基因組的長重復區域的內源性LAT序列中的一個或另一個或兩個拷貝之間的同源重組，使得重組機制可以發生，其可以允許缺失一個或另一個或兩個插入的標記基因。實施例3-其中含有LAT序列的啟動子插入到US5的HSV株系可以穩定復制pR20.5表達盒插入到HSV1的US5基因座是通過將pR20.5盒插入到US5側翼區域(質粒pΔUS5)得到質粒pR20.5/pΔUS5，接著通過與純化過的基因組HSV1株系17+DNA同源重組到BHK細胞內以得到病毒株系17+/pR20.5/US5來完成的。質粒pΔUS5的制備是通過將HSV1中的一段包括US5編碼區域的BamHⅠ-EcoNⅠ片段(核苷酸136,289至131,328)，克隆到質粒pAT153內來完成的。pR20.5被插入到US5基因內的核苷137,945位上的唯一SacⅠ位點上。在17+/pR20.5/US5內，沒有必需基因被缺失，因此不需要補償缺失的細胞。
如以前，在噬菌斑純化之后，病毒原種的制備是通過將單個噬菌斑接種到六孔板的單個孔內，收集該原種并接種到新的六孔板內來完成的。連續傳代被持續五次，然后接種到175cm2培養瓶內。將來自培養板和培養瓶的原種滴定到BHK細胞并計算綠、藍和白色噬菌斑的數目。結果在所有情況下，從六孔板或175cm2培養瓶中滴定的病毒均不顯示可檢測得到的lacZ或GFP基因的缺失，即使是在連續傳代之后。
病毒原種的再次制備是通過將單個的噬菌斑接種到六孔板的一個孔內，收集該原種并接種到新的六孔板內來完成的。使用來自這些的原種接種175cm2培養瓶，然后將來自這二者的原種均滴定到B130/2細胞內。在每個步驟之后再次計算綠色(在熒光顯微鏡下)、藍色(在X-gal染色以檢測lacZ之后)和白色噬菌斑的數目。結果在病毒原種生長和滴定之后，當任一病毒原種被滴定出來以后，發現目前所有的噬菌斑均表達lacZ基因。這暗示著插入的和內源性的LAT序列之間的同源重組不再發生，因此允許了該病毒的穩定復制。
b)使用實施例2中的質粒pR20.5/4將pR20.5表達盒也插入到17+/p2-的ICP4基因座上。所得到的病毒(17-/P2-/pR20.5/4)不能夠在BHK細胞(其不補償ICP4缺失)內生長。
如以前，病毒原種的制備是通過將單個的噬菌斑接種到六孔板的單個孔內，收集該原種并接種到新的六孔板內來完成的。連續傳代持續五次，然后接種175cm2培養瓶。來自培養板和培養瓶的原種均如以前一樣滴定到B4/27/4細胞內并計算綠、藍和白色噬菌斑的數目。結果從初始的六孔板內制備的病毒原種的滴度沒有顯示出可檢測的lacZ或GFP基因的缺失。當滴定在接種到大培養瓶之前已經被連續傳代超出五次的原種時，僅可以檢測到表達GFP及lacZ的噬菌斑，沒有觀察到僅表達一種或另一種或兩種均不表達的噬菌斑。這暗示著先前缺失與插入到pR20.5的序列相應的內源性LAT序列，已經再次提供了一種比內源性LAT序列在其中沒有首先被缺失的病毒的穩定性更大的病毒，因此允許了該病毒的穩定復制。
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權利要求
1.一種單純皰疹病毒(HSV)包括(1)一段插入到該HSV的一個必需基因內的HSV LAT序列；以及(ⅱ)在該HSV的內源性LAT區域上的一個缺失。
2.根據權利要求1的病毒，其中的必需基因是一種必需即早期(IE)基因。
3．根據權利要求2的病毒，其中的必需基因是ICP27。
4．根據權利要求2的病毒，其中的必需基因是ICP4。
5．根據以上權利要求中的任一項的病毒，其中的缺失包括存在于插入的HSV LAT序列內的至少部分序列。
6.根據以上權利要求中的任一項的病毒，其中的缺失包括存在于插入的HSV LAT序列內的至少50％序列。
7.根據以上權利要求中的任一項的病毒，其中的缺失包括存在于插入的HSV LAT序列內的至少75％序列。
8.根據以上權利要求中的任一項的病毒，其中的缺失包括存在于插入的HSV LAT序列內的至少全部序列。
9.根據以上權利要求中的任一項的病毒，其中的LAT序列實質上由HSV1株系17+的核苷118866到120219和/或核苷酸117159到118865(GenBank HE1CG)，或者是另一種HSV株系的同源序列組成。
10.根據以上權利要求中的任一項的病毒，其中的必需基因包括缺失。
11．根據以上權利要求中的任一項的病毒，其選自HSV1株系、HSV2株系或它們的衍生物。
12．根據權利要求11的病毒，其是HSV1株系。
13.根據以上權利要求中的任一項的病毒，其攜有至少一個異源基因。
14.根據權利要求13的病毒，其中所述異源基因與一段插入的HSV LAT序列可操作連接。
15．根據權利要求13或14的病毒，其中所述異源基因與一段允許上述異源基因在哺乳動物細胞內表達的調控序列可操作連接。
16．根據權利要求15的病毒，其中所述哺乳動物細胞是哺乳動物的中樞或周圍神經系統的細胞。
17．根據權利要求15的病毒，其中所述哺乳動物細胞是哺乳動物的眼睛、心臟或骨骼肌的細胞。
18．根據權利要求13到17中任一項的病毒，其中所述異源基因編碼具有治療作用的多肽。
19．根據權利要求18的病毒，其中所述基因編碼的多肽具有細胞毒性。
20．根據權利要求18的病毒，其中所述基因編碼的多肽可以將藥物前體轉變為具細胞毒性的化合物。
21.根據權利要求15到18中的任一項的病毒，其中的異源基因選自編碼參與細胞分裂調控的蛋白質、參與代謝途徑的酶、轉錄因子和熱激蛋白的基因。
22．根據權利要求13到21中的任一項的病毒，可用于將上述異源基因傳遞到哺乳動物細胞內。
23．根據權利要求13到22中的任一項的病毒，可用于治療人或動物體的方法中。
24．根據權利要求23的病毒，可用于治療哺乳動物神經系統的紊亂或損傷。
25．根據權利要求13到22中任一項的單純皰疹病毒用于制備治療人或動物體之藥物的用途。
26．根據權利要求25中所述的單純皰疹病毒在治療哺乳動物神經系統的紊亂或損傷中的用途。
27．藥物組合物，其含有根據權利要求13到22中的任一項的HSV株系，和藥物可接受的載體或稀釋劑。
28．一種用于研究異源基因在哺乳動物細胞內的功能的方法，該方法包括(a)將所述異源基因導入根據權利要求1到12中的任一項的單純皰疹病毒內；(b)將所得到的單純皰疹病毒導入所述哺乳動物細胞內；以及(c)確定所述異源基因在所述哺乳動物細胞內表達的影響。
29．根據權利要求28的方法，其中所述異源基因是涉及引發疾病的野生型或突變型基因。
30．根據權利要求28或29的方法，其中所述哺乳動物細胞是功能障礙性的，所述異源基因為野生型，以及所述異源基因的表達效果是通過分析細胞功能進行確定的。
31．根據權利要求28或29的方法，其中所述哺乳動物細胞具有一個或多個被突變失活的內源性基因。
32．用于產生根據權利要求1中的單純皰疹病毒的方法，上述方法包括(ⅰ)將該HSV LAT序列插入該病毒的必需IE基因內；以及(ⅱ)缺失該病毒的至少部分LAT區域。
33．治療哺乳動物神經系統紊亂或損傷的方法，包括對需要治療的病人施用有效劑量的根據權利要求10到19中的任一項的病毒。
全文摘要
一種單純皰疹病毒(HSV),其包括:(ⅰ)一段插入到HSV必需基因內的HSV LAT序列;以及(ⅱ)在該HSV株系的內源性LAT區域內的缺失。本發明中的HSV可被用于治療哺乳動物神經系統的紊亂或損傷。
文檔編號A61K35/76GK1310765SQ99808928
公開日2001年8月29日 申請日期1999年5月20日 優先權日1998年5月20日
發明者R·S·科芬, D·S·拉奇曼 申請人:拜奧維克斯有限公司