專利名稱：一種適用于赤蘚紅色素的人工抗原的合成方法
技術領域：
一種適用于赤蘚紅色素的人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術領域。
背景技術：
赤蘚紅，英文名稱為=Erythrosine, ETS，其化學名稱為2_(2，4，5，7_四碘_6_羥 基-3-氧咕噸-9-基)苯甲酸二鈉鹽，也叫四碘熒光素B，CAS號568-63-8，分子式是 C2(lH6I4Na205。赤蘚紅是人工合成色素中的一種，色澤鮮艷，常用于食品加工制品和飲料中， 以提高其感官性。食品著色劑可分為天然色素和人工合成色素兩大類，因人工合成色素具 有成本低廉、色調多樣、色澤亮艷和著色力強等特點，故在食品加工業中被廣泛采用。由于 合成色素以苯、甲苯、萘等化工產品為原料，經過磺化、硝化、鹵化、偶氮化等一系列有機反 應制成合成色素。因此，食用合成色素多為含有R-N=N-Rc鍵、苯環或氧雜蒽結構化合物， 它們對人體存在一定的不安全性或者產生有害作用，過多食用會危害人體健康。毒理學研 究發現，某些合成色素有慢性毒性或致癌性，故近年各國都嚴格控制其使用范圍和使用量。 因此食品添加劑已成為食品安全問題的一個關注焦點。2008年4月，英國食品標準局擬議 禁止在食品內添加6種人工合成色素日落黃、檸檬黃、胭脂紅、誘惑紅、喹啉黃、偶氮玉紅， 因其能夠引起多種兒童多動癥的癥狀，比如過度活躍、注意力不集中等。歐盟食品安全局也 對此高度重視，并開展相關物質的風險評估研究。目前赤蘚紅的毒理學研究表明赤蘚紅對 小鼠的生殖和神經行為有輕微影響，并且赤蘚紅能對雄留酮和對硝基苯酚的葡萄糖苷酸化 和糖脂化起到抑制作用，此外還會降低肝細胞中的葡萄糖異生作用和尿素生成作用。合成 色素有嚴格的控制使用范圍和最大使用量。并鑒于其潛在嚴重危害性，因此食品中合成色 素的準確測定具有重要意義。現今赤蘚紅主要的分析方法有高效液相色譜法、毛細管電泳 法、LC-MS、LC-MS/MS、GC/MS、陰離子交換色譜法，示波極譜法及薄層色譜法等。現有的儀器 檢測法雖然有靈敏度高、適用范圍廣等優點，但是樣品前處理復雜，所需的儀器昂貴，成本 高，檢測時間長，因此有必要研究特異性強，靈敏度高同時價格低廉，能快速簡便的免疫檢 測技術。這就需要合成能產生簇特異性抗體的免疫原。目前為止，國內外尚沒有針對赤蘚 紅結構殘留的免疫檢測方法的報道，為此設計合成了以赤蘚紅的中間體熒光素為半抗原的 用于赤蘚紅人工合成色素檢測的完全抗原。

發明內容
本發明的目的是提供一種適用于人工合成食品色素赤蘚紅的免疫原合成方法。所 制備的產品用于赤蘚紅結構的免疫分析方法研究，為今后人們的研究提供了更好的必需的 人工抗原。本發明的技術方案一種赤蘚紅的中間體熒光素FLS人工抗原的合成方法，以衍 生化后的赤蘚紅中間體熒光素FLS為半抗原，用活性酯法將其與載體蛋白牛血清白蛋白 BSA偶聯，用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定偶聯物的偶聯比。步驟為
(1)人工抗原的合成投料配比為熒光素FLS N-羥基硫代琥珀酰亞胺碳二亞胺牛血清白蛋白的摩爾比控制為60 68 90 1 ；熒光素FLS溶于含二甲基吡啶的戊二酸 酐的無水乙醇和吡啶混合溶液中，75°C攪拌24h后用真空旋轉蒸發提純，再加N，N-二甲基 甲酰胺DMF溶劑溶解后，加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺和碳二亞胺攪拌反應8h，為A液；牛 血清白蛋白溶于0. 01M、pH7. 4的磷酸鹽緩沖溶液中，為B液；將A液逐滴加入到B液中，室 溫下攪拌反應6h，離心取上清液，獲得熒光素FLS-BSA偶聯物混合液，即為適用于赤蘚紅的 人工抗原混合液；
透析袋前處理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水沖洗 3min，保存在4°C去離子水中備用；
將人工抗原混合液移入透析袋中，用每次2L的0. OlM的pH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液透 析，透析2次，再用每次2L的去離子水透析，透析2次，共透析3天；最后使用凍干法將透析 袋中的液體制成粉末，獲得熒光素FLS-BSA偶聯物，即為適用于赤蘚紅的人工抗原。(2)人工抗原的鑒定熒光素FLS-BSA偶聯物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定其偶 聯比。偶聯比測定是估算偶聯物中被偶聯的兩種分子的比率(偶聯比率)的方法，雖 然測定方法種類很多，但都是依據檢測偶聯物中被偶聯的兩種分子含量(或相對含量)的 原理建立起來的.凝膠電泳法是依據合成的人工抗原的分子量來鑒定合成的人工抗原。 SDS-聚丙烯酰胺電泳利用遷移率只與分子量有關，而與所帶電荷、分子形狀無關，可以利用 SDS-聚丙烯酰胺電泳來確定人工抗原的分子量從而確定偶聯比。本發明采用10%的分離 膠，5%的壓縮膠，對牛血清白蛋白BSA、偶聯物FLS-BSA進行電泳鑒定。利用FR980生物電 泳凝膠成像系統軟件得出偶聯比r 19。即人工抗原的形式完全符合免疫要求。偶聯物蛋白濃度測定配制濃度為0，40，60，80，100，120，160，200 μ g · mL—1的牛 血清白蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍染色液，立即混勻，30°C水浴溫熱5min，每個濃 度做平行樣.在595nm處測吸光值，繪制牛血清白蛋白濃度與吸光值的關系曲線。將抗原 溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定熒光素-牛血清白蛋白抗原溶液的吸光值，從曲線上 得到抗原溶液的相應的蛋白濃度。本實驗計算得抗原溶液的蛋白濃度為19. 60mg · mL—1。本發明的有益效果本發明成功合成了熒光素FLS-BSA偶聯物，即為適用于赤蘚 紅的人工抗原。合成步驟簡潔，有效，完全可用于免疫分析當中，為以后人們的研究提供了 方便的途徑，此方法產生的多克隆抗體可以滿足國內對其研究的需要。


圖1熒光素FLS-BSA的電泳圖。圖2利用間接ELISA方法測得的赤蘚紅ETS標準抑制曲線。
具體實施例方式實施例1
(1)人工抗原的制備
取 200mg (0. 60187mmol )熒光素 FLS 和 1. 140g (lOmmol )戊二酸酐，以及 112mg (1 mmol ) 二甲基吡啶DMAP到圓底燒瓶里，然后再加入9mL無水乙醇和ImL無水吡啶，最后放 入75°C水浴反應Mh。產物溶液用真空旋轉蒸發提純，再加入DMF溶液溶解以備下一步來做反應。取0.5mL含有20mg (0.06019 mmol )熒光素FLS衍生物的N，N-二甲基甲酰胺DMF 溶液到棕色小瓶中，再加入15. 52mg (0. 06807 mmol )N-羥基硫代琥珀酰亞胺Sulf-NHS和 17. 32mg (0. 09033 mmol )碳化二亞胺 EDC，室溫反應 8h，為 A 液。將 65mg (0. OOlmmol ) 牛血清白蛋白BSA溶解到0. 01M、pH7. 4的磷酸鹽緩沖液PBS中，為B液。然后將A液緩慢 滴加到B液中，室溫反應6h，離心去掉沉淀，取上清液即得人工抗原混合液。透析袋前處理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水沖洗 3min,保存在4°C去離子水中備用。將人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0. OlM的PBS溶液和2X2L的去離 子水透析3天。最后使用凍干法將透析袋中的液體制成粉末，獲得熒光素FLS-BSA偶聯物， 即為適用于赤蘚紅的人工抗原。(2)熒光素人工抗原的鑒定
偶聯比測定是估算偶聯物中被偶聯的兩種分子的比率(偶聯比率)的方法，雖然測定 方法種類很多，但都是依據檢測偶聯物中被偶聯的兩種分子含量(或相對含量)的原理建立 起來的.凝膠電泳法是依據合成的人工抗原的分子量來鑒定合成的人工抗原。SDS-聚丙烯 酰胺電泳利用遷移率只與分子量有關，而與所帶電荷、分子形狀無關，可以利用SDS-聚丙 烯酰胺電泳來確定人工抗原的分子量從而確定偶聯比。本實驗采用10%的分離膠，5%的壓 縮膠，對牛血清蛋白BSA、FLS-BSA偶聯物進行電泳鑒定。利用FR980生物電泳凝膠成像系 統軟件得出偶聯比r 19。即人工抗原的形式完全符合免疫要求。偶聯物蛋白濃度測定配制濃度為0，40，60，80，100，120，160，200 μ g · mL—1的牛 血清白蛋白溶液1.5mL，加入5mL考馬斯亮藍染色液，立即混勻，30°C水浴溫熱5min，每個濃 度做平行樣.在595nm處測吸光值，繪制牛血清白蛋白濃度與吸光值的關系曲線。將抗原 溶液按一定比例稀釋，在595nm處測定熒光素-牛血清白蛋白抗原溶液的吸光值，從曲線上 得到抗原溶液的相應的蛋白濃度。本實驗計算得抗原溶液的蛋白濃度為19. 60mg · mL—1。試驗結果表明我們制得的熒光素FLS-BSA偶聯物產生了針對赤蘚紅是非常好的 抗體，相關實驗結果數據見表1和圖2。表1不同兔子血清的抗體效價
權利要求
1. 一種適用于赤蘚紅色素的人工抗原的合成方法，其特征是以熒光素FLS為半抗原， 用活性酯法將其與載體蛋白牛血清白蛋白BSA偶聯，用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定偶聯物的 偶聯比；步驟為(1)人工抗原的合成投料配比為熒光素FLS N-羥基硫代琥珀酰亞胺碳二亞胺 牛血清白蛋白的摩爾比控制為60 68 90 1 ；熒光素FLS溶于含二甲基吡啶的戊二酸 酐的無水乙醇和吡啶混合溶液中，75°C攪拌24h后用真空旋轉蒸發提純，再加N，N-二甲基 甲酰胺DMF溶劑溶解后，加入N-羥基硫代琥珀酰亞胺和碳二亞胺攪拌反應8h，為A液；牛 血清白蛋白溶于0. 01M、pH7. 4的PBS緩沖液中，為B液；將A液逐滴加入到B液中，室溫下 攪拌反應6h，離心取上清液，獲得熒光素FLS-BSA偶聯物混合液，即為適用于赤蘚紅的人工 抗原混合液；透析袋前處理取IOcm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60°C的去離子水沖洗 3min，保存在4°C去離子水中備用；將人工抗原混合液移入透析袋中，用每次2L的0. OlM的pH 7. 4的磷酸鹽緩沖溶液透 析，透析2次，再用每次2L的去離子水透析，透析2次，共透析3天；最后使用凍干法將透析 袋中的液體制成粉末，獲得熒光素FLS-BSA偶聯物，即為適用于赤蘚紅的人工抗原；(2)人工抗原的鑒定熒光素FLS-BSA偶聯物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定其偶聯比。
全文摘要
一種適用于赤蘚紅色素的人工抗原的合成方法，屬于生物化工技術領域。本發明以熒光素FLS為半抗原，用活性酯法將其與載體蛋白牛血清白蛋白BSA偶聯，即得赤蘚紅的人工抗原熒光素FLS-牛血清白蛋白偶聯物；用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定偶聯物的偶聯比。本發明成功合成了熒光素FLS-牛血清白蛋白偶聯物，即是適用于赤蘚紅色素的人工抗原。本發明合成步驟簡潔，有效，完全可用于免疫分析中，為以后人們的研究提供了必需的人工抗原，可以滿足國內對其研究的需要。
文檔編號C07K19/00GK102120774SQ201010600940
公開日2011年7月13日 申請日期2010年12月23日 優先權日2010年12月23日
發明者劉麗強, 匡華, 宋珊珊, 李灼坤, 王利兵, 胥傳來, 邢常瑞 申請人:江南大學